常见细胞实验流程.docx
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常见细胞实验流程
常见细胞实验流程
实验前准备
根据自己实验的情况提前预定超净台
进入细胞室之前必须穿鞋套,戴手套
将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min
高压灭菌操作
1.将所需灭菌的枪头,EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中,并用报纸将枪头盒包好。
2.将仪器放入灭菌锅之前,首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈,若没有超过则需加水。
3.检测水位之后,将包好的器材放入锅内,盖上锅盖并拧紧螺丝。
4.插上电源,先将电压调至250V,目的在于排尽锅内的空气,(当排气阀有白气冒出时,说明空气已排尽)空气排尽后,关闭排气阀。
5.关闭排气阀后指针上升,当指针竖直时,将电压调至125V,保持锅内压力的稳定。
6.开始计时,灭菌30min。
结束时关闭电源,等至指针慢慢降下即可。
7.拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干,2天后即可拿出。
(组织内)蛋白质提取过程
1.对癌组织和癌旁正常组织进行称重,记录数值。
2.根据RIPA裂解液Ⅲ说明书(每100mg组织中加入1ml溶液A,1ul溶液B,5ul溶液C)按照组织块得大小配好ABC混合液。
3.将组织块加入匀浆器中,并加入相应量得ABC混合液,冰上静置5-10min,开始研磨。
4.将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中,12000rpm/5min.
5.离心结束后,收集上清液,弃去沉淀,上清即为所要的蛋白。
蛋白质浓度测定
1、取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可
2、配制BCA标准蛋白液:
浓度原液体积去离子水体积
A管:
2000ug/ul30ul0ul
B管:
1500ug/ul37.5ul12.5ul
C管:
1000ug/ul25ul25ul
D管:
750ug/ul18.75ul31.25ul
E管:
500ug/ul12.5ul37.5ul
F管:
125ug/ul3.125ul46.875ul
G管:
25ug/ul0.625ul49.375ul
H管:
00ul50ul
取8个EP管,分别标上以上字母,并按上表加入相应的原液蛋白和去离子水
先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液(根据实验计算所需要用孔的个数加入底物液)
加完后,将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列上的字母标记依次加入
之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品(每个样品应重复2次)
加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好,以防止蛋白浓度发生变化,之后将板放入保温箱中静置30min
30min后将96孔板拿出放入测量仪器内(应按照仪器使用说明进行操作)
数据测完后另建文件夹,保存数据,之后插入尤盘拷取数据
在获得的数据结果中,根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线:
y=ax+b(计算机上操作)
将测得的蛋白样品的OD值带入公式,即可求出蛋白样品的浓度
若实验有实验组和对照组,应将两组的蛋白浓度标准化,即是两组的蛋白浓度相同(相同浓度下的两组实验才具可比性)
将浓度标准化的样品蛋白与loadingbuffer混匀至100ul(混合液中loadingbuffer应为1X的,但实验室的一般为5X),稀释方法:
取20ul5Xloadingbuffer+80ul样品蛋白混匀即可
在加样做westernblot之前,蛋白样品需变性:
将与loadingbuffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变性10min(EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开)
(组织内)RNA提取过程
1.将组织放入匀浆器中,加入1ml的Trizol,冰上静置10min,进行研磨。
2.将匀浆好的上清转移至1.5mlEP管中,进行离心12000rpm/5min.
3.离心后收集上清液于新的EP管中,加入200ul氯仿,剧烈摇匀后静置5min,然后12000rpm/5min.
4.离心后取上清于另一新的EP管中,取液时不要取到中间层的蛋白。
之后按1:
1的比例加入异丙醇,摇匀后静置15min,进行离心12000rpm/10min。
5.离心后倒掉上清(可看到白色RNA沉淀),加入1ml75%乙醇DEPC水溶液温和震荡,悬浮沉淀,3000rpm/5min.
6.倒掉上清,在滤纸上空干。
然后加入20ulDEPC水溶解沉淀,并吹打均匀。
(如果RNA量较多,可相应的加更多的DEPC水,40ul甚至60ul)
7.测定RNA浓度,取1ulRNA+99ulDEPC水于EP管中(相当于稀释100倍),另取一EP管放100ul的DEPC水用于定标。
定标后倒掉,用去离子水冲洗比色皿,然后测定RNAOD值和浓度,记下数据。
8.RNA电泳(用于检测提取的RNA是否已降解)
配胶(1%的胶):
取0.2g琼脂糖+20mlTAE+1ulEB
制胶时,应让液体沸腾3次,冷却后加入EB混匀(每20ml加1ulEB),胶制好后倒入板中凝固,并垂直地插入梳子,静置30min后拔下梳子(可提前用梳子划动下胶,使得胶更均匀)。
取1ul的Loadingbuffer和样本RNA混匀,加样
正确的电泳结果应有3条带:
28S、18S、5S。
28S亮度应为18S亮度的2倍,5S条带越宽越代表RNA降解越多。
如果加样孔内有残留代表蛋白污染,如果离加样孔很近的地方有条带代表DNA污染。
细胞冻存
首先向培养瓶内加入胰酶(1ml)消化细胞
显微镜下观察细胞形态,当细胞变圆脱落时,即可用适量培养基中止消化,之后将细胞液吸入15ml的管内(动作要快,防止胰酶损害细胞)
将管内1/3的细胞液放回培养瓶继续培养(剩余的细胞液平均冻存两管)
离心剩余的细胞液,1200rpm,5min(用等量的PBS配平)
离心后弃上清,得白色沉淀。
可在试管台上轻轻来回划动试管,使得沉淀松动更易于悬浮
用配好的3ml冻存液悬浮沉淀,吹打混匀,使得细胞为单个细胞
分别取1.5ml放入两冻存管内,在冻存管上做好标记:
细胞类型,代数,日期等
标记好后4°冰箱放置30min(切勿超过30min),计时
之后-20°冰箱中放置30min
最后放入-80°冰箱内可保存半年。
若半年后还没有使用则需要将细胞拿出来复苏,长满后再冻存起来。
冻存液的配制方法:
血清(20%)+DMSO(10%,超净台上锡纸包裹的)+培养基(70%)
例如配3ml冻存液:
血清=600ul;DMSO=300ul;培养基=2100ul
细胞复苏
将实验所需要的仪器提前放入超净台内紫外灭菌15-20min
在整个复苏过程中冻存的细胞都应保持在37°水浴中
烧杯中放入37°水,将从冰箱内拿出的细胞用镊子夹住放入烧杯内摇晃使细胞慢慢融化
细胞融化后,用酒精浸湿的纸擦干冻存管
之后在超净台内将细胞液吸取到放有适量(例10ml)PBS的15ml管内吹打均匀(在取细胞之前提前在管内倒入PBS)
1200rpm,5min离心,离心后弃上清得沉淀
将得到的细胞沉淀用适量的培养基悬浮,并吹打均匀,使细胞单个存在
吹打均匀后,用吸管将细胞液吸入培养瓶中(大/小培养瓶根据自己的实验而定)
最后向培养瓶内加入适量的培养基
显微镜下观察细胞情况
最后将培养瓶盖子拧松,放入37°培养箱培养
WesternBlotting
Westernblot实验过程中所需要配制的试剂:
1XTBST:
(用于洗膜)
100ml10XTBS+900ml去离子水+1mlTween20
5%牛奶:
取5g牛奶溶于1000ml1XTBST中混匀
1XRunning:
(用于跑电泳)
10XRunning100ml溶于900ml去离子水中
1Xtransfer:
(用于转膜)
10XTransfer100ml+100ml无水甲醇+800ml去离子水
一抗:
用5%牛奶将一抗稀释2000倍(稀释倍数根据自己实验而定),若抗体由甘油保存,稀释一抗应取所计算体积的2倍。
二抗:
用5%牛奶将二抗稀释10000倍(牛奶封闭性更好)
具体操作流程:
1.清洗玻璃板
一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都要洗净,之后先用自来水冲洗干净,再用去离子水冲洗干净,立在桌面上晾干。
2.配胶(区别于RNA电泳胶)
玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
先按照10%Gel(10ml)比例配下层的分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃缓慢放出,待胶面升到绿带中间线高度即可,然后加入100ml异丙醇封闭
静置等待胶凝固,(若试管内剩余的胶凝固代表玻璃板内的胶已经凝固了)凝固后倒掉异丙醇,用去离子水冲洗干净,并用吸水纸将水吸干,并避免刮破胶
再按照5ml的比例配上层的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀后即可灌胶。
将配好的胶灌满剩余的空间,之后垂直缓慢地将梳子插入浓缩胶中,避免产生气泡
胶凝固后即配胶结束
配胶注意事项:
若配好的胶不立即使用,可以保存在4度冰箱内,但保存时间不宜过长(用卫生纸包裹玻璃板,浸湿卫生纸,放入一次性塑料手套内即可,此时不要拔下梳子)
蛋白胶分为两层,上层为浓缩胶,下层为分离胶。
按照10%Gel的方法进行配胶。
注意:
选择玻璃板时要看清玻璃板上的大小标记,一般用10ml的。
玻璃板一定要用去离子水洗干净,之后室温晾干。
浓缩胶和分离胶配制所用Tris-Hcl的PH值是不同的,分别为7.8和6.8
3.跑电泳与上样
配制(1000ml)1XRunning电泳缓冲液:
(实验室现有的是10X)
取100ml10XRunning缓冲液溶于900ml去离子水中即可得到1XRunning缓冲液
将配好的胶板放在电泳槽内,注意正负电极的准确连接,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出
倒入配好的电泳缓冲液,若使用的是两块胶,加入的电泳液液面应超过“2Gel”字符线(电泳液也要灌满玻璃板)
加蛋白上样量:
测完蛋白含量后,计算含20-50ug蛋白(根据自己的实验需要进行选择,没有固定的量)的溶液体积即为上样量。
用10ul枪头进行加样,将枪头插入加样孔缓慢加入样品,加样过快的话容易使样品冲出加样孔(注意同一实验和对照组所加的上样量应该相等,这样才具有可比性),同时加入2-3ulMarker作为条带分子量大小的对照
加样完毕后,盖上电泳槽盖,连接电源,先调电压至120V,按start开始跑电泳
当样品被压成同一水平的线时,可以降低电压至100V或80V左右,电泳至样品内的溴酚蓝刚跑出即可终止电泳,关闭电源,进行转膜
4.转膜
转膜前先用镊子捏住两张硝酸纤维素膜的一边浸泡在无水甲醇中
配制1Xtransfer(转膜缓冲液):
取10xtransfer100ml+100ml无水甲醇+100ml去离子水混匀即可
将转膜液倒入搪瓷盘内,并放入转膜所需的夹子(夹子具有黑白两面)、两块海绵垫(海面上带有滤纸)、小绿板和浸过的膜
将夹子打开使黑的一面位于底部保持水平,在其上垫一张海绵垫,用小绿板来回擀几次排除其内的气泡。
要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,除去小玻璃板后,将浓缩胶用小绿板轻轻刮取,要避免不要把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用小绿板擀去气泡。
之后将另一海绵垫平铺在胶上,用手压住,并用小绿板赶走气泡,注意动作要轻柔,避免胶与膜发生错位。
气泡赶净后就可以合起夹子(整个过程都要在转膜液中进行)。
另外一块胶按照形同的过程进行操作
之后将夹子放入转移槽中,要使黑色的面对槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。
由于在转膜的过程中会产生热量,所以将整个转膜槽放入装有冰块的桶内进行。
插上电源,调电压至80V,转膜2h(转膜时电极方向注意是膜正胶负)
转膜结束后,可看到膜上有明显的Marker条带,用丽春红染色液让膜显色,之后可以看到膜上蛋白的条带
将膜放入一平皿内于摇床上脱色,放入1xTBST洗三次,每次10min。
若事先知道目的蛋白的分子量,可以用保鲜膜将膜包裹,之后将膜修剪
脱色之后,用牛奶对膜过夜封闭或封闭1h(4度冰箱内的摇床上过夜)
封闭后,用TBST洗3次,每次10min
加一抗2h(若牛奶封闭1h,可以加一抗过夜)
用1xTBST洗3次,每次10min
加二抗,封闭1h
用1xTBST洗3次,每次10min
5、曝光成像(曝光过程要在黑暗中进行,因为X-光片不能见光)
最后一次冲洗膜时不要将TBST倒掉,以防止曝光过程中膜会变干
取A和B两种显色液500ul分别于两个EP管中
将曝光所需要的仪器:
红外灯、保鲜膜、胶带、黑色板提前准备好,放在暗房的桌上。
用胶带将适宜大小的保鲜膜贴在黑色板上,先将膜放在塑料片上,混匀A,B显色液后滴加到膜上,观察膜是否发出荧光(发出荧光代表膜上有目的蛋白)
当膜发出荧光时,将膜转移至黑板上的保鲜膜上,用膜盖好,在其上放一张X-光片(根据膜的大小将光片裁剪成适宜的大小,以节约利用),压紧黑色板几分钟(根据膜发出的荧光强度定,荧光强的话一会即可,弱的话可多压几分钟)
压好后,将X-光片迅速放入显影液中显影,显影时间一般为1~2min,待出现明显条带后,即刻终止显影。
显影结束后,马上把光片放入定影液中,以胶片透明为止
最后将光片放入自来水中清除残留的定影液,之后室温下晾干。
注意:
显影和定影需移动胶片时,尽量拿胶片一角,手指甲不要划伤胶片,否则会对结果产生影响。
显色液A,B和X-光片都要避光
6、凝胶图像分析:
将胶片进行扫描成像,保存图形。
细胞计数
实验原理:
当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作:
1、先用1ml胰酶消化细胞,当显微镜下细胞变圆时即可用培养基中止
2、取10ul细胞悬液于一1.5mlEP管内,之后加10ul蓝色显色液混匀
3、将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板。
4、将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。
5、计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。
然后按公式计算:
(细胞悬液的细胞数)/mL=(4个大格子细胞数/4)×2×104
说明:
公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1:
1稀释。
公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:
1.0mm(长)×1.0mm(宽)×0.1mm(高)=0.1mm3而1mL=1000mm3
细胞计数要点:
要求细胞悬液中的细胞分散良好,否则影响计数准确性。
取样计数前,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确。
数细胞的原则是只数完整的细胞,若细胞聚集成团时,只按照1个细胞计算。
如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。
操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,否则要重新计数。
初学者易犯的错误:
计数前未将待测悬液吹打均匀。
滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
滴入悬液时的量太多,至使细胞悬液流入旁边的槽中。
细胞培养(换液与传代)
细胞换液:
(当培养瓶内的培养基由红色变为黄色时应该换液)
脚穿鞋套,手带手套方可进入细胞房
将一次性吸管、试管、签字笔等实验所需的器材提前放入超净工作台内UV照射灭菌10min左右
同时将配制好的培养基(1640)放入37度水浴锅内
照射结束后,关闭紫外线,打开吹风橱
从37度常温培养箱内拿出,用酒精浸湿的卫生纸擦拭培养瓶口一周,之后放入超净工作台内
拧开培养瓶盖子,倒掉培养液,之后倒入适量的PBS冲洗并去除培养瓶内的残留代谢物,之后倒掉
用一次性吸管吸取适量培养基(培养基液面没过瓶底部一点即可,大约4-5ml)加入培养瓶内,注意加培养基时不要对着培养瓶的底部吹打,防止将细胞吹落
加完培养基后,拧紧盖子,放在显微镜下观察,之后再用酒精擦拭瓶口
将培养瓶放入培养箱之前拧松瓶盖,之后放入培养箱内培养
对于培养的细胞,一天看一次即可,不要经常性的挪动细胞从而影响细胞的贴壁生长
实验结束后应做好卫生清洁工作,用酒精擦拭干净工作台并打开紫外照射
细胞传代
(当培养瓶内的细胞长满而又进行冻存时需要将细胞传瓶)
准备实验如前所述-----另外也将胰酶放入水浴锅内
将培养瓶放如超净台内,倒掉培养基,加入适量的PBS冲洗一次
加入1ml胰酶摇匀,在显微镜下观察细胞的形态,当细胞变圆时应立即用适量培养基终止消化,之后可以用吸管吹打未脱落的细胞
将细胞液用吸管吸至15ml管内,1000rpm离心5min
弃上清,得沉淀
将沉淀在板上来回的划动使沉淀松动,之后加入培养基悬浮沉淀更容易得到单个的细胞
将细胞悬液吹打均匀后,平均分至两个培养瓶内,并加入适量的培养基
之后拧松培养瓶盖子,放入培养箱内培养
RT—PCR(逆转录,两步合成法)
第一步:
cDNA链的合成
取已提取好的totalRNA/mRNAXul至小EP管内,使得RNA的量保持在50ng-5ug或者5-500ng的范围内
TotalRNA/mRNA:
Xul
之后根据说明书的步骤一次加入:
引物:
AnchoredOligo(dT)18(0.5ug/ul):
1ul
OrRandomPrimer(N9)(0.1ug/ul):
1ul
Or加入GSP:
2pmol
混合液:
2XTSReactionMix:
10ul
TransScriptTMRT/RIEnzymeMix:
1ul
最后加入RNase-freeWater定容至:
20ul
注意:
1.如用AnchoredOligo(dT)18或gene特异性引物(GSP),
42°孵育30min;如用RandomPrimer,25°孵育30min
2.85°加热5min,失活TransScriptTMRT/RIEnzyme
以上所有试剂混合均匀后,将小EP管放入PCR仪内,先检测EP管是平管还是圆管,并将PCR仪上的热盖调至相应位置(圆/平)
之后在PCR仪上输入单元:
2;单元节:
1
根据说明书输入实验反应条件:
单元1:
42°孵育30min/25°孵育30min
单元2:
85°加热5min,失活
创建并命名自己的新文件夹,保存(下次做相同条件的实验时可直接选择文件夹,不需要另外重新设置实验条件)
点击Run,开始运行
第二步:
PCR反应合成DNA
取1//10—1/5体积(2-4ul)的第一步反转录cDNA产物至小EP管内,作为PCR反应的模板
根据说明书一次加入:
ForwardPrimer(10um):
1ul
ReversePrimer(10um):
1ul
2XTansScriptTMHiFiPCRSuperMix:
25ul
最后加入ddH2O至50ul
PCR仪上设置PCR循环,设置单元:
3
单元1:
94°2-5min,(单元节1)
单元2:
94°30s(单元节1)
50-60°30s(单元节2)
72°1-2kb/min(单元节3)
单元3:
72°5-10min(单元节1)
点击Run,开始运行
注意:
1.小EP管壁上的液滴要离心至管底
2.退火温度要根据自己所设置的引物而定
3.检测EP管是平盖还是圆盖,以选择不同的设置
DNA电泳(检测PCR产物DNA含量及准确性):
配1%电泳胶
称取0.2gAgrose溶于20ml1XTBA(于烧瓶内)
将烧瓶放入微波炉内高温加热溶解琼脂糖
当瓶内的液体清晰可见没有颗粒时即为完全溶解
等待溶胶的自然冷却,冷却后加入1ulEB,混匀
之后叫溶胶倒入电泳板内,垂直地插入梳子、
静置,等待胶凝固
凝固后,将胶放入电泳槽内,内有电泳buffer,垂直的拔出梳子
取10-15ulDNA与1ul的DNAloadingbuffer混匀
加上样
连接电源,将电压调至90-120V
根据EB的位置判断电泳的进程
电泳结束,关闭电源
获取DNA电泳图:
电泳结束后,将凝胶放入仪器内,选择UV
打开电脑即可获得电泳结果图,根据电泳条带的亮度判断PCR产物的含量
细胞划痕实验流程
一、准备实验材料:
6孔板(其它的也可以,根据自己实验而定)
直尺
marker笔
20微升枪头(灭菌)
无血清培养基
PBS、
二、紫外照射灭菌
将实验中所用到的实验器械以及直尺和marker笔等提前放入超净台内紫外照灭菌30min
三、实验流程
先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,均匀得划横线,大约每隔0.5~1cm一道,横穿过孔。
每孔至少穿过3条线。
(每孔3条即可)
在孔中加入约5x105个细胞,具体数量因细胞不同而不同,掌握细胞过夜能铺满。
第二天(或等细胞长满时)用枪头(小枪头)比着直尺,尽量垂至于背后的横线划痕,枪头要垂直,不能倾斜,划3条。
之后,用PBS洗细胞3次(动作要轻柔,以免将长满的细胞冲掉),去除划下的细胞,加入无血清培养基。
将六孔板放入37度5%CO2培养箱,培养。
按0,6,12,24小时取样,不同倍数下进行拍照。
(每次拍照时所选取的角度要相同)