感受态细胞制作和转化效率的研究.docx

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感受态细胞制作和转化效率的研究

天津农学院

毕业论文

中文题目:

感受态细胞制作和转化效率的研究

英文题目:

EstablishmentofCompetentCellsand

AnalysisofTransformationEfficiency

学生姓名于晓猛

系别动物科学系

专业班级2010级动物医学专升本班

指导教师李吉霞

成绩评定

2012年6月

摘要

质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞是分子克隆的关键步骤，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中频繁使用的一项重要的常规操作。

本研究通过复苏和扩增DH5α细菌，每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬，冰浴30min。

于4℃，离心回收。

每50ml初始培养物用2ml用冰浴的0.1mol/L的CaCl2重悬，100ul/份，-4℃放置24h。

转化流程为：

100ul感受态DH-5α+5ulPCI-Neo-hTERT冰上放置30min，42℃,热激90s，冰浴2min，加入400ulLB培养基，于37℃,50r/min振摇45min，之后取200ul涂布于含Amp琼脂板，37℃倒置培养12~16h。

次日观察，并随机选择阳性克隆，用LB液体培养基进行扩增，然后按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，检测转化效率。

结果表明，通过上述方案可以得到活力较好的感受态细菌，经质粒转化后，效率较高，可以应用于载体的转化。

关键词：

感受态细胞：

质粒：

转化

ABSTRACT

ItisakeystepforPlasmidtransformedintoEscherichiacolicellsinthemolecularcloning.TheimportantroutineoperationsarefrequentlyusedinthestudyofgenecloningandDNAlibraryconstruction.Inthisstudy,recoveryandamplificationofDH5αbacteria,per50mlbacteriumfluidwith10mlprecooling0.1mol/LofCaCl2resuspendedice-bath30min.In4℃,centrifugalrecovery.Initialcultureofeach50mlicebath0.1mol/LCaCl2resuspendedwith2ml.100ul/part,Thetransformationflowsareasfollows:

Firstly,theoperatorputsthe100ulcompetentofDH-5αand5ulPCI-Neo-hTERTontheicefor30minutes,keepsthetemperatureat42degrees,heatsitfor90secondsandice-bathesitfor2minutes,thenadds400ulLBcultureandshakesoutitatthespeedof50roundsperminutefor45minutesatthetemperatureof37degrees.Secondly,theoperatortakesout200ulontheagarplatewithAmp,thenconvertsandculturesitfor12to16hoursatthetemperatureof37degrees.Thennextday,theoperatorobservesit,choosesthepositivecloningatrandomandusestheLBliquidculturetoexpendit.ThentheoperatorextractstheplasmidaccordingtotheinstructionofthePlasmidExtractionKitanddetectsthetransformationefficiency.Itturnedoutthatnotonlybyusingabovemethodswecangetmanymoredynamiccompetentcells,butalsoshowsahigherefficiencywhichwouldappliedtovectorconversion.

Keywords:

CompetentCells;Plasmid;Transformation

感受态细胞制作和转化效率的研究

于晓猛

（天津农学院动物科学系）

1前言

分子生物学实验中,DNA重组技术和外源基因的表达是最为常用的研究手段之一[1]。

而体外构建的DNA重组子必须导入合适的受体细胞,才可以复制、增殖和表达。

载体与外源目的基因构成的重组载体可以通过转化直接导入受体细胞,从而实现基因在异源细胞的表达。

感受态细胞的制备是实现上述目标的一个重要环节,其制备质量的好坏直接影响后续工作的进行。

目前人们已经建立很多种感受态细胞的制备方法,最早的大肠杆菌感受态细胞制备的方法是Cohen[2]于1972年建立的。

该方法的主要原理是细菌通过冰冷的CaCl2低渗溶液处理后,加入待转化质粒DNA，经42℃短时间热冲击,细菌细胞可增加对该质粒DNA的摄入。

这一方法成为目前实验室制备感受态细胞的常规方法。

电转化法[3]是另外一种常用的细胞转化方法,其主要特征为速度快而且有很高的转化效率,每微克质粒DNA转化菌落数可高达109～1010个,但这一方法要求昂贵的设备,技术性较强。

1990年NishimuraA报道的一种镁盐法（Nishimura）制备感受态细胞的方法,该方法制备的感受态细胞效价高可达到108,但该方法操作仍显复杂。

1989年Chung等报道转化效率比CaCl2法要高的TSS法,而且不需要热休克。

同时还采用与TSS法操作完全相同,仅用等摩尔浓度MgSO4替换MgCl2的NewTSS法。

周国林等研究结果表明上述4种方法中TSS转化效率最高,其次为CaCl2法,再次为Nishimura法,最次为NewTSS法[4]TSS法对细胞的毒性较小,无需加入其他成分,转化方便,效率高,与其他方法相比便宜可靠,并可在-70℃下长期保存。

Tsen等发现大肠杆菌的某些菌株可以自然地在细胞质中与细胞外质粒低频率结合。

Chen等提出一种方便快捷的质粒转化大肠杆菌的方法,它几乎与传统的钙转化方法有相同的转化效率,而且这种方法大约只需2min.基于这种方法,建立了一个利用大肠杆菌感受态细胞转化质粒的系统,感受态细胞和质粒能长期储存,而且便于以后实验的扩增和利用。

一般实验室没有电穿孔技术所需要的特殊仪器，而利用氯化钙法将质粒重组入大肠杆菌细胞，操作方便、应用广泛，但是氯化钙法在实际操作中的转化效率常常不能完全满足试验的要求。

目前，实验室中常用的感受态细胞多为公司直接提供的，其价格昂贵，不适于普通基因克隆操作中的频繁使用[5]。

因此，对感受态细胞制备方法进行合理优化是提高转化效率的关键。

2材料与方法

2.1材料与仪器

2.1.1菌种及质粒

PCI-Neo-hTERT质粒、大肠杆菌DH5α由天津农学院动物科学系分子育种中心保存；胰蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素和小量质粒提取试剂盒等购自北京索来宝科技有限公司，DMarkerIII购自上海拜利生物。

2.1.2培养基

LB固体培养基的配方：

胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeastextract）5g/L，氯化钠（NaCl）10g/L，琼脂粉15g/L。

配制100ml的LB培养基加入1.5g琼脂粉，高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

大约10mL倒1个板子。

培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15min。

用封口胶封边，并倒置放于4℃保存备用。

LB液体培养基的配方：

胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。

配置100mL，高压灭菌后备用。

2.1.3仪器设备

恒温水浴箱（常州市国立设备实验研究中心，HH-S）；超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂，SW-CJ-LF）；高速冷冻离心机（Centrifuge,5424）；恒温摇床（哈尔滨东联生化仪器有限公司，HZQ-F100）；生化培养箱（SANYO，MCO-18AIC）。

2.2方法

2.2.1制备感受态细菌

以1:

100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25mlLB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h。

将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。

于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。

于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。

在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，-4℃放置24h。

（见图1-图2）

图1感受态制备中的冰浴

2.2.2DNA重组子的转化感受态大肠杆菌

实验流程如下所示。

100ul感受态细胞DH-5α+5ulPCI-Neo-hTERT（如图2）───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42℃,热激90S（如图3）───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃,50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h。

次日观察转化效率。

图2质粒结构图谱

图3感受态制备中的热应激

2.2.3质粒DNA提取

随机选择阳性克隆，用LB液体培养基进行扩增，然后按照质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，如图4~图8。

（1）取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

（2）向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液Ⅰ，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

注意：

如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低。

（3）向离心管中加入250ul溶液Ⅱ，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

注意：

混匀一定要温和，以免污染细菌基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，作用时间不要超过5min，以免质粒受到破坏。

（4）向离心管中加入350ul溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。

12000rpm离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。

注意：

溶液Ⅲ加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。