壳聚糖酶产生菌产酶条件的优化研究毕业设计论文.docx

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壳聚糖酶产生菌产酶条件的优化研究毕业设计论文

毕业设计（论文）开题报告

理工类

题目:

壳聚糖酶产生菌产酶条件优化研究

学院：

专业班级：

学生姓名：

指导教师：

淮海工学院毕业设计（论文）开题报告

1.课题研究的意义，国内外研究现状、水平和发展趋势

1.课题的研究意义：

壳聚糖酶可以专一性地降解壳聚糖，生产壳寡糖。

壳寡糖具有水溶性好、生物活性高、功能作用大、应用领域广、易被人体吸收等突出特点，因此被广泛地应用于医药卫生、保健食品、食品加工、化妆品、纺织、环保、农业、饲料、环保等领域。

但物理降解和化学降解生产壳寡糖由于污染较大，效率低，收率低，逐渐被淘汰。

利用专一性的壳聚糖酶来制备壳聚糖，由于反应条件温和，得率高，以及可以结合一些过程工程的技术，从而可实现经济的大规模壳聚糖的连续生产，以此成为最有前途的方法。

2.国内外研究现状、水平：

国外对壳聚糖酶的研究已深入到分子水平，侧重于研究不同来源的壳聚糖酶的晶体结构与催化作用机理，并与已知壳聚糖酶的核苷酸序列进行对比，分析同源性，寻找酶分子中发挥催化功能的少数几个必需氨基酸，探索它们在催化壳聚糖水解过程中的作用。

国内对壳聚糖酶的研究日益增多，主要是从自然界中筛选产酶活性较高的微生物菌种，进行诱变选育，优化发酵工艺与酶解条件，以期获得产酶量较大的菌种和活性较高的壳聚糖酶；而酶的氨基酸序列测定、重组壳聚糖酶基因的异源表达等方面的研究则相对较少。

3.问题与展望

虽然壳聚糖酶已经得到了商业化的应用，但是由于原始的菌株产壳聚糖酶能力仍然较低，使得壳聚糖酶的来源有限，生产成本较高，这些均成为限制壳寡糖在应用中不可避免的问题。

同时，现在商品壳聚糖酶在热稳定性等方面还不能满足大规模降解壳聚糖工业化生产的需求。

因此，一方面须要继续寻找不同微生物来源的壳聚糖酶，另一方面须要对现有的壳聚糖酶菌株进行改造，以及培养条件的优化，以期获得高产壳聚糖酶菌株。

淮海工学院毕业设计（论文）开题报告

2.课题的基本内容，可能遇到的困难，提出解决问题的方法和措施

（1）课题的基本内容：

调查并充分查阅资料

设计实验方案

活化菌种

优化发酵培养基的碳、氮源以及碳氮比，提高壳聚糖酶产量

研究不同接种量、装液量对壳聚糖酶产量的影响

通过加入某些特殊添加物来提高壳聚糖酶产量

研究不同温度、pH以及培养时间对壳聚糖酶产量的影响

（2）可能遇到的困难：

①

微生物操作技术不熟练

②拿到的菌可能不是单菌

③该菌是否具有产酶活力

（3）提出解决问题的方法和措施：

①调查和搜集各方面资料，咨询老师，调整不同的培养基。

②确保无菌操作，实验前加强操作的练习。

③挑选单菌，按步骤测定酶活

3.课题拟采用的研究手段（途径）和可行性分析

（1）研究手段：

①DNS测还原糖

②生产性能实验测酶活

（2）可行性分析：

DNS测还原糖通过DNS显示剂与还原糖结合显色，测其OD值，显色与还原糖含量，OD成正比。

生产性能实验测酶活，通过测定酶活反应优化的结果。

淮海工学院毕业设计（论文）开题报告

指导教师意见（对课题的深度、广度及工作量的意见和对设计结果的预测）

指导教师（签名）

年月日

系审查意见：

系主任（签名）：

年月日

毕业设计（论文）外文资料翻译

学院：

海洋学院

专业班级：

生物工程生工081

学生姓名：

王米雪

学号：

040822121

指导教师：

赵玉巧（教授）

外文出处：

（外文）CarbohydratePolymers72（2008）513–520

附件：

1.外文资料翻译译文；2.外文原文

指导教师评语：

签名：

年月日

BacilluscereusD-11壳聚糖酶的纯化及生化性质研究

摘要

这种产壳聚糖酶的菌株从台湾的土壤中分离得到，并且依据其生化性质以及16SRNA的基因序列确认为BacilluscereusD-11。

这种酶的最适培养基包含0.7%的胶体壳聚糖，1%酵母膏和1%NACA，pH为7.0，伴随着0.5%的接种量（1.4·108CFU/ml），于30℃培养3天后，最大的酶活可达到4.85U/ml。

这种胞外壳聚糖酶产生于BacilluscereusD-11，通过冷冻法得到浓缩，通过SephardiG-150凝胶过滤和CM-Sephardi离子交换层析得到纯化。

采用12.5%SDS–PAGE测得纯化的壳聚糖酶的分子质量约为41kDa。

这种壳聚糖酶的最适pH和温度分别为6.0和60℃。

在低于50℃和pH在5到10的条件下，该酶很稳定。

壳聚糖酶的N-末端氨基酸序列表现出高度的相似性，属于糖苷水解酶家族中的第8种。

该酶可以被10mmd的2-羟基-5硝基苯甲基溴抑制，但可以被苯甲酰甲醛和氨氯激活。

以可溶性的壳聚糖（脱乙酰度为86%）作为底物，Km和Am值分别为7.5mg/ml和2.15·107mol/mg/s。

D-11壳聚糖酶可以降解脱乙酰度70%到100%的壳聚糖，但不能降解几丁质，最佳的底物是脱乙酰度为86%的壳聚糖。

因此，D-11壳聚糖酶在PDA培养基上可以抑制Rhizoctoniaisolani的生长。

关键词：

BacilluscereusD-11；壳聚糖酶；抗菌活性；Glycosidehydrolasefamily8；脱乙酰度

1.引言

壳聚糖是一种直线型的多糖，由β—（1，4）—D—氨基葡萄糖组成。

在自然界中，这种聚合物部分是乙酰化的。

事实上，壳聚糖用来广泛的描述聚合物，这种聚合物由D—氨基葡萄糖和N—乙酰—D氨基葡萄氨残基组成。

以前，包括细菌在内的微生物被报道能高效地产生壳聚糖酶去降解壳聚糖酶以及氨基葡萄糖多聚物。

此外，真菌和放线菌也能产生壳聚糖酶。

依据它们的氨基酸序列，这些壳聚糖酶属于不同的GH家族，包括GH-5，GH-8，GH-46，GH-75，和GH-80。

来自BacillusP16（Joetal.，2003），Bacillussp.GM44（Choi，Kim，Apio，Dun，&Shin，2004），Bacillussp.KSM-330（Ozawkie，Fumitory，&Ito，1991），BacilluscircularnessWL-12（Mitosisetal.，1998），andBacillussp.7-如表M（Bruchidae&Surakarta，1988）的生化性质已经得到很好的研究，而且它们属于GH-8。

单个有机体产生的壳聚糖酶区别在于它们水解活力的形式，大多数的壳聚糖酶催化内在的裂解反应，反应的速度很大程度取决于壳聚糖的脱乙酰度。

最近，关注点已经转移到将壳聚糖转变成安全、有效的寡聚糖。

因为壳聚糖显示出很强的生理活性，如抗肿瘤和抗菌活性。

最近，该菌株壳聚糖酶的新奇和有潜力的应用，已经成为低聚壳聚糖生产的一种先进和可供选择的方法。

本次研究的目的在于分离产壳聚糖酶菌株，然后从B.cereusD-11中纯化并研究壳聚糖酶的生化性质，该酶具有很高的分解几丁质的潜力。

2.材料和方法

2.1材料

产TaejonBioLtd.（Seoul，Korea）购买具有不同脱乙酰度的壳聚糖。

本次研究中采用脱乙酰度为86%的壳聚糖。

低聚壳聚糖从购买。

葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶分别从和购买。

缓冲液和其他的化学药品是优质纯的试剂。

2.2分离并鉴定

细菌D-11是从台湾土壤中筛选得到的，连续稀释的的土样被涂布在含有1%NACA，1%蛋白胨，0.5%胶体壳聚糖，2%琼脂的平板上，于30℃培养3天。

有显著分解壳聚糖活性的单菌落被挑选出来并进行分类学的分析，就如伯杰氏细菌分类学手册描述的那样。

为了进一步鉴定该细菌，用PCR来扩增该细菌部分16SRNA的基因。

前导链和后随链的引物分别为5-ACGGCTACCTTGTTACGACT-和5-CCCACTGCCTCCCGTAAGGAGT-3，PCR引物通过使用gem-TEasyvector被克隆。

D-1116SrRNA的核苷酸序列被ABIPrism377DNASequencer测定，并与NCBIBLAST研究中心出版的16SRNA序列进行比较。

2.3壳聚糖酶的纯化

D-11于30℃在含有0.5%的胶体壳聚糖，1%NACA和1%胰蛋白胨的培养基中培养3天。

粗酶浓缩之后被冻干，溶于pH6.0的50M醋酸盐缓冲液，之后进行透析。

溶液上G-150葡聚糖凝胶柱，并与相同的缓冲液平衡。

活性部分进一步在葡聚糖凝胶柱上纯化。

蛋白质在流速为0.9ml/min下被洗涤，4-ml部分被收集。

蛋白质的侧链在280nm吸光度下可以被检测到。

通过使用溶解性壳聚糖作底物来检测壳聚糖酶的活性，每一反应混合液包含0.9mL1%的溶解性壳聚糖，80Bul100M的醋酸盐缓冲液，和20ul酶液，在37℃保温30min后，此反应被200ul的1MNaOH终止。

还原糖可以用Eschalot方法测定，也可以用二硝基水杨酸方法测定，该方法要用氨基葡萄糖做标准曲线。

一个单位如表的壳聚糖酶可以定义为每分钟分解1umol还原糖的酶量。

蛋白质的浓缩可以用Bradford方法测得，该法用牛血清蛋白作标准。

2.4纯化的壳聚糖酶的特性

为了测定最适温度，反应混合液在pH6.0的醋酸盐缓冲液中，与不同的温度下培养30min.为了测定耐热性，酶在pH6.0在无底物作用下，与不同的温度下预培养1h后测定残存的活力。

为了测定最适pH，酶液在含有溶解性壳聚糖的不同pH缓冲液下37℃下，培养30min，pH3.5磷酸缓冲液，pH4–6乙酸钠缓冲液，pH7–8Tris–Cl缓冲液，和pH9–11的碳酸盐缓冲液用于pH的调整。

为了测定pH的稳定性，酶液要在不同pH缓冲液中4℃预培养1h。

在用醋酸盐缓冲液调整到pH6.0之后，酶液在底物作用下37℃培养30min。

为了测定底物专一性，酶活性有几种壳聚糖衍生物和非壳聚糖衍生物决定。

为了测定金属离子的影响，壳聚糖酶在10M金属离子中先培养，金属离子有Mg2+，Mn2+，Pb2+，Cu2+，和Hg2+。

为了测定动力学常数，20ul的酶液再加入浓缩系数0.5到2.5mg/mL溶解性壳聚糖中，于37℃预培养1h。

米氏常数Km和Max用Lineweaver–Borktransformation方法测得。

2.5氨基酸残基的修饰

依据规定，通过将被纯化的酶在一些修饰的溶液中于不同的缓冲液下25℃培养来修饰氨基酸的残基或功能基团。

反应结束后，残存酶的活性用上述方法测定。

2.6菌丝生长的抑制

用纯化的壳聚糖酶来检测菌丝生长的抑制作用。

RhizoctoniaisolaniAG-1生长在PDA培养基上，将含有R.Solani1cm直径的圆纸片放在平板中央，再将纯化的酶喷洒在平板上，最后，平板于27℃下培养3天。

2.7分析方法

壳聚糖酶的纯度用12.5%SDS–PAGE来检验。

电泳后，使用电印记系统蛋白质转变成PVDF。

纯化的蛋白质N-末端序列用美国生物应用系统公司的高精度定序器来分析。

依据Joetal在2003年使用的Brookfield粘度计，在设定的时间间隔里，可以衡量粘度的变化。

反应液包括7.0ml溶解在10mm醋酸盐缓冲液中的1%的溶解性壳聚糖，和20ul的酶液。

在粘度计中，反应在35℃发生，每个混合物的粘性在特定的间隔中测得。

3结果与讨论

3.1微生物的鉴定

细菌中分离出的D-11，通过伯杰氏细菌学手册进行分类，并鉴定属于Bacillus种属。

这种分类鉴定主要依据下面标准，如表一所示，菌体为G+、好氧、棒状、有活力和过氧化氢酶阳性。

分离出的菌不能在5%NACA上生长。

D-1116SrRNA保留部分核苷酸序列，被断定并服从基因库。

依据序列，D-11被鉴定为B.Cereus。

在1197年，D-11和B.cereus（IDAF176322）16SrRNA序列被检测出没有明显的区别。

从上面的结果可知，D-11和B.Cereus非常的相似，相似度在95％以上。

因此，分离出的D-11被认为是B.Cereous-11。

先前描述的产壳聚糖酶菌株是以下菌属中的一员：

不动杆菌属，酸菌属，芽孢杆菌属，肠杆菌属，粘球菌属，卡诺氏菌属，假单胞菌属和链霉菌属。

3.2壳聚糖酶的生产

D-11在富含C、N源的培养基中研究其胞外壳聚糖酶的生产力，0.7%胶体壳聚糖和1%的酵母膏分别是最好的C、N源。

在不同的温度下摇床培养，壳聚糖酶在30℃时的活力最高。

于在壳聚糖的培养基中相比，这株菌株在葡萄糖培养基中长得更好，能生产大约90％的壳聚糖酶。

已知就像Cyanobacteriumsp那样，增加葡萄糖的量将抑制酶的产量。

在发酵培养基中，30℃培养3天，最大的酶活可达到4.85U/ml。

与其他B.cereus（2.0–3.8U/ml）（Chang，Chen，&Ja，2007;Joetal.，2003），（2.0–3.8U/ml）（Chang，Chen，&Ja，2007;Joetal.，2003），BacilluselateriumP1（1U/ml）（Pelletier&Schuss，1990），和Pseudomonassp.H-14（650U/ml）（Praetorshipsal.，1992）相比，该酶活是比较高的。

事实上，这也表明该菌株在工业生产壳聚糖上的潜在适应性。

在延滞期早起和指数期，壳聚糖酶活力依然很低。

担当培养到稳定期时，酶活开始增加。

在细胞匀浆中很难发现酶活，这表明，在细菌细胞合成和修饰蛋白后，所有的壳聚糖酶分泌到细胞外的培养液中。

上清液中含有壳聚糖酶和β-N乙酰己糖胺酶。

D-11上清液对溶解性壳聚糖表现出很强的液化活性。

壳聚糖的液化作用很大程度上是由于壳聚糖酶的内核分裂作用。

活性染色后，在上清液中发现了5种壳聚糖酶的同工酶，从B.cereusP16（Joetal.，2003），B.circularnessWL-12（Mitosisetal.，1998），B.elateriumP1（Pelletier&Schuss，1990），AspergillusfumigantKH-94（Kim，Chon，&Lee，1998），Mucorroux（Alfonso，Martinez，&Reyes，1992），andAzotobactersp.CHB101（Kagoshimaetal.，1995）中报道过产壳聚糖酶的菌株。

这五种壳聚糖酶通过从P16上清液活性染色鉴定为可能来源于多个基因。

但进一步的研究需要阐释基因结构和同工酶多样性的关系。

D-11生长的培养基中不仅包括胶体壳聚糖和壳聚糖粉末，还包括几丁质和粉末几丁质作为碳源。

这表明，分离出来的菌株能产生分解壳聚糖的酶。

此外，D-11上清液中包含内在型壳聚糖酶、几丁质酶和β-N乙酰己糖胺酶，这也表明这种菌株有这广泛的DD值去降解几丁质的聚合物来支持其生长。

3.3壳聚糖酶的纯化

胞外壳聚糖酶的纯化用葡聚糖G-150和羧甲基葡萄糖凝胶色谱法从上清液中测得。

纯化的步骤如表2。

最后，壳聚糖酶可以纯化到8.8倍，比活度达到347.8U/mg.Bacillussp.StrainCK4的比活是126U/mg，Bacillussp.S65的比活是93.6U/mg。

SDS–PAGE之后，蛋白和活性染色表明，酶是均匀的，并且分子质量为41Ada（Fig.4）。

据报道，通过SDS–PAGE测定，绝大多数内切壳聚糖酶的分子质量在20到50Ada之间，然而，外切壳聚糖酶的分子质量在97到135之间。

D-11壳聚糖酶的N-末端序列A-A-AK-E-M-K-P-F-P-Q-Q-V-N-Y-A-G-V-I-K，与B.cereusATCC14579（Canovaetal.，2003）andBacillussp.GM44（Choietal.，2004）壳聚糖酶的序列完全相符。

它们都属于8glycosylhydrolase家族。

3.4pH和温度的影响

当以溶剂性壳聚糖作为底物时，纯化的D-11壳聚糖酶的最适pH是6.0，当pH高于7或低于4时，酶活急剧下降。

4℃酶在pH6-10的各种缓冲液中都很稳定。

B.elateriumstrainp1（Pelletier&Schuss，1990）的最适pH在4.5到6.5之间；Cyanobacteriumsp.OU01Microbacteriumsp.OU01（Sun，Li，Han，Bhang，&Li，2006）的最适pH在5.2到7.8之间；Bacillussp.HW-002（Leeetal.，1996）的最适pH在5.5到6.0之间。

当酶放置在不同的温度下，最适温度是60℃，壳聚糖酶在低于50℃比较稳定，因此，加热到60℃维持1h，该酶还有70％的活力。

Bacillussp.HW-002（Leeetal.，1996）在高于45℃下稳定，加热到50℃维持1h，只有20％的活力。

3.5底物专一性的影响

对于纯化酶的底物专一性，用几丁质和脱乙酰度在74％到98.5％的壳聚糖表3

作为底物，该酶能有效地水解溶解性壳聚糖和胶体壳聚糖，但对乙二醇壳聚糖、壳聚糖粉末和几丁质却表现很小的活性。

从Amblyopsissp.CEO-2（Okayamaetal.，1994），Pericarditides.K-01（Okayama，Makunouchi，Kami，&Ado，1995），andBacillussp.CK4（Goonetal.，2001）中分离的壳聚糖酶对脱乙酰度100％的壳聚糖具有很强的活性。

对D-11壳聚糖酶来说，最适底物是脱乙酰度86％的壳聚糖。

这表明D-11对Glen-Glen、Glucina-Glen-Glen、linac-Glen和Glen-Glucina具有专一性。

N-乙酰氨基葡萄糖残基对该酶的识别和底物反应机理很重要。

奇怪的是，与溶解性壳聚糖相比，D-11壳聚糖酶难水解CMC，这也是第八种水解酶家族的标志。

3.6离子的抑制作用

该酶在Hg2+作用下完全没有活性，在10mm浓度的Pb2+和Cu2+作用下也没有活性。

然而，其他离子对酶活性影响较小。

当与一些氨基酸修饰剂如2-羟基-5-硝基苄溴（49％）和10mm焦碳酸二乙酯培养时，该酶无活性。

2-羟基-5-硝基苄溴是色氨酸残基的修饰剂。

因此这表明，具有催化活性的酶中可能包含色氨酸残基。

来自Bacillussp.P-16（Joetal.，2003）和AspergillusfumigantS-26（Jung，Auk，Kim，Jung，&Park，2006）的壳聚糖酶的活性也受到2-羟基-5-硝基苄溴的抑制。

然而，phenylalanin，氯氨T（amethionineresiduemodifier）andp-hydrometeorological酸可以激活酶的活性。

与此相反，氯胺曾被报道是Bacillussp.P-16壳聚糖酶的一种抑制剂。

3.7其他的特征

纯化的酶在溶解性壳聚糖中37℃培养30min，并且做出Lineweaver–Bork图，

然后可以测出动力学常数：

Km，7.5mg/ml;Max，2.15·10-7mol/mg/s;Cat，1.73·104s-1;andCat/Km，2.31·103ml/mg/s（表6）.

随着酶量的增加，溶解性壳聚糖的粘性在下降。

在反应的初期，壳聚糖酶能降解壳聚糖的粘性，随着时间的流逝，粘性降低的速度在变慢。

结果表明，B.cereusD-11壳聚糖酶以内切的方法来裂解多聚壳聚糖链。

经过TLC和HPLC的分析，溶解性壳聚糖酶促反应的产物是壳二糖和壳三糖，壳三糖是主要产物。

3.8菌丝生长的抑制作用

对抑制菌丝生长的壳聚糖酶进行了测试，RhizoctoniaisolaniAG-1菌丝生长在PDA培养基上，在缓冲液中包含1.6、3.2或4.8ug的酶量时，生长受到抑制。

纯化的壳聚糖酶在以3.2-4.8ug接种3天后，可以抑制R.isolani-1的生长，表现出抗菌性能。

4结论

分子量为41KD的壳聚糖酶从B.cereusD-11发酵液中纯化，而且它的性能也得到了研究。

这种酶对脱乙酰度为70％-100％的溶解性壳聚糖具有底物专一性。

然而，这种酶却不能降解几丁质。

在PDA培养基上，D-11壳聚糖酶对R.isolaniAG-1产生抗真菌活性。

纯化的壳聚糖酶催化内在的裂解反应，这一点在溶解性壳聚糖的粘性不断降解中得以证实。

跟进一步研究正在进行解释纯化的内切壳聚糖酶的水解机理，以便适应于大规模的商业生产。

致谢

这一项工作是由韩国科学与工程基金会通过国家实验室支持，受科教部资助。

本科毕业设计（论文）

壳聚糖酶产生菌产酶条件优化研究

OptimizationofFermentationConditionsofChitosanaseProductionStrain

学院：

海洋学院

专业班级：

生物工程生工081

学生姓名：

王米雪

学号：

0408221221

指导教师：

赵玉巧（教授）

2012年6月

毕业设计（论文）中文摘要

壳聚糖酶产生菌产酶条件优化研究

摘要：

本实验室人员从连云港海域筛选到的一株革兰氏阴性的XK-3菌株，该菌株具有产壳聚糖酶的能力，其产的壳聚糖酶活力为1074U/L，为了提高该菌株的产壳聚糖酶的能力，对其进行发酵条件的优化研究。

结果表明，其最适产酶培养基为：

（NH4）2SO4为15g/L，牛肉膏为15g/L，葡萄糖为30g/L，K2HPO4为2g/L，KH2PO4为2g/L，NaCl为5g/L，MgSO4·7H2O为0.5g/L，调初始pH至6.0；Mg2+对壳聚糖酶活力具有明显的促进作用，Ca2+、Mn2+对酶活也有一定的促进作用，而Fe3+、Cu2+和Zn2+对壳聚糖酶活力有一定的抑制作用，其他离子对酶活没有明显的作用。

最适产酶培养条件为：

2.0％的接种量，20％的装液量即250mL的三角瓶装液量为50mL，28℃下150r/min摇床培养64h。

在最适产酶培养条件下，该菌株发酵液的酶活力达到3704U/L，是原来的3.45倍。

最后研究了该菌的生长量和产酶的关系，发现菌体的最适生长时间为24h，发酵于64h之后结束。

关键词：

壳聚糖；壳聚糖酶，壳寡糖；优化

毕业设计（论文）外文摘要

OptimizationofFermentationConditionsofChitosanaseProductionStrain

Abstract:

AChitosanaseproductionbacteriumwasisolatedfromLianYungangseaareaandna