第十二单元第2讲 微生物的培养与应用.docx

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第十二单元第2讲微生物的培养与应用

[课时作业·巩固提升]　　　　　　　　　　　　　　　单独成册　方便使用

1．某同学欲利用所学习的微生物培养知识，通过实验来证明痰液中含有细菌，来倡导同学们不要随地吐痰，以下是他进行的实验内容。

回答下列问题：

（1）制备供细菌生长的培养基。

实验室常用牛肉膏蛋白胨固体培养基，制备该培养基的步骤是：

计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，其中灭菌常用的方法是________，在溶化之后、灭菌之前还需要调________。

（2）琼脂是一种从红藻中提取的多糖，在培养基中常常加入一定量的琼脂，添加琼脂的目的是___________________________________。

（3）为了使实验结果更有说服力，该同学设置了空白对照组和若干实验组，其中对照组的作用是__________________________________。

（4）微生物接种的方法有稀释涂布平板法和平板划线法，其中平板划线法并不适合用于微生物的计数，其主要原因是_______________________________

________。

某同学利用稀释涂布平板法来统计样品中细菌的数目，他在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为163，则每毫升痰液样品中的细菌数是（所用稀释液的体积为0.2mL）_________________________________。

解析：

（1）对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法。

（2）在培养基中添加琼脂是作为凝固剂。

（3）设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

（4）平板划线法在起初划线时，微生物菌体仍集中在一起，因此，不能将菌体充分分离开，许多菌落并不是由单个菌体所形成的，因而，该方法不适合用于微生物计数。

利用稀释涂布平板法计数每毫升痰液样品中的细菌数为163÷0.2×104＝8.15×106（个）。

答案：

（1）高压蒸汽灭菌法　pH　

（2）作为凝固剂，使液体培养基凝固为固体培养基　（3）排除实验组中非测试因素对实验结果的影响（合理即可）　（4）不能将菌液中的微生物充分分离开来　8.15×106个

2．（2020·河南郑州质检）常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，科学家欲从果园的葡萄上或土壤中分离这种酵母菌。

操作如下：

（1）制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，其主要原因是_____________________________________________________。

获得纯净培养物的关键是________。

（2）纯化菌株时，通常使用的划线工具是________。

在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是___________________。

划线的某个平板经培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落，第二划线区域的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。

造成划线无菌落可能的操作失误是__________________________________________________。

（3）将自然界中采集到的葡萄带回实验室，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后将瓶中的液体用涂布器涂布接种于以木糖为唯一________的固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间，获得能利用木糖的多个酵母菌________。

实验中所用培养基按功能属于________培养基。

（4）若要检测土样中的酵母菌含量，应采用________法。

然后，将1mL土壤溶液分别稀释10倍和100倍，各在3个平板上分别接入每种稀释度的稀释液0.1mL，经适当培养后，6个平板上的菌落个数分别为59、57、58、2、7和5，据此可得出每升土壤溶液中的活菌数为________。

解析：

（1）将平板倒置的原因是可以防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。

防止外来杂菌入侵是获得纯净培养物的关键。

（2）利用平板划线法纯化菌株时，通常使用的划线工具是接种环。

在第二次及以后划线时，总是从上一次的末端开始划线，这样做的目的是将聚集的菌落逐步分散以获得单个菌落。

造成划线无菌落的操作可能有两种，一是接种环灼烧后未冷却导致菌种死亡；二是划线时未从第一区域末端开始。

（3）木糖属于糖类，含有C、H、O，可以作为微生物培养中的碳源。

在适宜的条件下培养一段时间，可在固体培养基上获得多个酵母菌菌落，所用的培养基属于选择培养基。

（4）检测酵母菌的含量需要对酵母菌进行计数，应采用稀释涂布平板法。

统计时应选取菌落个数在30～300的平板，故每升土壤溶液中的活菌数为（59＋57＋58）÷3×10÷0.1×1000＝5.8×106。

答案：

（1）可以防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染　防止外来杂菌入侵　

（2）接种环　将聚集的菌落逐步分散以获得单个菌落　接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始（写出一项即可）　（3）碳源　菌落　选择　（4）稀释涂布平板　5.8×106

3．某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计单位体积内的活菌数目。

按照培养基的配方称取，并将各种物质溶解后，用蒸馏水定容、灭菌，制成固体培养基备用。

回答问题：

（1）在配制培养基时，需加入________作为唯一的氮源，该培养基从功能上看属于________培养基，配制好的培养基应用________法灭菌。

（2）培养分解尿素的细菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。

对于固体培养基应采用的检测方法是__________________________________________。

（3）若要统计土壤样品中尿素分解菌的数目，宜采用________法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目就能大约推测出样品中的活菌数。

一同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为24.6，则每毫升样品中的活菌数约是（所用稀释液的体积为0.2mL）________个。

（4）实验中使用过的培养基及其培养物必须经过______处理后才能丢弃，以防止微生物的扩散。

解析：

（1）要分离土壤中能分解尿素的细菌，在配制培养基时，需加入尿素作为唯一的氮源，由于该培养基能将分解尿素的细菌选择出来，因此该培养基从功能上看属于选择培养基，培养基的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

（2）要检测固体培养基是否被污染，应将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生，若有菌落产生则说明该培养基已经被污染，否则没有被污染。

（3）要统计土壤样品中尿素分解菌的数目，宜采用稀释涂布平板法接种，根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的菌落数目就能大约推测出样品中的活菌数。

若一同学在稀释倍数为104的培养基中测得平板上菌落数的平均值为24.6，所用稀释液的体积为0.2mL，则每毫升样品中的活菌数是24.6÷0.2×104＝1.23×106个。

（4）实验中使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止微生物的扩散，污染环境。

答案：

（1）尿素　选择　高压蒸汽灭菌　

（2）将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生　（3）稀释涂布平板　1.23×106　（4）灭菌

4．土壤中有些细菌含有可降解尿素的脲酶。

如下是某同学从土壤中筛选能降解尿素的菌株的实验流程。

请回答相关问题：

配制土壤溶液→系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数

（1）用以__________为唯一氮源的培养基筛选能分泌脲酶的细菌。

从功能上讲，该培养基属于__________培养基。

为了防止杂菌污染，培养细菌时必须在__________条件下进行。

（2）采用__________法接种时需要将样液进行一系列的梯度稀释，然后接种培养、菌落计数。

在稀释土壤溶液的过程中每一步都要在__________旁进行操作。

（3）向培养基中加入酚红指示剂，若培养基中存在可合成脲酶的细菌，其菌落周围会出现红色，这是尿素被分解产生的__________使酚红指示剂显色的结果。

变色区域越大，表明该菌株降解尿素的能力__________。

解析：

（1）欲筛选出能降解尿素的菌株，配制培养基时应以尿素为唯一氮源，这样不能降解尿素的细菌在此培养基上就不能生存，这类培养基属于选择培养基。

培养细菌时必须保证无菌操作。

（2）在统计菌落数目时，常用的接种方法是稀释涂布平板法，整个实验操作过程都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。

（3）酚红指示剂变红的原因是细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，而氨使培养基的碱性增强，pH升高。

降解尿素能力越强的菌株，在菌落周围形成的红色环带越大。

答案：

（1）尿素　选择　无菌

（2）稀释涂布平板　酒精灯火焰　（3）氨（NH3）　越强

5．有机磷农药是用于防治植物病虫害的含磷有机化合物，广泛应用于农业生产中，有时会造成瓜果蔬菜等食品农药残留超标，不少品种对人、畜的毒性很强，人误食后如不及时医治就会危及生命。

某班同学欲从土壤中分离高效降解有机磷农药的微生物。

请回答下列问题：

（1）为了获得能降解有机磷农药的微生物菌种，可在被有机磷农药污染的土壤中取样，并在含有碳源、氮源及__________等的选择培养基上添加__________进行选择培养。

（2）将获得的3种待选微生物菌种甲、乙、丙分别接种在1L含20mg有机磷农药的相同培养液中培养（培养液中其他营养物质充裕、条件适宜），观察实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为32小时、45小时、16小时，则应选择微生物__________（填“甲”“乙”或“丙”）作为菌种进行后续培养，理由是__________________________。

（3）制备固体培养基的基本步骤是计算→__________→溶化→分装→加棉塞→包扎→__________→倒平板。

（4）若要测定培养液中选定菌种的菌体数，既可在显微镜下用__________直接计数，也可选用__________法统计活菌数目。

解析：

（1）微生物生存所需要的营养包括水、无机盐、碳源和氮源。

因筛选降解有机磷农药的微生物，培养基中需添加适量的有机磷农药。

（2）微生物可从降解的有机磷农药中获得特殊营养，丙生长时间短，说明其对有机磷农药的降解速度较快。

（3）制备固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、分装、加棉塞、包扎、高压蒸汽灭菌、倒平板。

（4）菌体数量可通过显微镜利用血细胞计数板直接计数，也可以利用稀释涂布平板法统计活菌数量。

答案：

（1）水和无机盐　有机磷农药　

（2）丙　微生物丙分解有机磷农药的能力比甲、乙强　（3）称量　高压蒸汽灭菌　（4）血细胞计数板　稀释涂布平板

6．水中细菌总数可以作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。

在水质卫生学检验中，细菌总数是指1mL水样在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中，经37℃、24h培养后，所生长出的菌落数。

为初步测定某处池水中的细菌数目，实验的大致流程为：

水样采集→梯度稀释→接种培养→菌落计数。

回答下列问题：

（1）对采集的池水进行梯度稀释时，应先将1mL水样加入______________中以获得稀释10倍的稀释液。

实验中对采集的池水要进行稀释的目的是____________________________。

（2）接种培养所用到的培养基中，能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是__________________________________________________________。

（3）为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。

用这种方法统计的菌落数目往往比活菌的实际数目低，原因是___________。

（4）实验过程中为确保培养基上的菌落来自所采集水样，避免杂菌污染。

实验中需要注意的具体操作有_______________（至少答2点）。

解析：

（1）对池水进行稀释时，为了减少误差，所用水必须为无菌水，1mL水样稀释10倍，则需要加9mL无菌水；池水中细菌数目过多，在进行涂布培养时不容易获得单个菌落，使计数误差较大。

（2）稀释后的水样接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中培养，牛肉膏、蛋白胨均含有有机氮、糖类等有机物，故能为细菌同时提供碳源和氮源的物质是牛肉膏、蛋白胨。

（3）为保证菌落计数结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

用稀释涂布平板法计数所得菌落数一般都会偏低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

（4）为避免杂菌污染，具体操作时必须严格按照无菌操作的要求进行：

实验者、操作台要进行消毒处理；所用容器均需灭菌；整个实验过程需要在酒精灯火焰旁进行等。

答案：

（1）9mL无菌水　避免池水中细菌数目过多（密度过大），得不到单菌落

（2）牛肉膏、蛋白胨

（3）30～300　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

（4）采集水样的容器要灭菌，稀释和接种要在酒精灯火焰旁等

7．苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。

小明同学准备依据如图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。

请回答下列问题：

（1）酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有________。

（2）将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。

若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。

制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。

（3）如图为连续划线法示意图，在图中________（填图中序号）区域更易获得单菌落。

（4）采用比色测定法（使用苯酚显色剂）检测降解后的废水中苯酚残留量。

先制作系列浓度梯度并进行显色反应，表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________。

管号

1

2

3

4

5

6

苯酚浓度（mg/L）

1

如果废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________（填序号：

①5　②10　③20）倍后，再进行比色。

解析：

（1）富集培养基中蛋白胨、苯酚都是含碳的有机物，可作为碳源。

（2）欲富集酚降解菌，需随转接次数增加逐渐增加培养基中苯酚的含量；若接种培养后平板上菌落过于密集，则应进一步稀释后再进行涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离；平板培养基是固体培养基，除含有水、营养物质（碳源、氮源、无机盐等）外，还需添加琼脂作为凝固剂。

（3）利用连续划线法接种时，最后的划线区域（③）中，菌体的密度较小，容易获得单菌落。

（4）因系列浓度梯度中6号比色管中苯酚浓度为1mg/L，故1～5号比色管中的苯酚浓度应分别为0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L；根据题意，废水为50mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1mg/L，需将残留液稀释20倍左右。

答案：

（1）蛋白胨、苯酚　

（2）增加　稀释涂布　凝固剂　（3）③　（4）0、0.2、0.4、0.6、0.8　③

8．图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。

（1）图中选择培养基应以________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成______色。

（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。

该过程采取的接种方法是________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。

（3）现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码（终止密码有UAG、UGA和UAA）。

突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。

解析：

（1）筛选产脲酶细菌的选择培养基应以尿素为唯一氮源；鉴别培养基还需要添加酚红作指示剂，产脲酶细菌产生的脲酶可以将尿素分解成氨，导致培养基的pH升高，菌落周围的指示剂将变成红色。

（2）图中过程采取的接种方法是稀释涂布平板法，每克土壤样品中的细菌数量为（156＋178＋191）÷3÷0.1×105＝1.75×108，血细胞计数板计数法所得数据包括死的细菌，且稀释涂布平板法计数时所计菌落数少于真正的活细菌数，故与血细胞计数板计数法相比，此计数法测得的细菌数较少。

（3）图乙从起始密码算起的碱基序列号为271，前270个碱基决定90个氨基酸，从271位到箭头处可以决定1个氨基酸，然后插入70个核苷酸，可决定23个氨基酸，多出一个碱基，加上后面的AG刚好可以决定1个氨基酸，则后面UGA是终止密码。

因此突变基因转录的mRNA终止密码为UGA，突变基因表达的蛋白质所含氨基酸数为90＋1＋23＋1＝115（个）。

答案：

（1）尿素　酚红　红　

（2）稀释涂布平板法　1.75　少　（3）UGA　115

9．如表所示为某科研机构研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格内容和所学知识回答下列相关问题：

成分

蛋白胨

蔗糖

显色剂（伊红美蓝）

乳糖

K2HPO4

琼脂

含量

10.0g

5.0g

0.2g

5.0g

2.0g

12.0g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL

（1）在微生物的实验室培养中，获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，因此需对培养基和培养皿进行________（填“消毒”或“灭菌”），常用的方法是________；同时操作者的双手需要进行清洗和________。

空气中的细菌可用紫外线杀灭，原因是紫外线能使蛋白质变性，还能破坏DNA的结构。

（2）根据用途划分，该培养基属于________（填“选择”或“鉴别”）培养基，该培养基中的碳源是________。

若要分离能分解尿素的细菌需将培养基中的蛋白胨换成______，并用________作为指示剂。

（3）培养大肠杆菌时，常用的接种方法是________和________。

通过上述方法可以分离出由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，称为________。

（4）检测饮用水中大肠杆菌的含量时，通常将样品进行一系列的梯度稀释，将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，然后记录菌落数量，这种方法称为________。

如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48（4个平板上接种的稀释液均为0.1mL），那么每升饮用水中约含大肠杆菌________个，用这种方法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，这是因为______________________________。

下列4个菌落分布图中，不可能是用该方法得到的是________。

解析：

（1）微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌污染，对培养基和培养皿需要进行灭菌处理，常用高压蒸汽灭菌法。

另外，对操作者的双手常用酒精消毒处理；空气中的细菌可用紫外线杀灭，原因是紫外线能使蛋白质变性，同时还能破坏DNA的结构。

（2）该培养基含有显色剂（伊红美蓝），可使大肠杆菌菌落呈黑色，并带有金属光泽，因此属于鉴别培养基。

分析表中成分可知，该培养基中的碳源是乳糖、蔗糖，氮源是蛋白胨。

若要分离能分解尿素的细菌，应以尿素为唯一氮源，因此应将蛋白胨换成尿素。

若要鉴别能分解尿素的细菌，应在培养基中加入酚红指示剂。

（3）常用的接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。

（4）如果经过培养后稀释倍数为102的4个平板上菌落数分别为43、47、42、48，则平板上平均菌落数＝（43＋47＋42＋48）÷4＝45，每毫升饮用水中约含大肠杆菌数＝（C÷V）×M＝（45÷0.1）×102＝4.5×104，每升饮用水中约含大肠杆菌数＝4.5×104×103＝4.5×107；用稀释涂布平板法测定的细菌数量比实际活菌数量要少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落。

图D中菌落分布情况为平板划线法所得。

答案：

（1）灭菌　高压蒸汽灭菌　消毒　

（2）鉴别　蔗糖、乳糖　尿素　酚红　（3）平板划线法　稀释涂布平板法　菌落　（4）稀释涂布平板法　4.5×107　当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的是一个菌落　D