食品微生物实验技术指导书.docx

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食品微生物实验技术指导书

实验一普通显微镜的使用和细菌形态观察

1目的

（1）学习并掌握油镜的工作原理和使用方法。

（2）复习光学显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。

2原理

微生物的最显著特点是个体微小，必须借助显微镜才能观察到它们的个体形态和细胞结构。

熟悉显微镜和掌握其操作技术是研究微生物不可缺少的手段。

实验将介绍目前微生物学研究中最常用的普通光学显微镜的结构和样品制作。

的在于使同学们通过实验，对光学显微镜有比较全面的了解，并重点掌握明视野通光学显微镜中油镜的使用。

3材料

3.1菌种

金黄色葡萄球菌（Staphlococcusaureus）及枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）染色玻片标本。

链霉菌（Streptomycessp.）及青霉菌（Penicilliumsp.）的水封片。

3.2溶液或试剂

香柏油、二甲苯。

3.3仪器及其他用品

显微镜、擦镜纸等。

4流程

安置一＞调光源一＞调目镜一＞调聚光器一＞镜检（低倍镜一＞高倍镜一＞油镜）一＞擦镜一＞复原

5步骤

5.1观察前的准备

5.1.1显微镜的安置

置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约l0cm。

镜检时姿势要端正。

5.1.2光源调节

安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，若使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。

5.1.3双筒显微镜的目镜调节

根据使用者的个入情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。

5.1.4聚光器数值孔径值的调节

正确使用聚光镜才能提高镜检的效果。

聚光镜的主要参数是数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。

5.2显微观察

在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。

一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。

5.2.1低倍镜观察

将金黄色葡萄球菌染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。

下降10倍物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节使物像清晰。

通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

5.2.2高倍镜观察

在低倍镜下找到合适的观察目标，并将其移至视野中心后，将高倍镜移至工作位置。

对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细凋节器使物像清晰，利用推进器移动标本找到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。

5.2.3油镜观察

在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。

在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜镜头浸在油中，并几乎与标本接触时止（注意：

切不可将油镜镜头压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头）。

将聚光器升至最高位置并开足光圈（若所用聚光器的数值孔径值超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间也加滴香柏油，保证其达到最大的效能），调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。

然后用相同的方法观察其他样本。

5.3显微镜用后的处理

上升镜筒，取下载玻片。

先用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，尔后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，最后用绸布清洁显微镜的金属部件。

将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。

同时把聚光镜降下以免接物镜与聚光镜发生碰撞。

套上镜套，放回原处。

6结果

分别绘出在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌及青霉菌的形态，包括在3种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。

7思考题

（1）用油镜观察时应注意哪些问题?

在载玻片和镜头之间加滴什么油?

起什么作用?

（2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。

为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作?

（3）什么是物镜的同焦现象?

它在显微镜观察中有什么意义?

（4）影响显微镜分辨率的因素有哪些?

（5）根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。

附注

显微镜的基本结构及工作说明

普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像。

它由机械装置和光学系统两大部分组成（图1—1）。

显微镜的光学系统包括：

物镜、目镜、反射镜和聚光器四个部件，其中物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。

一般微生物学使用的显微镜有三个物镜即低倍镜（4～10倍）、高倍镜（40～45倍）和油镜（90～100倍），油镜对微生物学研究非常重要。

油镜使用时需在载玻片与镜头之间加滴香柏油，一方面是增加照明亮度，油镜的放大倍数大、焦距短、直径小，但所需要的光照强度却最大。

从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入物镜），有些光线会因折射或全反射不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。

为了减少通过光线的损失，在使用油镜时须在油镜与玻片之间加入与玻璃的折射率（n＝1.55）相仿的镜油（通常用香柏油，其折射率n＝1.52）。

另一方面是增加显微镜的分辨率。

显微镜的分辨率或分辨力（resolutionorresolvingpower）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。

显微镜的优劣主要取决于分辨率（D）的大小：

分辨率（最小可分辨距离）＝入／2NA

式中：

入＝光波波长；NA＝物镜的数值孔径值。

光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7／μm），而数值孔径值则取决于物镜的镜口角（光线投射到物镜上最大角度）和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：

NA＝n.sinα式中：

α为镜口角的半数。

它取决于物镜的直径和焦距。

一般来说，在实际应用中最大只能达到120，而n为介质折射率。

由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径值（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等物镜（NA都低于1.0）。

若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65μm左右的高倍镜只能分辨出距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。

大部分细菌的直径在0。

5μm以上，所以油镜更能看清细菌的个体形态。

实验二简单染色法和革兰氏染色法

（一）细菌的简单染色法

目的

（1）学习微生物涂片、染色的基本技术。

（2）掌握细菌的简单染色法。

（3）初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。

原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。

细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。

利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。

此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。

常用做简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

染色前必须固定细菌。

其目的有二：

一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。

常用的有加热和化学固定两种方法。

固定时尽量维持细胞原有的形态。

3材料.

3，1菌种

枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌（Micrococcusluteus）约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichiacoli）24h营养琼脂斜面培养物。

3.2染色剂

吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），碳酸复红染液。

3.3仪器及其他用品

显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、玻片搁架、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、生理盐水或蒸馏水等。

4流程

涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检

5步骤

5.1涂片

取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水（或蒸馏水）于坡片中央，用接种环以无菌操作（图2—1），分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。

若用菌悬液（或液体培养物）涂片,可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。

注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

5.2干燥

室温自然干燥。

也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。

但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。

5.3固定

如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。

5.4染色

将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液l或2滴于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。

吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红（或草酸铵结晶紫）染色约1min。

5.5水洗

倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。

水洗时，不要水流直接冲洗涂面。

水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。

5.6干燥

甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去

5.7镜检

涂片干后镜检。

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

6结果

绘制简单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。

（二）革兰氏染色法

1目的

（1）了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

（2）学习掌握革兰氏染色技术,巩固光学显微镜油镜的使用方法。

2原理

革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G--）两大类。

革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。

革兰氏染色法的基本步骤是：

先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染。

经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。

革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。

实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。

碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。

当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。

革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。

3材料

3.1菌种

大肠杆菌（Escherichiacoli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。

3.2染色剂

结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95％乙醇、番红染色液。

3.3仪器及其他用品

显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、.蒸馏水、香柏油、二甲苯。

4流程

涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检

5步骤

5.1涂片

5.1.1常规涂片法

取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。

玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。

5.1.2“三区”涂片法

在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。

再用无菌的接种环挑取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合在含有两种菌的混合区，干燥、固定。

要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。

5.2初染

滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）于2个玻片的涂面上，染色1～2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。

5.3媒染

用卢戈氏碘液媒染约1min，水洗。

5.4脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。

革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。

脱色不足，革兰氏阴性菌被误染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌被误染成革兰氏阴性菌。

脱色时间一般为20～30s。

5.5复染

在涂片上滴加番红液复染2—3min，水洗，然后用吸水纸吸干。

在染色的过程中，不可使染液干涸。

5.6镜检

干燥后，用油镜观察。

判断两种菌体染色反应性。

菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G—）。

5.7实验结束后处理

清洁显微镜。

先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。

染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，晾干后备用。

6结果

（1）根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。

（2）列表简述两株细菌的染色结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。

思考题

（1）哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?

其中最关键的环节是什么?

（2）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?

（3）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?

乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?

（4）不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌?

（5）你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?

（6）为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?

（7）如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?

加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?

实验三培养基的配制与灭菌

1目的

（1）了解并掌握培养基的配制、分装方法。

（2）掌握各种实验室灭菌方法及技术。

2原理

培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。

由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异。

但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。

另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。

琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。

加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。

但多次反复融化，其凝固性降低。

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备培养菌使用。

一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。

3材料

3.1器皿其他用品

天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、棉绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。

3.2药品试剂

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3。

、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽汁、磷酸铵、5％NaOH溶液、5％HCl溶液。

4流程

称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。

5步骤

5.1培养基的制备

根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。

蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速。

5.1.2溶解

用量筒取一定量（约占总量的l／2）蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。

待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。

如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他原料，待完全融化后，补足水分。

5.1.3调节PH值

根据培养基对pH值的要求，用5％NaOH或5％HCl溶液调至所需pH值。

测定PH值可用PH试纸或酸度计等。

5.l.4融化琼脂

固体或半固体培养基需加入一定量琼脂。

琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分（水需预热）。

注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

5.1.5过滤分装

先将过滤装置安装好（图3—1）。

如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。

过滤后立即进行分装。

分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。

液体分装高度以试管高度的1／4左右为宜。

固体分装装量为管高的l／5，半固体分装试管一般以试管高度的1／3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的；50％为宜。

5.1.6包装、标签

培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。

在包装纸亡标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。

5.1.7灭菌

上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。

普通培养基为12l℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的：

笔二盅二飞需挣度一般以不超过试管长度的1／2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。

5.1.8倒平板

将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃，立刻倒平板（图3—3）。

5.2灭菌方法

灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。

本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。

加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。

蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。

在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。

5.2.1湿热灭菌法

（1）煮沸消毒法注射器和解剖器械等均可采用此法。

先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内加水煮沸。

对于细菌的营养体煮沸15～30min，对于芽孢则需煮沸1～2h。

（2）高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。

这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。

当蒸汽压力达到0.100MPa（1.05kg／cm2）时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。

一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3—4）。

（3）操作方法和注意事项

①加水：

打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。

立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。

注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。

②装料、加盖：

灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。

⑧排气：

打开排气口（也叫放气阀）。

用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。

④升压、保压和降压：

当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。

当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“o”时，打开放气阀。

注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。

⑤灭菌后的培养基空白培养：

灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。

5.2.2干热灭菌法

通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。

一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。

干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。

凡带有胶皮的物品、液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。

（1）灭菌前的准备玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。

常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：

平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。

（2）干燥箱灭菌将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。

将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。

如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30min即可。

温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。

用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。

（3）火焰灭菌直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。

对于接种环，接种针或其他金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。

此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。

6结果

（1）记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。

（2）试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。

7思考题

（1）制备培养基的一般程序是什么?

（2）做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意什么问题?

（3）灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义?

（4）试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。

（5）高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项?

实验四微生物的分离、纯化和接种

（一）微生物的分离、纯化

1目的

（1）了解微生物分离与纯化的原理。

（2）掌握常用的分离与纯化微生物的方法。

2原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。

平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。

其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。

微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落