PCR.docx

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PCR

PCR原理

PCR（聚合酶链反应）的目的是制造大量基因的拷贝。

PCR有三个主要步骤，重复30-40个循环，这在一个自动化循环中完成，它在很短的时间内加热和冷却装有反应混合物的试管。

1.在94℃变性：

变性过程中，双链解开成单链DNA，所有酶反应停止（例如前面循环的延伸）

2．在不同的温度退火：

引物由于布朗运动而快速移动，离子键在单链引物和单链模板之间形成和破坏，更稳定的键会持续更长时间（引物正好合适），在小片的双链DNA（模板和引物）上，聚合酶粘附并开始复制模板，一旦安装少量碱基，引物和模板之间的离子键就变牢固而不再分离。

3.在72℃延伸：

这对聚合酶来说是理想的工作温度。

已经有几个碱基安装的引物对模板有强烈的吸引力，超过了破坏这种吸引的力。

就位但没有精确配对的引物再次松解（因为高温）并不再延伸片段。

碱基（模板互补）从3’端连接到引物（聚合酶从5’-3’添加dNTP,阅读模板从3’-5’，碱基互补的加入模板）

做PCR之前首先应考虑下面一些问题

实施流程：

模板获取、引物设计、体系建立、PCR扩增、结果鉴定、体系优化

一、模板的获取

来源：

病原体标本（Virus,bacteria,fungalcells）

病理生理标本（Cells,blood,urine）

类型：

DNA模板RNA模板

二、引物的设计：

引物包括两条，即5’端引物和3’端引物。

引物决定PCR扩增产物的特异性和长度

引物设计的基本要求：

（1）引物长度:

15~30nucleotides

（2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌呤或嘧啶碱基的堆积现象。

（3）自身不应该存在互补序列

（4）引物间不应该存在互补，尤其是两条应避免3’端的互补重叠

（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%

（6）3’端的碱基最好是G或C，且一定要与模板配对

（7）5’端的游离碱基不影响PCR反应的进行

三、PCR反应体系的建立与条件控制：

DNA扩增体系（25ul）：

缓冲液体系2.5（pH8.3－8.8）

模板DNA2（50－100ng）

Taq酶0.5～2u

dNTP0.5～1（50－200umol/L）

上游引物0.5～1（0.1－1umol/L）

下游引物0.5～1

Mg2+1～2.5（1.5－2mmol/L）

水补齐至25ul

四、反应过程确定变性，退火，延伸的温度、时间，循环次数

五、PCR的结果检测分析及条件优化

（一）PCR结果的常用分析方法

1、琼脂糖凝胶电泳

2、聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）

3、PCR－RFLP

4、PCR－SSCP

5、核酸探针杂交法

6、PCR－ELISA

（二）PCR扩增的常见问题：

1、假阴性（没有结果）

2、假阳性（有结果，但没有目的带）

3、引物二聚体

4、非特异性扩增（有目的带，但杂带多）

5、PCR产物污染

6、RT-PCR中RNA的降解

（三）PCR结果优化：

1、假阳性

原因:

PCR产物、含靶DNA的质粒、阳性对照、标本交叉污染、Taq酶中带细菌DNA

避免方法：

严格实验步骤操作，注意标本的采集、运输、和处理，设立阴性对照

2、假阴性

原因：

（1）标本处理（DNA丢失、杂质去处不干净、模板降解等）；

（2）PCR试剂（Taq酶失活、镁离子浓度过低或不加）

（3）PCR过程中（PCR仪出问题、变性、退火、延伸温度不适宜等）

（4）PCR产物鉴定中（没有加EB、凝胶浓度不够）

避免方法：

设立阳性对照

3、引物二聚体

引物间碱基互补过多

引物模板比太高

退火温度过低

循环次数太多

4、非特异性PCR产物

原因：

引物特异性不高或用量过多；

酶质量不好或过多Mg2＋浓度过高；

退火温度过低或退火延伸时间过长；

循环次数过多。

措施：

A、升高退火温度

B、减少酶用量

C、减少模板用量

D、缩短延伸时间

E、减少引物用量

F、镁离子用量

如果有结果，但量比较少

A、增加模板量

B、增加镁离子的量

C、增加酶量

D、降低退火温度

5、PCR污染及防御措施

（1）潜在的污染源患者、操作人员身体表面，实验室器材、试剂、仪器等

（2）措施：

分区操作，经常消毒

做好器材、试剂的灭菌

使用一次性的Tip头、反应管

小量分装

避免相互污染

戴手套操作

器具专用

设立阳性对照和阴性对照

（3）污染源的处理

稀酸或84消毒液处理

紫外线照射

反应液污染的处理：

6、RT-PCR中避免核糖核酸酶的污染

（1）外源RNase：

戴口罩、手套；玻璃器具用0.1％的DEPC处理；器材用一次性用品；所有溶液用DEPC水配制

（2）内源RNase：

使用RNase抑制剂；去除蛋白质

PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

一.假阴性，不出现扩增条带

　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

　　模板：

①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

　　酶失活：

需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

　　引物：

引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

　　Mg2+浓度：

Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

　　反应体积的改变：

通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要摸索条件，否则容易失败。

　　物理原因：

变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。

有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。

　　靶序列变异：

如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

1假阳性

　　出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

　　引物设计不合适：

选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。

靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。

需重新设计引物。

　　靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因：

一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。

二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。

可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

2出现非特异性扩增带

　　PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：

一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。

二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。

其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：

①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。

3出现片状拖带或涂抹带

　　PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：

①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

二.PCR污染与对策

PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生。

污染原因

（一）标本间交叉污染:

标本污染主要有收集标本的容器被污染，或标本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。

（二）PCR试剂的污染:

主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.

　（三）PCR扩增产物污染:

这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大（一般为1013拷贝/ml），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。

　还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题.

　（四）实验室中克隆质粒的污染:

在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。

因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

污染的监测

　一个好的实验室，要时刻注意污染的监测，考虑有无污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

对照试验

　1.阳性对照:

在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志。

阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下），但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大。

因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。

　2.阴性对照:

每次PCR实验务必做阴性对照。

它包括①标本对照:

被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照。

②试剂对照:

在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染。

　3.重复性试验

4.选择不同区域的引物进行PCR扩增

防止污染的方法

（一）合理分隔实验室:

将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。

最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区。

其实验用品及吸样枪应专用，实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。

（二）吸样枪:

吸样枪污染是一个值得注意的问题。

由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。

（三）预混和分装PCR试剂:

所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存。

以减少重复加样次数，避免污染机会。

另外，PCR试剂，PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。

（四）防止操作人员污染，使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用。

（五）设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病原体核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。

（六）减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。

（七）选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。

开管动作要轻，以防管内液体溅出。

聚合酶链式反应（PCR）扩增注意事项

PCR反应中的主要成份

　　1.引物：

PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。

引物的好坏往往是PCR成败的关键。

引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：

（1）引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。

太长则比较浪费,且难以合成。

（2）引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4（G+C）+2（A+T）.（3）四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3个G或C,因这样易导致错误引发。

（4）引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应,以减少由于密码子摆动产生的不配对。

（5）在引物内,尤其在3'端应不存在二级结构。

（6）两引物之间尤其在3'端不能互补,以防出现引物二聚体,减少产量。

两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。

（7）引物5'端对扩增特异性影响不大,可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。

（8）引物不与模板结合位点以外的序列互补。

所扩增产物本身无稳定的二级结构,以免产生非特异性扩增,影响产量。

（9）简并引物应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3'端应不存在简并性。

否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。

引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,过低则降低产量。

利用紫外分光光度计,可精确计算引物浓度,在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算：

Xmol/L＝OD260/A（16000）+C（70000）+G（12000）+T（9600）

X:

引物摩尔浓度,A、C、G、T:

引物中4种不同碱基个数。

 2.4种三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）：

dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。

一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。

理论上4种dNTP各20μmol/L,足以在100μl反应中合成2.6μg的DNA。

当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性.4种dNTP的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。

　　3.Mg2+：

Mg2+浓度对TaqDNA聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度,影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。

通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR反应,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。

在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。

　　4.模板：

PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子（线状分子比环状分子的扩增效果稍好）.就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102-105个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg的人基因组DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA中的杂质也会影响PCR的效率（）。

　　5.TaqDNA聚合酶：

一般TaqDNA聚合酶活性半衰期为92.5℃130min,95℃40min,97℃5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.TaqDNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/LdNTP到核酸中所需的酶量.TaqDNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环,在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μlPCR反应中,1.5-2单位的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活TaqDNA聚合酶,灭活TaqDNA聚合酶的方法有：

（1）PCR产物经酚:

氯仿抽提,乙醇沉淀。

（2）加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。

（3）99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。

　　6.反应缓冲液：

反应缓冲液一般含10-50mmol/LTris•Cl（20℃下pH8.3-8.8）,50mmol/LKCl和适当浓度的Mg2+.Tris•Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中,pH为6.8-7.8.50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇（DDT）或100μg/ml的牛血清白蛋白（BSA）,它们可稳定酶活性,另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA有利.各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

PCR引物设计的11条黄金法则

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2007-11-02　本站论坛

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。

在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。

.引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。

GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。

上下游引物的GC含量不能相差太大。

另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。

若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A，最好选择T。

Xo/bEUv  

引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。

引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。

降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。

尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。

 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。

这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。

引物自身不能有连续4个碱基的互补。

两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。

引物之间不能有连续4个碱基的互补。

 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。

否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。

△G值是指DNA双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，△G值越大，则双链越稳定。

应当选用5′端和中间△G值相对较高，而3′端△G值较低（绝对值不超过9）的引物。

引物3′端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。

（不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析）9.引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。

引物的5′端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。

因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。

引物5′端修饰包括：

加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。

3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。

某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

用有关软件（比如RNAstructure）可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。

实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。

若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

¬11.引物应具有特异性。

R&{fN V= 

引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。

如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。

有的模板本身条件比较困难，例