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土壤微生物的分离纯化与鉴定
摘要
利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化，得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌。
根据菌落形态观察，革兰氏染色结果，芽孢有无及位置，运动性以及一系列的生理生化试验的结果，对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群。
关键词
土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养
前言
在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
群落是不同种类微物的混和体。
为了生产和科研的需要，人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株。
这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术。
纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成。
实验目的
1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；
2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；
3.学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；
4.根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌。
实验原理
一、经典分类鉴定方法
以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程，因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察，染色，生理生化试验，免疫学试验等对其进行逐步定位。
二、现代分类鉴定方法
1．微生物遗传型的鉴定
（1）DNA碱基比例的测定（G+C）mol%以下为该方法的关键因素：
*解链温度法（Tm值）
*（G+C）mol%值只能做否定判断；
*（G+C）mol%值差别>5，属不同的种；
差别>10，属不同的属。
（2）核酸分子杂交法
*DNA-DNA分子杂交原理：
DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性。
结论：
IDNA同源性≥60%（同种）
IIDNA同源性≥70%（同亚种）
IIIDNA同源性60~70%（不同亚种）
IVDNA同源性20~60%（同属）
（3）16srRNA作为细菌进化的计时器
本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制，主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主。
实验整体思路：
在确定取样环境之后，对微生物原样进行梯度稀释，产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；
通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化，用平板划线法多次划线得到纯种；
对得到的纯种细菌染色并镜检，利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；
根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；
运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；
根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位。
实验仪器及材料
1.土样：
18号土样
2.试剂及培养基
a）培养基：
果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基
b）试剂：
草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等
3.仪器
锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等
实验步骤
A.细菌的筛选，分离纯化及鉴定
1.细菌的筛选
a）土样处理
i.配制生理盐水：
在烧杯中配置％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；
ii.加土样：
冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。
b）果胶酶菌种筛选
i.梯度稀释：
用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；
ii.涂布：
配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；
iii.培养：
将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；
iv.果胶酶透明圈平板检测：
取10-1涂布平皿，用％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；
v.菌落描述：
取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录；
2.细菌的分离纯化
a）
划线分离：
制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：
先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：
不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。
操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；
b）纯种保藏：
再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。
3.细菌的基本形态及运动性鉴定
a）纯种果胶酶水解能力的测定
配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上（注意：
点种的量不宜过多，以3～4个为宜），在30℃培养箱中培养1～2天，取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈的大小
b）简单染色步骤
i.涂片
取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）
ii.干燥与固定
涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；
iii.染色
将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色
iv.水洗
倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；
v.干燥
用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；
vi.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。
c）革兰氏染色步骤
i.涂片
先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。
分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。
ii.初染
滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色后水洗；
iii.媒染
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗；
iv.脱色
先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；
v.复染
先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染后水洗；
vi.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。
分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。
d）芽孢染色步骤
i.涂片，加热干燥及固定
在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。
然后按照常规方法加热干燥及固定；
ii.孔雀绿加热染色
用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；
iii.水洗
水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。
具体水洗按常规方法进行；
iv.复染
用%番红水溶液复染2min；
v.水洗并干燥
按常规方法水洗后自然干燥；
vi.镜检
先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。
e）半固体穿刺法观察细菌运动性
i.配制培养基
配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；
ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近（但勿触及）试管底,然后循原路退出。
如图所示：
iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。
4.细菌的生理生化试验
a）淀粉水解试验
i.培养基制备
配制淀粉培养基，灭菌后将冷却至50℃左右，无菌操作制成平板；
ii.接种
用记号笔将平板划成四部分，将所鉴定的菌种在不同位置点种。
（注：
由于四种菌对淀粉的水解程度不同，为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠，宜采用点种的方式，如下图）。
接种完成后贴好标签；
iii.培养
将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时。
b）葡萄糖发酵试验
i.培养基配制
将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。
ii.接种
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。
取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。
iii.培养
将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。
c）乳糖发酵试验
i.培养基配制
将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。
ii.接种
用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名。
取盛有乳糖发酵培养基的试管2支，接种鉴定菌，另一支作为对照。
iii.培养
将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。
d）吲哚试验
i.培养基的配制
将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。
ii.接种
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。
取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。
iii.培养
将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。
e）甲基红试验
i.培养基的配制
将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌，冷却至室温。
ii.接种
用记号笔在各试管上标明所接种的菌名。
取盛有蛋白胨水培养基的试管2支，接种鉴定的菌种。
iii.培养
将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时。
5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定
取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个，观察不同形态菌落的数目以及总菌落数，并记录，求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目。
根据以上细菌的形态，革兰氏染色结果，芽孢的位置，运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定。
B.霉菌的筛选，分离纯化及鉴定
1.霉菌的筛选
a）涂布
配制几丁质酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却至不烫手，无菌操作加链霉素（1mL/1000mL）倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上100、10-2两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；
b）培养
将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；
2.霉菌的分离纯化
a）
划线分离：
制备几丁质酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取长出的菌种，第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：
先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：
不能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。
操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；
b）再配制一份PDA培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。
3.小室培养法鉴定霉菌
a）灭菌准备
制作4个平皿，在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片，再放一U形玻棒，其上放一洁净载玻片和四块盖玻片，盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油，加塞包好；最后取10mL移液管两支用牛皮纸包好。
b）灭菌
将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min（由于培养基中有葡萄糖，为防止由于高温而使糖发生糊化而变质，灭菌温度不宜过高）。
c）制作琼脂薄片
在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL注入两个灭菌空平皿中，使之凝固成薄层。
在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格，通过无菌操作，用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块。
（注：
解剖刀使用前应先在酒精中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，冷却后再进行切割操作）
d）接种
在无菌操作台上，先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上，然后用解剖刀取一小块儿琼脂块，置于载玻片上（注意：
镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡，灼烧冷却后再进行下一步的操作），用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子，分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上。
最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml灭菌的20%的甘油（用于保持平皿内的湿度），盖上皿盖并贴标签，每一种菌接种两个小室。
e）恒温培养
将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天。
f）镜检
在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片，用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子，根据真菌手册对所得的菌进行鉴定。
实验结果
A.细菌部分
倍稀释平板的细菌种类和数目
表1细菌种类及数目的测定
平板1
平板2
平板3
平均数
种类数
6
8
8
-
菌落数
15
24
28
22
1g土壤中细菌的总数目：
22×1000×100/×10）=×106（个）
表2目标菌菌落形态描述
样品来源
大小
颜色
干湿度
边缘
表面
土壤
菌落中
乳白色
湿润
整齐
光滑无突起
目标菌
2.水解圈的检测（见图）：
表3水解圈大小测量数据
水解圈
水解圈1（cm）
水解圈2（cm）
水解圈3（cm）
平均（cm）
水解圈
3.细菌的基本形态（见图）
图1目标菌的简单染色
4.细菌的革兰氏染色（见图）
由图对比可知，目标菌为革兰氏阳性菌
5.芽孢染色结果：
项目
菌种
芽孢形状
芽孢着生位置
芽孢囊形状
目标菌
椭圆形
位于菌体中央或稍偏
圆形不膨大
芽孢
图5目标菌芽孢染色结果
6.生理生化试验
a）淀粉水解试验:
表1.淀粉水解试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
菌种
阴/阳性
结论
目标菌
+
目标菌可水解淀粉
淀粉水解圈
淀粉水解圈
图6淀粉水解实验结果
b）葡萄糖发酵培养基：
表2.葡萄糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
菌种
目标菌
空白
颜色变化
紫色
紫色
是否产气
否
否
阴/阳性
—
-
结论
该菌不分解葡萄糖或分解不产酸不产气
对照组
c）乳糖发酵培养基:
表3.乳糖发酵试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
菌种
目标菌
空白
颜色变化
紫色
紫色
是否产气
否
否
阴/阳性
—
-
结论
该菌不分解乳糖或分解不产酸不产气
对照组
图8乳糖酵解实验室意图
d）吲哚试验:
表4.吲哚试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
菌种
目标菌
是否产生红色环状物
是
阴/阳性
+
结论
目标菌可以分解色氨酸为吲哚
e）甲基红试验:
表5.甲基红试验结果（“+”表示阳性，“—”表示阴性）
菌种
目标菌
颜色变化
变黄
阴/阳性
-
结论
该菌转化有机酸为非酸性末端产物
图9吲哚试验示意图
7.半固体穿刺
由图可知，该细菌具有运动性，则具有鞭毛。
B.霉菌部分
1.霉菌分离纯化所得单菌落示意图：
2.
图3霉菌1的形态（10×4）
小室培养霉菌的形态：
图9小室培养玻片观察
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