ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的阻碍.docx
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ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的阻碍
ppGalNAcT2反义RNA对胃癌细胞SGC7901生物学特性的阻碍
作者：
金美芳，邵雪军，吴士良
【摘要】目的：
研究人胃癌细胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶2（ppGalNAcT2）基因表达与肿瘤转移相关基因MMP2，TGFβ1表达的相关性，和对细胞增殖和形态生物学特性的阻碍。
方式：
用两个已构建好的反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901，通过Ｇ418挑选，成立一系列旨在封锁胃癌细胞SGC7901ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆。
通过共聚焦显微镜，RTPCR检测反义封锁ppGalNAcT2基因RNA表达后，胃癌细胞SGC7901中TGFβ1，MMP2表达水平，细胞增殖和形态的转变。
结果：
反义封锁ppGalNAcT2基因表达后,胃癌细胞SGC7901ppGalNAcT2的表达水平明显降低，细胞的形态发生改变，割裂增殖减慢。
结果还显示，反义封锁ppGalNAcT2基因表达可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表达水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生阻碍。
结论：
ppGalNAcT2可能在肿瘤的增殖、浸润和转移中发挥作用。
【关键词】SGC7901细胞；多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶;基质金属蛋白酶;转化生长因子β1
［Abstract］Objective:
TostudytheeffectonthecellproliferationandthelevelofMMP2andTGFβ1intheSGC7901cellscausedbyantisenseblockingppGalNAcT2geneexpressionMethods：
TheantisenseexpressingvectorsoftwodifferentlengthppGalNAcT2genesegmentswereconstructedandtransfectedintoSGC7901seriesofsubcellularclonesaimingatblockingofppGalNAcT2geneexpressionofSGC7901cellswereestablishedbyG418antisenseblocking,thecellswerefirsttestedwithfluorescenttheexpressionofppGalNAcT2，MMP2andTGFβ1genecellsgrowthwerestudiedwithRTeffectsofppGalNAcT2antisenseRNAontheproliferationofSGC7901cellsweretestedbyMTT.Results：
TheresultsshowedthatppGalNAcT2levelinSGC7901cellswasobviouslyredudcedandthecellproliferationwasslowerafterantisenseindicatedthattheblockingofppGalNAcT2geneexpressionhadinfluenceonSGC7901cellwasalsorevealedthattheblockingofppGalNAcT2geneexpressioncouldincreasethemRNAandproteinlevelofMMP2andTGFβ1.Conclusion：
TheresultsuggeststhatppGalNAcT2hasanimportantroleinthecellproliferation,invasionandmetastasisofcancer.
［Keywords］SGC7901cell;polypeptideNacetylgalactosaminyltransferase;matrixmetalloproteinase;transforminggrowthfactorβ1
糖蛋白的糖链依照其连接方式的不同，分为两大类：
一类称N连接型糖链，又称N聚糖，要紧存在于血浆蛋白和细胞膜及胞质的糖蛋白中。
另一类称O连接型糖链，又称O聚糖，要紧见于分泌液中的糖蛋白，俗称黏蛋白［1］。
肿瘤细胞含有富含O聚糖结构域的膜结合黏蛋白类糖蛋白，这些糖蛋白的基因表达具有细胞特异性而且在肿瘤细胞中常发生变异。
有关糖基转移酶的研究，以往人们较多地关注参与N糖苷键连接有关的酶，最近几年来随着O糖基化相关酶新基因的发觉和克隆，有关O糖基化产生的糖链结构和功能的研究受到普遍重视。
多肽:
N乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptideNacetylgalactosaminyltransferase，ppGalNAcTs）是O糖链合成第一步的糖基转移酶，ppGalNAcT2是该家族中组织散布及底物谱较广的成员，很有可能是O糖链合成的限速酶，有着重要的生物学意义［2］。
为了深切研究ppGalNAcT2的生物学功能，咱们成功地构建了ppGalNAcT2反义表达质粒载体，反义封锁ppGalNAcT2基因表达［3］；咱们也成功地构建了ppGalNAcT2的RNA干扰真核表达载体，转染SGC7901细胞取得稳固的ppGalNAcT2基因剔除细胞株［4］。
为探讨ppGalNAcT2在肿瘤细胞生长增殖及浸润转移中的作用，本研究将ppGalNAcT2反义重组载体运用脂质体介导转染人胃癌细胞SGC7901，取得封锁胃癌细胞SGC7901细胞ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆，并对其生长繁衍及浸润转移相关基因基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）和转移生长因子β1（transforminggrowthfactorβ1，TGFβ1）的表达进行了初步研究。
1材料与方式
材料
人胃癌细胞株SGC7901为本室保留。
反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室构建保留。
RPMI1640培育基购自GibcoBRL公司，RTPCR试剂盒购于Promega公司，转染试剂盒G418选择性抗生素购于Roche公司。
PCR引物为上海博亚公司合成。
NBT/BCIP染色试剂盒为华丽生物工程公司产品，antihTGFβ一、antihMMP2及βactin单抗均为R&D公司产品。
方法
重组质粒转染SGC7901细胞pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重组载体别离是将T2全长序列1716bp和T2序列中的一片段753bp经酶切后反向连接入pEGFPC1载体中，别离形成反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。
转染前将SGC7901细胞接种于24孔板，加入不同浓度的G418观看细胞的死亡情形，确信最低致死浓度。
将处于对数生长期的SGC7901细胞接种于培育瓶（1×106/ml），于37℃，5％CO2孵箱中孵育12h后，按FUGENE6介导转染贴壁细胞的方式，将纯化的重组质粒和阴性空质粒转染SGC7901细胞。
72h后加入G418溶液至终浓度为600mg/L，培育2周左右直到显现抗G418细胞克隆。
共聚焦显微镜观看将盖玻片置于6孔板中，把转染过的细胞培育于其中，待细胞长到30%～40％的汇合度时弃去培育基，用PBS轻轻淋洗后，每孔加1ml4％低聚甲醛固定半小时后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦显微镜下观看转染进细胞的质粒所表达的GFP荧光。
细胞形态学观看将未转染细胞、转染空载体的细胞及转染了反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的细胞株别离命名为SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，将4种细胞置于显微镜下，观看其形态的转变，并拍照记录。
相关基因的检测细胞总RNA的提取采纳Trizol一步法。
以所取得的细胞总RNA为模板，利用Promega公司的试剂盒进行RT反映，取得cDNA。
选用βactin为内对照，以各类细胞株的总RNA的RT产物为模板同时进行PCR扩增，检测转染反义ppGalNAcT2的SGC7901细胞ppGalNAcT2，TGFβ1，MMP2等相关基因表达的转变。
PCR反映条件是94℃预变性4min，94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸90s，35个循环，72℃再延伸10min。
PCR引物序列及预扩增片段长度如下（表1）。
MTT法检测细胞增殖取对数生长期细胞，胰酶消化成单个细胞悬液后，计数细胞，将细胞调整到必然浓度后，接种于96孔板上，每孔加200μl细胞悬液，每隔24h随机取4孔，各加MTT50μl，5h后警惕吸去液体，加二甲基亚砜（DMSO）150μl，待显色后转移到酶标仪上测定光密度值（490nm）。
以第1天的光密度值为1以后各天显示值为与第1天之比值，作生长曲线图，观看细胞增殖转变。
2结果
共聚焦显微镜观看结果
在共聚焦显微镜下观看到转染后的细胞发出绿色荧光（图1），并发觉GFP绿色荧光都集中于胞质中，证明转染成功。
表1PCR引物序列
转基因细胞形态学观看结果
荧光显微镜下能够看到转染了反义RNA载体的细胞形态有所转变，相关于未转染的细胞及转染了空载体的细胞其形态更显得梭长，提示转染反义重组载体可能阻碍细胞的生长特性（图2）。
转移相关基因的转变
结果说明转染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2细胞ppGalNAcT2的mRNA表达明显降低，而TGFβ1和MMP2的mRNA表达水平均相对增加（图3）。
显示ppGalNAcT2可能与肿瘤的浸润转移紧密相关。
3讨论
ppGalNAcT及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，可能与肿瘤的生长和转移紧密相关。
咱们观看了ppGalNAcT2在8种肿瘤细胞中的表达谱后发觉［3，5］，在人胃癌细胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表达较其他细胞要高。
本研究通过转染表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒，成功取得了ppGalNAcT2表达受抑制的人胃癌细胞克隆，为研究该基因在肿瘤发生进展中的作用提供了实验模型。
进一步的相关功能研究结果说明，转染了ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞ppGalNAcT2mRNA表达水平降低，TGFβ1，MMP2的mRNA表达水平均相对增加。
由于TGFβ1，MMP2都与肿瘤的浸润转移及增殖相关，因此推测ppGalNAcT2与肿瘤的浸润转移及增殖紧密关联。
关于转移瘤生长相关的细胞因子，最近几年来研究较多的有IGFⅡ，TGFβ，EGF，IL6等。
TGFβ1基因被以为参与了信号转导、细胞生长、转化和肿瘤发生等进程，在许多肿瘤组织中高表达。
TGFβ1可增进某些肿瘤细胞的局部浸润或腹膜播散，并减弱免疫系统对肿瘤的排斥效应［6］。
TGFβmRNA表达受多种因素的阻碍，最近几年的研究发觉TGFβmRNA的水平升高似乎与高糖的程度呈正相关［7］，Ziyadeh等在体外研究中证明，高糖增强系膜细胞TGFβmRNA的表达及活性，而在糖尿病研究中也发觉非酶糖基化产物可增进TGFβ1mRNA的表达。
本研究中转染了表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞TGFβ1的表达明显高于未转染的细胞和转染空载的细胞。
可能的缘故是由于抑制了细胞内ppGalNAcT2的表达，酶促糖基化减少，而非酶糖基化增加，如此同时增加了糖浓度和非酶糖基化产物。
这两个因素可增进TGFβ1mRNA表达相对增加。
而TGFβ1又与MMP的表达紧密相关，TGFβ1能诱导人类细胞株转录出高水平的MMPsmRNA［8］。
有报导称，在转基因小鼠的研究中发觉TGFβ的过表达能抑制良性皮肤瘤的形成，而关于皮肤癌却能增进其浸润转移，并证明是MMPs合成增加所致［9］。
在本研究中，ppGalNAcT2反义RNA能抑制ppGalNAcT2的表达,而ppGalNAcT2表达水平的降低增进了TGFβ1的表达，进而可能增进MMPs的合成。
TGFβ1是具有双重调剂作用的因子，体外实验证明TGFβ1是肿瘤细胞生长的要紧负性调控因子，TGFβ1与细胞表面受体结合，通过p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表达，使细胞割裂停止，抑制肿瘤细胞的生长［10,11］。
在本研究中，推测ppGalNAcT2的减少致使TGFβ1的合成增加进而减慢了细胞的生长。
咱们的工作还观看到ppGalNAcT2对胃癌细胞SGC7901对细胞外基质成份的黏附能力有阻碍［12］，因此有关ppGalNAcT2在整体动物肿瘤生长、浸润与转移进程中的作用值得进一步研究。
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