生理科学总论浙江大学教学信息化平台.docx
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生理科学实验总论
一、实验室介绍与安全教育
1、实验室及规章制度介绍。
2、遵守实验室规章制度：
安全使用水、电、气，防火。
实验善后处理等。
3、严格按操作规程操作：
仪器设备操作、手术器械使用、动物处理等。
注意自身安全。
4、违反实验室规章制度、实验操作规程所引发的事故，当事人负全责。
二、生理科学实验绪论
（一）课程的性质和任务生理科学实验是用实验方法观察正常、疾病和药物作用下的机体功能和代谢变化，研究这些变化的机制及规律的科学。
（二）生理科学实验课程教学重点动物实验的基本方法和技术、实验数据采集和统计分析、实验报告的撰写。
（三）教学要求
1、课前预习进入实验室就应清楚自己应做什么？
该怎么做？
需要什么？
（1）自主学习相关理论了解实验的目的、要求和操作程序，充分理解实验设计的原理。
（2）设计好实验原始记录、数据图表
1）实验名称、实验日期、时间、环境温度、实验成员。
2）受试对象动物种类、品系、编号、性别、体重、健康状况、离体器官名称。
3）实验仪器主要仪器名称、规格型号、生产厂商。
4）药物试剂名称、来源（厂商、剂型、规格、含量）。
5）方法步骤分组、动物处理（麻醉、手术、刺激、给药途径、剂量、时间和间隔，指标的测量方法等）。
6）观察指标名称、单位、数据形式、记录曲线的标注。
（7）设计实验记录图表：
数据表格、线图等。
7）数据处理实验数据的整理，统计方法与结果。
（3）熟悉实验基本操作技术
（4）课后作业下周实验的预习、设计制作实验流程、原始数据记录表和统计表。
熟悉神经干标本制备（视频：
10.71.149.149）、RM6240多道生理信号采集处理系统的基本操作（下载软件和数据练习：
10.71.149.149）。
讨论问题：
神经干双相动作电位是如何形成的？
双相动作电位的正、负相振幅和时间受哪些因素影响？
如何用实验的方法验证上述两问题。
2、课堂实验要求把实验室视为“手术室”。
（1）明确分工，相互合作，严格按操作规程操作，全面观察，认真如实的记录实验数据。
（2）积极参与课堂讨论。
（3）爱护实验仪器、器械和实验动物，节约实验物品。
实验结束应及时清洁整理实验台、实验器具，清点归还借用物品，登记仪器使用记录，按规定处理动物尸体。
（4）未经指导教师同意，不得离开实验室。
值日同学2组做好卫生值日。
组长负责本组卫生，班长督查。
3、课后要求自主分析实验结果，自主撰写实验报告并按时提交。
4、成绩评定出席：
实验表现（4）、实验习惯
（1）、合作情况
（1）、回答问题
（1）、实验报告（3）；不出席得0分。
三、微机生物信号采集处理系统基本知识
微机生物信号采集处理系统是集生物信号放大、数据采集、数据处理等功能于一体的多功能生理科学实验仪器。
（一）生物信号的拾取
1、生物信号反映机体的功能和代谢状态的信息。
（1）化学信息：
各种生命物质及代谢产物等的化学特性。
（2）生理信息：
血压、呼吸、肌肉张力、脉搏、视觉、情绪等。
（3）物理信息：
生物电、生物声、生物光、生物磁等。
2、信号拾取
（1）生理信号的拾取血压、张力、呼吸、流量等生理信号拾取器件为换能器
1）生理信号基本特性低频（直流）、低幅。
2）换能器是一种能将机械能、化学能、光能等非电量形式的能量转换为电能的器件或装置。
3）换能器工作原理利用材料的导电率或电阻率应变原理。
（2）生物电信号的拾取心电图、脑电图、皮肤电、细胞电位等生物电信号的拾取器件为电极
1）电极是将离子电流转换成电子电流的一种器件。
2）生物电基本特性低频，低幅，源阻抗大。
（二）微机生物信号实时采集处理系统面板
1、输入通道四个信号输入通道。
2、刺激输出。
3、12导联心电图。
（三）微机生物信号处理系统的构成
1、系统构成传感器→高通滤波器→生物放大器→低通滤波器→A/D→计算机。
2、生物信号采集处理系统的信号输入方式
（1）双端输入方式（差动输入）信号从两个输入端输入仪器。
测定的是两点之间的电位，差抗干扰能力强。
（2）单端输入方式信号从一个输入端输入仪器。
测定的是对地电位，抗干扰能力差。
（四）生物信号采集处理系统的参数设置
1、采样频率每秒采集数据的个数，单位为Hz。
（1）模-数转换是将模拟信号转换为数字信号（analog-to-digitalconverter，A/D）；数模转换是将数字信号转换成模拟信号（digital-to-analogconverter,D/A）
（2）采样定律（samplingfrequency）采样频率大于等于信号频谱中的最高频率的10倍。
2、通道模式通道记录的信号类型。
正确设置有利于测量时指标跟进。
3、扫描速度数据区水平时间标尺或运动速度。
4、灵敏度仪器对信号放大的程度。
5、交流、直流设置
（1）信号的交流、直流特性
①交流信号（directcurrent，DC）振幅和方向随时间变化的信号为交流信号。
②直流信号（alternatingcurrent，AC）振幅和方向不随时间变化的信号为直流信号。
③交变信号生物信号中既有直流成分又有交流成分的信号。
（2）交直流信号的耦合
①直流耦合输入方式电信号不通过耦合器件（电容器或电感器）直接送入放大器的输入端进行放大的方式。
②交流耦合输入方式电信号经耦合器件（如电容器）送入放大器的输入端进行放大的方式。
③细胞外引导的生物电采用交流耦合输入方式，细胞内引导的生物电和应变式换能器采用直流耦合。
（7）生物信号采集处理系统的滤波功能
①干扰信号
a、生物信号与干扰信号在频率上重叠50Hz市电干扰信号，供仪器设备、照明等使用的电源，其50Hz及其谐波通过仪器、辐射等途径干扰生物电信号，其干扰信号的频率与生物电的频率重叠。
b、生物电信号的相互干扰肌电、皮肤电干扰心电，心电、皮肤电干扰脑电等。
c、电极极化引起的电极电位电极极化电压数百mV，电极电位为直流成分，用直流放大器时，信号直流成分被干扰，在高放大倍数时，使放大器饱和。
②信号的频率特性
任何一个信号都可以用一正弦函数来描述。
即可以由一正弦波和其谐波叠加而成。
U（t）=AΣansin（2πfnt+φn）其中重复周期：
T，基频：
1/T，fn=n/T
③高通滤波器（high-peaker）用于衰减低频信号。
频率高于转折频率（fL）的信号被放大，频率低于fL的信号被衰减。
fL=1/2。
称为时间常数（timeconstant），的单位为秒，由来：
④低通滤波器（low-passfilter）用于衰减高频信号。
频率低于转折频率（fH）的信号被放大，频率高于fH的信号被衰减。
6、仪器的零点校正和定标
（1）零点校正消除空载偏移。
①换能器零点漂移、仪器零点漂移：
时漂，温漂。
②零点校正：
实验前空载零点校正。
在一个实验记录过程中，零点校正不能再次使用。
（2）定标量的标定和单位转换。
实验过程中不能定标。
①张力换能器定标砝码定标。
②血压换能器定标水银检压计或压力计定标。
③呼吸流量换能器定标用容积积分法定标。
④电信号定标信号发生器定标。
7、刺激器参数设置
（1）刺激器参数
1）强度输出脉冲的电压或电流的强度。
脉冲电压范围为0~50V，0~10V内以步长0.02V增减，10~50V内以步长0.05V增减。
脉冲电流范围为0~10mA。
2）波宽单个脉冲（方波）高电平的持续时间，即刺激的持续时间，波宽可在0.1~1000ms调节。
3）波间隔连续脉冲刺激，刺激脉冲之间的时间间隔，波间隔在0.1~1000ms调节。
波间隔与波宽之和的倒数可理解为刺激频率，调节范围为1~3000Hz。
4）脉冲数刺激器在设定的时间内发出刺激脉冲的个数。
5）延迟延迟是指刺激器启动到刺激脉冲输出的延搁时间。
在触发同步记录时，延迟可用来调节反应信号在屏幕上的水平位置。
6）主周期刺激器以周期为时间单位输出序列脉冲。
（2）刺激模式将刺激脉冲按一定的主周期、脉冲数、波间隔等参数编组成某种特定脉冲序列，这种特定脉冲序列称刺激模式。
（3）触发（同步）系统采集信号由刺激器触发。
（五）生物信号采集处理系统操作
1、参数通用设置根据记录信号的幅度、频率等性质设置相应的采用频率、通道模式、灵敏度、时间常数、滤波频率、刺激模式、刺激参数、记录方式等。
2、参数快捷方式设置打开实验菜单，选择实验项目来完成参数设置。
3、数据测量
（1）实时测量系统实时监测显示实验对象的主要观察指标，同时采集和保存信号数据。
（2）静态测量系统在数据记录完毕后，对数据进行分析。
四、实验动物
实验动物（1aboratoryanimal）是指经人工培育，对其携带微生物实行控制，遗传背景明确，来源清楚，可用于科学实验、药品、生物制品的生产和鉴定及其他科学研究的动物。
实验用动物（animalforreseach）是指一切能用于科学实验的动物，其中除实验动物外，还包括野生动物、经济动物和观赏动物。
（一）善待实验动物
人类是自然的产物，人类的生存和发展离不开自然，人类在追求自身发展的过程中，对自然要有敬畏之心，要善待自然及自然所孕育的生命。
医学研究离不开实验动物和动物实验，可以毫不夸张的讲，人类今天的医学成就是建立在实验动物和动物实验基础上的。
人类在利用实验动物进行科学实验，获得科学研究成果的同时，避免人类自身受到痛苦或伤害，而实验动物却不可避免地受到了生理或心理的伤害，甚至死亡。
维护动物福利，是促进人与自然和谐发展的需要。
为此，世界多数国家制定了善待实验动物的法律法规，我国科技部于2006年发布了《关于善待实验动物的指导性意见》，意见提出善待实验动物的主要要求和措施如下：
1．使用实验动物进行动物实验应有益于科学技术的创新与发展；有益于教学及人才培养；有益于保护或改善人类及动物的健康及福利或有其他科学价值。
2．倡导“减少、替代、优化”的“3R”原则，科学、合理、人道地使用实验动物。
3．使实验动物免遭不必要的伤害、饥渴、不适、惊恐、折磨、疾病和疼痛，保证动物能够实现自然行为，受到良好的管理与照料，为其提供清洁、舒适的生活环境，提供充足的、保证健康的食物、饮水，避免或减轻疼痛和痛苦等。
4．不得戏弄或虐待实验动物。
在抓取动物时，应方法得当，态度温和，动作轻柔，避免引起动物的不安、惊恐、疼痛和损伤。
在日常管理中，应定期对动物进行观察，若发现动物行为异常，应及时查找原因，采取有针对性的必要措施予以改善。
5．实验动物应用过程中，应将动物的惊恐和疼痛减少到最低程度。
实验现场避免无关人员进入。
6．在对实验动物进行手术、解剖或器官移植时，必须进行有效麻醉。
术后恢复期应根据实际情况，进行镇痛和有针对性的护理及饮食调理。
7．保定实验动物时，应遵循“温和保定，善良抚慰，减少痛苦和应激反应”的原则。
保定器具应结构合理、规格适宜、坚固耐用、环保卫生、便于操作。
在不影响实验的前提下，对动物身体的强制性限制宜减少到最低程度。
8．处死实验动物时，须按照人道主义原则实施安死术。
处死现场，不宜有其他动物在场。
确认动物死亡后，方可妥善处置尸体。
9．在不影响实验结果判定的情况下，应选择“仁慈终点”，避免延长动物承受痛苦的时间。
10．灵长类实验动物的使用仅限于非用灵长类动物不可的实验。
除非因伤病不能治愈而备受煎熬者，猿类灵长类动物原则上不予处死，实验结束后单独饲养，直至自然死亡。
（二）常用实验动物的种类
1、蟾蜍（Toad）蟾蜍属两栖动物，其一些基本生命活动与哺乳动物近似，其离体组织和器官所需的生理环境比较简单（无须供氧和恒温）。
蟾蜍常用于神经生理、肌肉生理、心脏生理，微循环、水肿等实验。
2、小鼠（Mouse）小鼠被广泛的用于生物学、医学、兽医学、生理学、遗传学、药理、毒理、肿瘤、放射性、食品、生物制品等的科研、生产和教学。
3、大鼠（Rat）大鼠应用于生理学、药理学、免疫学，内分泌学、神经生理、营养学、传染病、肿瘤和肝外科等的研究。
4、豚鼠（Guineapig）常用于免疫学、微生物学、传染病学、听觉生理、实验性坏血症等研究。
豚鼠组胺受体表达丰富。
5、家兔（Rabbit）常用于免疫学、肿瘤、实验生理学、生殖生理、遗传性疾病等的方面的研究，制造生物制品。
减压神经在颈部独立成一支，用于窦弓压力感受性反射研究。
6、猫（Cat）猫的神经系统和循环系统较发达，与人很相似。
常用于神经、循环和呼吸方面等的实验。
7、犬（Dog）常用于基础医学、药理、毒理学、实验外科学、行为学、肿瘤学等方面研究。
8、猪（Pig）常应用于皮肤烧伤、肿瘤学、免疫学、心血管及糖尿病、遗传性和营养性疾病、移植、外科手术等方面的研究
9、猴（Monkey）用于传染病学、药理学和毒理学、生殖生理、口腔医学）营养、代谢、行为学和高级神经活动研究及老年病、器官移植、眼科、内分泌病和畸胎学、肿瘤学
（三）实验动物的分类
1.按遗传学特征分类
（1）近交系近交系一般是指采用20代以上全同胞兄弟妹妹或亲子（子女与年青的父母）进行交配，而培养出来的遗传基因纯化的品系。
（2）杂交一代由两个近交系杂交产生的子一代称为杂交一代。
它既有近交系动物的特点，又获得了杂交优势。
（3）封闭群在同一血缘品系内，不以近交方式，而进行随机交配繁衍，经五年以上育成的相对维持同一血缘关系的种群。
（4）突变品系在育种过程中，由于单个基因的突变，或将某个基因导入，或通过多次回交“留种”，而建立一个同类突变品系，此类个体中有具同样遗传缺陷或病态。
（5）非纯系即一般任意交配繁殖的杂种动物。
杂种动物具有旺盛的生命力，适应性强，繁殖率高，生长快，易于饲养管理。
个体差异大，反应性不规则，实验结果的重复性差。
但其中包含有最敏感的与最不敏感的两种极端的个体。
2、按微生物学分类
实验动物所带的一些病原体不但影响动物本身，更重要的是影响了试验的准确性。
为了保证实验的准确性、可重复性，必须对实验动物所携带的其他生物体加以控制。
（1）普通动物（Conventionalanimals,CV）又称一级动物，是微生物控制要求中最低的一个级别的动物，要求不带有动物烈性传染病和人畜共患病原体。
（2）清洁动物（Cleananimals,CL）又称二级动物，除不带有普通动物应排除的病原体外，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。
（3）无特殊病原体动物（Specificpathogensfreeanimal，SPF动物）SPF动物又称三级动物，除不带有普通动物、清洁动物应排除的病原体外，还应排除有潜在感染或条件性致病的病原体，以及对实验干扰大的病原体。
（4）无菌动物（Germfreeanimals，GF）和悉生动物（Gnotobioticanimals，GN）四级动物。
无菌动物是指采用当前的技术手段无法在动物体表、体内检出一切其他生物体。
（四）实验动物的种、系选择。
1、实验动物的种属选择选择对实验处理因素敏感的动物。
不同种属的动物对于同一实验处理因素的反应不尽相同。
医学研究尽可能选择其结构、功能和代谢特点接近于人类的动物。
2、实验动物品系的选择同一种属动物的不同品系，对同一实验处理因素的反应也有很大差异。
3、实验动个体的选择同一品系的实验动物，对同一刺激物反应存在着个体差异。
年龄、体重、性别、生理状态和健康情况不同，往往导致对同一刺激的不同结果。
五、动物实验技术
动物实验技术是进行动物实验时的各种实验方法和操作技术
（一）实验方法
1、急性动物实验方法
特点：
短时间内观察机体和器官的功能和代谢变化。
优点：
时间短,效率高,条件易控制。
缺点：
非自然生活状态。
2、慢性动物实验方法
特点：
较长时期内观察机体的的功能和代谢变化。
优点：
接近自然生活和生理状态，结果比较真实。
缺点：
时间长，条件难控制，干扰因素多。
（二）动物实验操作技术
1、实验器械
（1）蛙类手术器械
（2）哺乳类手术器械
（3）其他
2、动物实验基本操作方法
（1）蟾蜍的基本操作
（2）小鼠的基本操作
（3）家兔的基本操作
3、课后作业：
观看手术器械使用和蟾蜍坐骨神经干制备视频。
（三）动物麻醉
1、局麻局部麻醉指在用药局部可逆性地阻断感觉神经冲动的发出和传导，在动物意识清醒的条件下用药局部感觉消失。
2、全麻全麻可使动物意识和感觉暂时不同程度的消失。
麻醉动物肌肉充分松弛、感觉完全消失、反射活动减弱。
3、麻醉的基本原则
（1）不同动物个体对麻醉药的耐受性是不同的。
因此，在麻醉过程中，除参照一般药物用量标准外，还必须密切注意动物的状态，以决定麻药的用量。
（2）麻醉的深浅可根据呼吸的深度和快慢、角膜反射的灵敏度和有无四肢和腹壁肌肉的紧张性以及皮肤夹捏反应等进行判断。
当呼吸突然变深变慢、角膜反射的灵敏度明显下降或消失，四肢和腹壁肌肉松弛，皮肤夹捏无明显疼痛反应时，应立即停止给药。
（3）静脉注药时应坚持先快后慢的原则，一般给药应先一次推入总量的2/3，待观察动物的行为，若已达到所需的麻醉深度，则不一定全部给完所有药量。
动物的健康状况、体质、年龄、性别也影响给药剂量和麻醉效果，因此实际麻醉动物时应视具体情况对麻醉剂量进行调整。
避免动物因麻醉过深而死亡。
（4）补充麻醉实验过程中如麻醉过浅，可临时补充麻醉药，但一次注射剂量不宜超过总量的1/5，且须经一定时间后才能补充，如戊巴比妥钠须在第一次注射后5分钟，苯巴比妥钠须在第一次注射后30分钟以上。
4、常用麻醉剂
麻醉剂
剂量
维持时间
副作用
戊巴比妥钠
30~50mg/kg
2~4h
抑制呼吸、血压降低
氨基甲酸乙脂
1g/kg
4~6h
抑制呼吸，浅表血管扩张
氯醛糖
55~80mg/kg
3~4h
刺激动物易引起抽搐
水合氯醛
250~350mg/kg
2~3h
抑制呼吸、血压降低
六、实验设计
专业设计按照专业思路考虑，确定实验技术路线和方法。
统计学设计按照统计学原理和方法，控制实验误差，改善实验有效性，保证专业设计布局的合理性和实验结果的可靠性。
（一）实验设计的三大因素
1、受试对象（实验动物）
（1）对施加处理的敏感性。
（2）动物的生物学特性要接近人类。
（3）动物的种属极其生理特点适合于复制稳定可靠模型。
（4）其它如营养、健康、年龄、体重、性别。
2、处理因素（设置处理因素）
（1）主要因素实验特定设计的处理因素。
（2）处理因素的强度（水平）。
（3）处理因素的标准化数量、质量的一致性（药物成分、厂家、批号、给药方式、次数、剂量、间隔等）
（4）控制非处理因素的干扰
3.实验效应（实验指标）
（1）实验指标分类（实验方法）
性质：
机能学方法，形态学方法等。
学科：
生理学方法，生物化学方法等。
（2）实验指标在实验观察中用于反映研研对象中某些可被检测仪器或研究者感知的特征和现象标志。
①特异性指标应特异地反映所观察的事物（现象）的本质，即指标特异地反映某一特定的现象，不致于与其他现象的混淆。
如高血压中的血压尤其是舒张压就可作为高血压病的特异指标。
②客观性最好选用可具体数值或图形表达的指标（如脑电图、心电图、血压和呼吸描记、化验检查等等）。
因为主观指标（如肝脾触诊、目力比色等）易受主观性因素的影响而造成较大的误差。
③重现性一般来说，客观性指标在相同条件下可以重现，重现性高的指标一般意味着偏性小，误差小，从而较正确地反映实际情况。
重现性小可能与仪器稳定性、操作误差，受试动物的机能状态和实验环境条件影响有关。
若非这些因素影响而重现性小的指标不宜采用。
④灵敏性指标测量的技术方法或仪器灵敏是极其重要的。
方法不灵敏，该测出的变化测不出来，就会得出“假阴性结果”，仪器不精密，所获阴性数值不真实。
⑤可行性尽量选用即灵敏客观，又切合本单位设备和研究者技术实际的指标。
⑥认可性即被以往研究所采用和普遍认可的指标，并有文献依据。
自已创立的指标必须经过专门的实验鉴定。
（3）实验资料
①计量资料有连续量变的资料。
实验效率较高，实验要求的例数可较少，统计描述主要为⎺x±s，统计检验主要为方差检验、t检验。
②计数资料有或无（阴性、阳性）
实验效率较低，实验要求的例数较多，统计描述主要为率，统计检验主要为χ2检验。
（4）数据的测量与分析
①最大效应分析取最大效应的数据进行比较分析。
②时间效应分析按一定的时序测量各时点的效应数据，按对应时点等比较分析。
（二）实验设计的三大原则
1.对照原则
比较的基准就是对照。
用对照组的方法凸显实验处理的效应，并有效地消除各种非处理因素的干扰所造成的误差。
实验组与对照组要遵循齐同对比的原则。
齐同对比：
要求在相互比较的各组间，除了对要求的特定的处理因素外，其余条件，特别是可能影响研究结果的条件要尽量相同。
（1）空白对照不对受试对象作任何处理。
（2）假处理对照（实验对照）不进行实验特定的处理，其余处理相同。
（3）自身对照对照与处理在同一受试对象中进行。
（4）标准处理（阳性对照）用现有的标准方法或典型同类药物作为对照。
（5）相互对照处理组间互为对照。
（6）历史对照用以往的研究结果或历史文献资料为对照（齐同性问题），一般不易采用。
2.随机原则随机是使每个实验对象在接受不同（分组）处理时具有相等的机会，减少抽样误差。
3.重复原则重复是指可靠的实验应能在相同条件下重复出来（重现性），这就要求实验要有一定的例数（重复数）。
重复的含义是重现性和重复数。
（1）重现性可用统计学中显著性检验的值来衡量：
p<0.05表示差异在统计学上有显著意义，不可重现的概率小于5%，重现性好。
p<0.01表示差异在统计学上有非常显著性意义，不可重现的概率小于等于1%,重现性非常好。
p>0.05表示差异在统计学上无显著意义，不可重现的概率大于5%，重现性差。
（2）重复数（实验例数）
重复数过少不行，不能反映真实情况；重复数过多也不必要，浪费。
七、生理科学实验常用统计
（一）计量资料的统计描述和显著性检验
1、平均数是一组观察值（变量值）的平均水平或集中趋势。
2、标准差是一组个体变量间的变异（离散）程度的大小。
3、显著性检验的基本步骤
（1）建立“检验假设”假设所比较的样本来自相同的总体。
（2）选择和计算统计量如选择t值为统计量。
（3）确定概率用计算和查t值表确定P值。
（4）判断结果P>0.05差别无显著性，0.05>P>0.01差别有显著性，P<0.01差别有高度显著性。
4、显著性检验
（1）方差检验在完全随机设计中，各样本是相互独立的随机样本，数据均服从正态分布，相互比较的各样本的总体方差相等（即具有方差齐性），两组及以上样本均数差别的显著性检验使用方差分析，若实验因素仅有一个，称为单因素方差分析。
（2）t检验单因素方差分析中，当处理因素水平等于2时，组间均数比较采用t检验。
①配对资料两组配对（实验前后）资料均数的比较。
②两样本均数的比较两组均数的比较。
（二）计数资料的统计和显著性检验
1、率率是一种表示在一定条件下某种现象实际发生例数与可能发生该现象的总数比，用来说明某种现象发生的频率。
2、标准误率和比的标准误是抽样造成的误差，表示样本百分率和比与总体百分率和比之间的差异。
3、两样本率差异的显著性检验
χ2检验适用于2组或2组以上的计
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