常见细胞实验流程.docx

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常见细胞实验流程

常见细胞实验流程

实验前准备

根据自己实验的情况提前预定超净台

进入细胞室之前必须穿鞋套，戴手套

将实验所需要的实验仪器放入超净台内紫外照射灭菌15-20min

高压灭菌操作

1.将所需灭菌的枪头，EP管等仪器放入枪头盒或饭盒中，并用报纸将枪头盒包好。

2.将仪器放入灭菌锅之前，首先要检测一下锅内的水位是否超过锅底的圆圈，若没有超过则需加水。

3.检测水位之后，将包好的器材放入锅内，盖上锅盖并拧紧螺丝。

4.插上电源，先将电压调至250V，目的在于排尽锅内的空气，（当排气阀有白气冒出时，说明空气已排尽）空气排尽后，关闭排气阀。

5.关闭排气阀后指针上升，当指针竖直时，将电压调至125V，保持锅内压力的稳定。

6.开始计时，灭菌30min。

结束时关闭电源，等至指针慢慢降下即可。

7.拿出锅内的器材放入恒温烘箱中烘干，2天后即可拿出。

（组织内）蛋白质提取过程

1.对癌组织和癌旁正常组织进行称重，记录数值。

2.根据RIPA裂解液Ⅲ说明书（每100mg组织中加入1ml溶液A，1ul溶液B，5ul溶液C）按照组织块得大小配好ABC混合液。

3.将组织块加入匀浆器中，并加入相应量得ABC混合液，冰上静置5-10min，开始研磨。

4.将研磨好的组织液倒入事先准备好的EP管中，12000rpm/5min.

5.离心结束后，收集上清液，弃去沉淀，上清即为所要的蛋白。

蛋白质浓度测定

1、取96孔板冲洗干净后超声处理30min,之后用去离子水冲洗干净烘干即可

2、配制BCA标准蛋白液：

浓度原液体积去离子水体积

A管：

2000ug/ul30ul0ul

B管：

1500ug/ul37.5ul12.5ul

C管：

1000ug/ul25ul25ul

D管：

750ug/ul18.75ul31.25ul

E管：

500ug/ul12.5ul37.5ul

F管：

125ug/ul3.125ul46.875ul

G管：

25ug/ul0.625ul49.375ul

H管：

00ul50ul

取8个EP管，分别标上以上字母，并按上表加入相应的原液蛋白和去离子水

先向96孔板内加入200ul的绿色底物溶液（根据实验计算所需要用孔的个数加入底物液）

加完后，将配好的A,B,C,D,E,F,G,H标准液10ul按照96孔板上第1列上的字母标记依次加入

之后在其他的孔内加入10ul蛋白样品（每个样品应重复2次）

加好样品后取保鲜膜将96孔板封闭好，以防止蛋白浓度发生变化，之后将板放入保温箱中静置30min

30min后将96孔板拿出放入测量仪器内（应按照仪器使用说明进行操作）

数据测完后另建文件夹，保存数据，之后插入尤盘拷取数据

在获得的数据结果中，根据BCA的标准蛋白浓度梯度值和560nm下对应的OD值计算可得出一个OD值与浓度相关的标准曲线：

y=ax+b（计算机上操作）

将测得的蛋白样品的OD值带入公式，即可求出蛋白样品的浓度

若实验有实验组和对照组，应将两组的蛋白浓度标准化，即是两组的蛋白浓度相同（相同浓度下的两组实验才具可比性）

将浓度标准化的样品蛋白与loadingbuffer混匀至100ul（混合液中loadingbuffer应为1X的，但实验室的一般为5X），稀释方法：

取20ul5Xloadingbuffer+80ul样品蛋白混匀即可

在加样做westernblot之前，蛋白样品需变性：

将与loadingbuffer混匀好的蛋白样品放入100度金属浴内高温变性10min（EP管上要加帽以防止温度过高EP管盖会冲开）

（组织内）RNA提取过程

1.将组织放入匀浆器中，加入1ml的Trizol，冰上静置10min，进行研磨。

2.将匀浆好的上清转移至1.5mlEP管中，进行离心12000rpm/5min.

3.离心后收集上清液于新的EP管中，加入200ul氯仿，剧烈摇匀后静置5min，然后12000rpm/5min.

4.离心后取上清于另一新的EP管中，取液时不要取到中间层的蛋白。

之后按1:

1的比例加入异丙醇，摇匀后静置15min，进行离心12000rpm/10min。

5.离心后倒掉上清（可看到白色RNA沉淀），加入1ml75%乙醇DEPC水溶液温和震荡，悬浮沉淀，3000rpm/5min.

6.倒掉上清，在滤纸上空干。

然后加入20ulDEPC水溶解沉淀，并吹打均匀。

（如果RNA量较多，可相应的加更多的DEPC水，40ul甚至60ul）

7.测定RNA浓度，取1ulRNA+99ulDEPC水于EP管中（相当于稀释100倍），另取一EP管放100ul的DEPC水用于定标。

定标后倒掉，用去离子水冲洗比色皿，然后测定RNAOD值和浓度，记下数据。

8.RNA电泳（用于检测提取的RNA是否已降解）

配胶（1%的胶）：

取0.2g琼脂糖+20mlTAE+1ulEB

制胶时，应让液体沸腾3次，冷却后加入EB混匀（每20ml加1ulEB）,胶制好后倒入板中凝固，并垂直地插入梳子，静置30min后拔下梳子（可提前用梳子划动下胶，使得胶更均匀）。

取1ul的Loadingbuffer和样本RNA混匀，加样

正确的电泳结果应有3条带：

28S、18S、5S。

28S亮度应为18S亮度的2倍，5S条带越宽越代表RNA降解越多。

如果加样孔内有残留代表蛋白污染，如果离加样孔很近的地方有条带代表DNA污染。

细胞冻存

首先向培养瓶内加入胰酶（1ml）消化细胞

显微镜下观察细胞形态，当细胞变圆脱落时，即可用适量培养基中止消化，之后将细胞液吸入15ml的管内（动作要快，防止胰酶损害细胞）

将管内1/3的细胞液放回培养瓶继续培养（剩余的细胞液平均冻存两管）

离心剩余的细胞液，1200rpm,5min（用等量的PBS配平）

离心后弃上清，得白色沉淀。

可在试管台上轻轻来回划动试管，使得沉淀松动更易于悬浮

用配好的3ml冻存液悬浮沉淀，吹打混匀，使得细胞为单个细胞

分别取1.5ml放入两冻存管内，在冻存管上做好标记：

细胞类型，代数，日期等

标记好后4°冰箱放置30min（切勿超过30min），计时

之后-20°冰箱中放置30min

最后放入-80°冰箱内可保存半年。

若半年后还没有使用则需要将细胞拿出来复苏，长满后再冻存起来。

冻存液的配制方法：

血清（20%）+DMSO（10%，超净台上锡纸包裹的）+培养基（70%）

例如配3ml冻存液：

血清=600ul；DMSO=300ul；培养基=2100ul

细胞复苏

将实验所需要的仪器提前放入超净台内紫外灭菌15-20min

在整个复苏过程中冻存的细胞都应保持在37°水浴中

烧杯中放入37°水，将从冰箱内拿出的细胞用镊子夹住放入烧杯内摇晃使细胞慢慢融化

细胞融化后，用酒精浸湿的纸擦干冻存管

之后在超净台内将细胞液吸取到放有适量（例10ml）PBS的15ml管内吹打均匀（在取细胞之前提前在管内倒入PBS）

1200rpm，5min离心，离心后弃上清得沉淀

将得到的细胞沉淀用适量的培养基悬浮，并吹打均匀，使细胞单个存在

吹打均匀后，用吸管将细胞液吸入培养瓶中（大/小培养瓶根据自己的实验而定）

最后向培养瓶内加入适量的培养基

显微镜下观察细胞情况

最后将培养瓶盖子拧松，放入37°培养箱培养

WesternBlotting

Westernblot实验过程中所需要配制的试剂:

1XTBST:

（用于洗膜）

100ml10XTBS+900ml去离子水+1mlTween20

5%牛奶：

取5g牛奶溶于1000ml1XTBST中混匀

1XRunning:

（用于跑电泳）

10XRunning100ml溶于900ml去离子水中

1Xtransfer:

（用于转膜）

10XTransfer100ml+100ml无水甲醇+800ml去离子水

一抗：

用5%牛奶将一抗稀释2000倍（稀释倍数根据自己实验而定），若抗体由甘油保存，稀释一抗应取所计算体积的2倍。

二抗：

用5%牛奶将二抗稀释10000倍（牛奶封闭性更好）

具体操作流程：

1.清洗玻璃板

一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都要洗净，之后先用自来水冲洗干净，再用去离子水冲洗干净，立在桌面上晾干。

2.配胶（区别于RNA电泳胶）

玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

先按照10%Gel（10ml）比例配下层的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃缓慢放出，待胶面升到绿带中间线高度即可，然后加入100ml异丙醇封闭

静置等待胶凝固，（若试管内剩余的胶凝固代表玻璃板内的胶已经凝固了）凝固后倒掉异丙醇，用去离子水冲洗干净，并用吸水纸将水吸干，并避免刮破胶

再按照5ml的比例配上层的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀后即可灌胶。

将配好的胶灌满剩余的空间，之后垂直缓慢地将梳子插入浓缩胶中，避免产生气泡

胶凝固后即配胶结束

配胶注意事项：

若配好的胶不立即使用，可以保存在4度冰箱内，但保存时间不宜过长（用卫生纸包裹玻璃板，浸湿卫生纸，放入一次性塑料手套内即可，此时不要拔下梳子）

蛋白胶分为两层，上层为浓缩胶，下层为分离胶。

按照10%Gel的方法进行配胶。

注意：

选择玻璃板时要看清玻璃板上的大小标记，一般用10ml的。

玻璃板一定要用去离子水洗干净，之后室温晾干。

浓缩胶和分离胶配制所用Tris-Hcl的PH值是不同的，分别为7.8和6.8

3.跑电泳与上样

配制（1000ml）1XRunning电泳缓冲液：

（实验室现有的是10X）

取100ml10XRunning缓冲液溶于900ml去离子水中即可得到1XRunning缓冲液

将配好的胶板放在电泳槽内，注意正负电极的准确连接，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出

倒入配好的电泳缓冲液，若使用的是两块胶，加入的电泳液液面应超过“2Gel”字符线（电泳液也要灌满玻璃板）

加蛋白上样量：

测完蛋白含量后，计算含20-50ug蛋白（根据自己的实验需要进行选择，没有固定的量）的溶液体积即为上样量。

用10ul枪头进行加样，将枪头插入加样孔缓慢加入样品，加样过快的话容易使样品冲出加样孔（注意同一实验和对照组所加的上样量应该相等，这样才具有可比性），同时加入2-3ulMarker作为条带分子量大小的对照

加样完毕后，盖上电泳槽盖，连接电源，先调电压至120V，按start开始跑电泳

当样品被压成同一水平的线时，可以降低电压至100V或80V左右，电泳至样品内的溴酚蓝刚跑出即可终止电泳，关闭电源，进行转膜

4.转膜

转膜前先用镊子捏住两张硝酸纤维素膜的一边浸泡在无水甲醇中

配制1Xtransfer（转膜缓冲液）：

取10xtransfer100ml+100ml无水甲醇+100ml去离子水混匀即可

将转膜液倒入搪瓷盘内，并放入转膜所需的夹子（夹子具有黑白两面）、两块海绵垫（海面上带有滤纸）、小绿板和浸过的膜

将夹子打开使黑的一面位于底部保持水平，在其上垫一张海绵垫，用小绿板来回擀几次排除其内的气泡。

要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，除去小玻璃板后，将浓缩胶用小绿板轻轻刮取，要避免不要把分离胶刮破。

小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用小绿板擀去气泡。

之后将另一海绵垫平铺在胶上，用手压住，并用小绿板赶走气泡，注意动作要轻柔，避免胶与膜发生错位。

气泡赶净后就可以合起夹子（整个过程都要在转膜液中进行）。

另外一块胶按照形同的过程进行操作

之后将夹子放入转移槽中，要使黑色的面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

由于在转膜的过程中会产生热量，所以将整个转膜槽放入装有冰块的桶内进行。

插上电源，调电压至80V，转膜2h（转膜时电极方向注意是膜正胶负）

转膜结束后，可看到膜上有明显的Marker条带，用丽春红染色液让膜显色，之后可以看到膜上蛋白的条带

将膜放入一平皿内于摇床上脱色，放入1xTBST洗三次，每次10min。

若事先知道目的蛋白的分子量，可以用保鲜膜将膜包裹，之后将膜修剪

脱色之后，用牛奶对膜过夜封闭或封闭1h（4度冰箱内的摇床上过夜）

封闭后，用TBST洗3次，每次10min

加一抗2h（若牛奶封闭1h,可以加一抗过夜）

用1xTBST洗3次，每次10min

加二抗，封闭1h

用1xTBST洗3次，每次10min

5、曝光成像（曝光过程要在黑暗中进行，因为X-光片不能见光）

最后一次冲洗膜时不要将TBST倒掉，以防止曝光过程中膜会变干

取A和B两种显色液500ul分别于两个EP管中

将曝光所需要的仪器：

红外灯、保鲜膜、胶带、黑色板提前准备好，放在暗房的桌上。

用胶带将适宜大小的保鲜膜贴在黑色板上，先将膜放在塑料片上，混匀A,B显色液后滴加到膜上，观察膜是否发出荧光（发出荧光代表膜上有目的蛋白）

当膜发出荧光时，将膜转移至黑板上的保鲜膜上，用膜盖好，在其上放一张X-光片（根据膜的大小将光片裁剪成适宜的大小，以节约利用），压紧黑色板几分钟（根据膜发出的荧光强度定，荧光强的话一会即可，弱的话可多压几分钟）

压好后，将X-光片迅速放入显影液中显影，显影时间一般为1～2min，待出现明显条带后，即刻终止显影。

显影结束后，马上把光片放入定影液中，以胶片透明为止

最后将光片放入自来水中清除残留的定影液，之后室温下晾干。

注意：

显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。

显色液A,B和X-光片都要避光

6、凝胶图像分析：

将胶片进行扫描成像，保存图形。

细胞计数

实验原理：

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。

具体操作：

1、先用1ml胰酶消化细胞，当显微镜下细胞变圆时即可用培养基中止

2、取10ul细胞悬液于一1.5mlEP管内，之后加10ul蓝色显色液混匀

3、将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。

4、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。

5、计算板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。

然后按公式计算：

（细胞悬液的细胞数）/mL＝（4个大格子细胞数/4）×2×104

说明：

公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。

公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：

1稀释。

公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：

1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3而1mL＝1000mm3

细胞计数要点：

要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。

取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确。

数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照1个细胞计算。

如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。

操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。

初学者易犯的错误：

计数前未将待测悬液吹打均匀。

滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。

滴入悬液时的量太多，至使细胞悬液流入旁边的槽中。

细胞培养（换液与传代）

细胞换液：

（当培养瓶内的培养基由红色变为黄色时应该换液）

脚穿鞋套，手带手套方可进入细胞房

将一次性吸管、试管、签字笔等实验所需的器材提前放入超净工作台内UV照射灭菌10min左右

同时将配制好的培养基（1640）放入37度水浴锅内

照射结束后，关闭紫外线，打开吹风橱

从37度常温培养箱内拿出，用酒精浸湿的卫生纸擦拭培养瓶口一周，之后放入超净工作台内

拧开培养瓶盖子，倒掉培养液，之后倒入适量的PBS冲洗并去除培养瓶内的残留代谢物，之后倒掉

用一次性吸管吸取适量培养基（培养基液面没过瓶底部一点即可，大约4-5ml）加入培养瓶内，注意加培养基时不要对着培养瓶的底部吹打，防止将细胞吹落

加完培养基后，拧紧盖子，放在显微镜下观察，之后再用酒精擦拭瓶口

将培养瓶放入培养箱之前拧松瓶盖，之后放入培养箱内培养

对于培养的细胞，一天看一次即可，不要经常性的挪动细胞从而影响细胞的贴壁生长

实验结束后应做好卫生清洁工作，用酒精擦拭干净工作台并打开紫外照射

细胞传代

（当培养瓶内的细胞长满而又进行冻存时需要将细胞传瓶）

准备实验如前所述-----另外也将胰酶放入水浴锅内

将培养瓶放如超净台内，倒掉培养基，加入适量的PBS冲洗一次

加入1ml胰酶摇匀，在显微镜下观察细胞的形态，当细胞变圆时应立即用适量培养基终止消化，之后可以用吸管吹打未脱落的细胞

将细胞液用吸管吸至15ml管内，1000rpm离心5min

弃上清，得沉淀

将沉淀在板上来回的划动使沉淀松动，之后加入培养基悬浮沉淀更容易得到单个的细胞

将细胞悬液吹打均匀后，平均分至两个培养瓶内，并加入适量的培养基

之后拧松培养瓶盖子，放入培养箱内培养

RT—PCR（逆转录，两步合成法）

第一步：

cDNA链的合成

取已提取好的totalRNA/mRNAXul至小EP管内，使得RNA的量保持在50ng-5ug或者5-500ng的范围内

TotalRNA/mRNA:

Xul

之后根据说明书的步骤一次加入:

引物：

AnchoredOligo（dT）18（0.5ug/ul）:

1ul

OrRandomPrimer（N9）（0.1ug/ul）:

1ul

Or加入GSP:

2pmol

混合液：

2XTSReactionMix:

10ul

TransScriptTMRT/RIEnzymeMix:

1ul

最后加入RNase-freeWater定容至：

20ul

注意：

1.如用AnchoredOligo（dT）18或gene特异性引物（GSP），

42°孵育30min；如用RandomPrimer，25°孵育30min

2.85°加热5min,失活TransScriptTMRT/RIEnzyme

以上所有试剂混合均匀后，将小EP管放入PCR仪内，先检测EP管是平管还是圆管，并将PCR仪上的热盖调至相应位置（圆/平）

之后在PCR仪上输入单元：

2；单元节：

1

根据说明书输入实验反应条件：

单元1：

42°孵育30min/25°孵育30min

单元2：

85°加热5min,失活

创建并命名自己的新文件夹，保存（下次做相同条件的实验时可直接选择文件夹，不需要另外重新设置实验条件）

点击Run，开始运行

第二步：

PCR反应合成DNA

取1//10—1/5体积（2-4ul）的第一步反转录cDNA产物至小EP管内，作为PCR反应的模板

根据说明书一次加入：

ForwardPrimer（10um）:

1ul

ReversePrimer（10um）:

1ul

2XTansScriptTMHiFiPCRSuperMix:

25ul

最后加入ddH2O至50ul

PCR仪上设置PCR循环，设置单元：

3

单元1：

94°2-5min,（单元节1）

单元2：

94°30s（单元节1）

50-60°30s（单元节2）

72°1-2kb/min（单元节3）

单元3：

72°5-10min（单元节1）

点击Run，开始运行

注意：

1.小EP管壁上的液滴要离心至管底

2.退火温度要根据自己所设置的引物而定

3.检测EP管是平盖还是圆盖，以选择不同的设置

DNA电泳（检测PCR产物DNA含量及准确性）：

配1%电泳胶

称取0.2gAgrose溶于20ml1XTBA（于烧瓶内）

将烧瓶放入微波炉内高温加热溶解琼脂糖

当瓶内的液体清晰可见没有颗粒时即为完全溶解

等待溶胶的自然冷却，冷却后加入1ulEB，混匀

之后叫溶胶倒入电泳板内，垂直地插入梳子、

静置，等待胶凝固

凝固后，将胶放入电泳槽内，内有电泳buffer，垂直的拔出梳子

取10-15ulDNA与1ul的DNAloadingbuffer混匀

加上样

连接电源，将电压调至90-120V

根据EB的位置判断电泳的进程

电泳结束，关闭电源

获取DNA电泳图：

电泳结束后，将凝胶放入仪器内，选择UV

打开电脑即可获得电泳结果图，根据电泳条带的亮度判断PCR产物的含量

细胞划痕实验流程

一、准备实验材料：

6孔板（其它的也可以，根据自己实验而定）

直尺

marker笔

20微升枪头（灭菌）

无血清培养基

PBS、

二、紫外照射灭菌

将实验中所用到的实验器械以及直尺和marker笔等提前放入超净台内紫外照灭菌30min

三、实验流程

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。

每孔至少穿过3条线。

（每孔3条即可）

在孔中加入约5x105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握细胞过夜能铺满。

第二天（或等细胞长满时）用枪头（小枪头）比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜，划3条。

之后，用PBS洗细胞3次（动作要轻柔，以免将长满的细胞冲掉），去除划下的细胞，加入无血清培养基。

将六孔板放入37度5%CO2培养箱，培养。

按0，6，12，24小时取样，不同倍数下进行拍照。

（每次拍照时所选取的角度要相同）