中草药抗耐药性大肠杆菌的抑菌初步实验研究.docx
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中草药抗耐药性大肠杆菌的抑菌初步实验研究
一、论文
1、标题和作者……………………………………………………………1
2、中文摘要及关键词…………………………………...............1
3、外文摘要及关键词………………………………………………..1
4、前言……………………………………………………………………….2
5、正文……………………………………………………………………….4
6、结果……………………………………………………………………….7
7、讨论或小结…………………………………………………………...9
8、参考文献………………………………………………………………10
9、致谢………………………………………………………………………11
中草药抗耐药性大肠杆菌的抑菌初步实验研究
程德伟（江西中医药大学330006）欧阳厚淦（江西中医药大学330006）
中文摘要
目的：
筛选对耐药性大肠杆菌有抑制作用的中草药。
方法：
选用黄连、黄芩、夏枯草、秦皮、苦参、甘草、石榴皮、连翘、党参、大黄这十味中草药，采用煎煮法提取其有效成分，并使用K-B纸片扩散法测定这10味中草药提取物在体外对耐药性大肠杆菌是否有抑菌效果。
结果：
各中草药抑菌圈大小各不相同，其中黄芩最大，党参没有抑菌圈。
结论：
不同的中草药对耐药性的大肠杆菌具有不同的抑制作用，黄芩对大肠杆菌抑制较为敏感，而党参对大肠杆菌不敏感。
关键词：
中草药；大肠杆菌；耐药性
ABSTRACT
Objective:
toscreenfordrug-resistante.colihasinhibitoryeffectofChineseherbalmedicine.Methods:
rhizomacoptidis,radixscutellariae,selfheal,cortexfraxini,bitterginsengandlicorice,pomegranateskin,forsythia,codonopsis,rhubarb,thesetenChineseherbdecoctionmethodisusedtoextracttheeffectivecomponents,andusetheK-Bpaperdiffusionmethodtodeterminethe10kindsofChineseherbalmedicineextractsinvitrobacteriostaticeffectone.coliresistancetoseeifthereis.Results:
thebacteriostaticringsizeisdifferent,theChineseherbalmedicineofradixscutellariae,biggestdangshennobacteriostasiscircle.Conclusion:
differentChineseherbalmedicinefordrugresistanceofescherichiacoliwithdifferentinhibition,radixscutellariaeismoresensitivetoe.colisuppression,andcodonopsispilosulaisnotsensitivetoe.coli.
Keywords:
Chineseherbalmedicine;E.coliDrugresistance
前言
致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一，从发病情况看，大肠杆菌病发病率在细菌病引发的疾病中居世界首位。
兽医临床上大肠杆菌造成的危害十分严重，一年四季均可致病，一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病，给养禽业造成了严重的经济损失；大肠杆菌病的主要防治措施是应用疫苗及抗生素。
国内外已研制出多种疫苗对大肠杆菌病进行预防，但因大肠杆菌具有多种血清型，仅国内报导就有80余种，应用疫苗对大肠杆菌病进行防治尚不能满足对该病的防治要求。
抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的广泛、持续及不当使用，大肠杆菌耐药性不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。
虽然新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的产生速度。
因此了解大肠杆菌耐药状况，研究大肠杆菌的耐药机理，掌握中草药的应用趋势，对控制耐药菌株的蔓延具有非常重要的意义。
1、病原菌对抗生素的耐药现状
自1929年弗来明发现青霉素以来，伴随着抗生素和化学抗菌剂的开发使用，各种病原菌对抗菌药物的耐药也日趋严重。
有文献报道，20世纪90年代后期，兽医临床上抗菌素被广泛、长期使用，20世纪90年代以前、20世纪90年代以后（鸡、猪）耐药菌株百分比分别为：
80%28.73%、43.19%、53.47%，说明大肠杆菌耐药性逐渐增强。
目前病原细菌对青霉素的耐药率达＞88%以上，对庆大霉素耐药率＞75%，对大多数喹诺酮类药的耐药率达50%以上，对头孢一代、二代的耐药率在40%-65%。
[1]由于养殖规模、养殖历史、饲养水平和用药习惯的不同，不同地区大肠杆菌的耐药性差异也较大，家禽大肠杆菌多重耐药菌株普遍，占所有耐药菌株的50%以上，且仍然呈现上升趋势，二重、三重耐药菌株所占比例下降，而五重、六重七重耐药菌株占主导优势。
在实验中发现一株对17种抗菌药都产生耐药性的超级大肠杆菌。
由此表明大肠杆菌的耐药性日益严重，其药敏普越来越窄，可选择药物的余地也越来越小，随着多重耐药增加，联合用药的效果必然也越来越差，严重影响了临床治疗效果，增加了治疗成本，同时缩短了新药的应用周期，增加了新药的研究与开发成本，耐药性通过多种途径造成的交叉传播，直接对人类的健康构成威胁。
[2-3]
3、大肠杆菌的耐药性机制
大肠杆菌的耐药可以是天然固有的，也可以通过后天的基因突变、基因转移获得。
固有耐药性（intrinsicresistance），即耐药性的产生并不依赖于抗菌药物的存在，而是细菌细胞所固有的，与细菌的遗传和进化密切相关。
固有耐药性包括自发基因突变导致的耐药性和细胞膜药物外输作用引起的耐药性。
获得性耐药性（acquiredresistance）是指细菌在抗菌药物选择压力存在下经过基因突变，或细菌在生长过程中由于移动耐药因子的转移而获得的一种表型。
主要包括移动因子和抗菌药压力作用下引起基因突变所导致的耐药性。
[4]就目前的研究现状来看，大肠杆菌的耐药性机制主要有5种：
①抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生；大肠杆菌通过修饰抗生素作用的靶位或本身发生变异从而使靶位结构发生改变，使抗生素失效或活性减弱，从而导致对抗生素耐药。
抗菌药物通过与细菌细胞的靶位点结合，干扰细菌正常的生理功能而导致细菌死亡。
突变是导致大肠杆菌对抗生素耐药的主要原因。
②酶对抗生素的修饰和破坏；酶对抗菌药物的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一，包括氨基糖苷类钝化酶、β—内酰胺酶、乙酰转移酶（耐氯霉素）酯酶（耐大环内酯类）。
③增加抗生素从大肠杆菌向细胞外的主动排出作用；主动外排系统是指大肠杆菌细胞内模存在的能量依懒性蛋白质外排泵，通过主动外排作用可将药物从菌体内排出，是细菌产生对多种抗生素的耐药性。
④细菌外膜通透性的改变；药物进入菌体必须通过菌体外膜。
菌体外膜对药物的通透性下降，造成细菌内药物累积浓度降低，表现为耐药。
⑤质粒街道的耐药性。
质粒存在于细胞中，是独立于细菌染色体外，能够自我复制、稳定遗传的遗传单位。
携带耐药基因的质粒称为耐药质粒。
耐药质粒可以将大肠杆菌的耐药基因通过转化、转导和结合方式在菌间相互转移，从而使大肠杆菌的耐药性迅速传播。
一种耐药机制可以对多种抗生素表现为抗性，同一种抗生素也常常出现多种耐药性机制共同抑制的现象。
4、中草药的应用
中兽医学有着悠久的历史和丰富的应用经验，在抗生素使用以前，对保障家畜健康起着重要的作用，有研究证明，许多中草药所含的多糖类、有机酸累、生物碱类、甙类、挥发油累等成分，均有增强免疫的作用；类激素样作用，中草药本身不是激素，但可以起到与激素相似的作用，并能减轻或防止、消除外激素的毒副作用，而被认为是类激素样作用物；抗应激作用，目前在防治家畜应激综合征的研究中，发现一些中草药有提高机体防御抵抗力和调节缓和应激的作用；毒副作用小，不易产生耐药性，具有改善畜禽产品品质的作用，中草药所含绝大多数成分对畜禽有益无害，即是是用来防止疾病的一些有毒中草药，亦可以经自然炮制或精制提取和科学配方而使毒性减弱或消除。
[5-6]
正文
实验仪器与材料：
黄连、黄芩、夏枯草、秦皮、苦参、甘草、石榴皮、连翘、党参、大黄（均购于市场）、大肠杆菌菌液（由江西中医药大学实验室提供）
1.1水煎剂的制备：
[7]
将草药烘干后各称取100g加水1—2L，浸泡30min后煎煮，煮沸后文化煎30min，用纱布过滤药液，药渣加水0.5—1.0L煮沸后煎30min，过滤药液，合并两次药液，浓缩、离心后定容至生药浓度为1.0g/mL，并消毒灭菌备用。
1.2中药提取物药敏纸片的制备：
将普通定性滤纸用打孔机打成若干圆形纸片，直径6mm，置于干燥洁净的试管内，放入高压蒸汽灭菌器中，经121℃15-20min高压灭菌后，取出，放入干燥箱内进行干燥，然后取经干燥后的纸片一定数量，分别放入各种中药提取液中，浸泡40min，取出放置在超净台内24h，晾干置4℃冰箱内保存备用。
1.3培养基：
MH琼脂、麦康凯琼脂、营养肉汤（均购于北京奥博星生物技术责任有限公司）
营养肉汤：
称取18g加入1000mL蒸馏水，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌15min备用。
麦康凯琼脂：
称取52g加入1000ML蒸馏水中，116℃高压灭菌20min。
营养琼脂：
称取45g，加入1L蒸馏水中，121℃高压灭菌备用。
1.3.1糖发酵培养基的制备方法
试剂
蛋白胨
NaCl
1.6%溴甲酚紫乙醇溶液
蒸馏水
用量
10g
5g
1~2mL
1000mL
pH
7.6
另配20%糖溶液（葡萄糖，乳糖）各10mL。
制法:
1将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7.6）分装于试管中,在每管中放一倒置的小玻璃管。
⑵将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min；糖溶液112℃灭菌30分钟。
⑶灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5mL（按每10mL培养基中加入20%的糖液0.5mL，则成1%的浓度）。
配制后的试管必须洗干净，避免结果混乱。
1.3.2蛋白胨水培养基的制备方法121℃灭菌20min。
试剂
蛋白胨
NaCl
蒸馏水
用量
10g
5g
1000mL
pH
7.6
1.3.3葡萄糖蛋白胨水培养基的制备方法
试剂
蛋白胨
葡萄糖
K2HPO4
蒸馏水
用量
5g
5g
2g
1000mL
将上述各成分溶于1000mL水中，调pH7.0~7.2，过滤。
分装试管，每管10mL，112℃灭菌30分钟。
1.4细菌纯化培养：
无菌条件下将保存的大肠杆菌涂布麦康凯琼脂平板，37℃培养12h-16h后挑菌于营养肉汤，37℃再培养12h-16h，保存备用。
在无菌操作台内，将接种环用酒精灯灼烧灭菌并冷却后，在LB培养平板（大肠杆菌）中挑选单个菌落，伸入液体培养基试管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌混合于肉汤中，并塞好瓶塞。
将接种后的LB培养基试管（5mL培养基）放入恒温摇床（37℃，250次/分）过夜。
1.5大肠细菌的生化鉴定试验：
[8]
a、糖发酵试验取可疑菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖发酵管，37℃培养2～3d，观察各管产酸产气情况。
b、甲基红（MR）试验取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入甲基红试剂两滴，立即观察结果，红色者为阳性，黄色者为阴性。
c．吲哚试验取可疑菌接种至蛋白胨水培养基中，37℃培养2～3d。
先加入3-4滴乙醚，塞紧棉塞振摇试管，使乙醚与培养液充分混匀，静置试管架上片刻，待乙醚浮于液面上层时，沿管壁加入吲哚试剂2～3滴，在接触面呈红色者即为阳性反应。
d．VP试验取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，加入VP指示剂，混匀后观察结果，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。
1.6大肠杆菌的镜检
1.6.1革兰氏染色液配制：
配方如下
①草酸铵结晶紫染色液：
结晶紫1g溶于10ml95%的乙醇与40ml1%的草酸铵互溶
②卢戈氏碘液：
将0.34g碘化钾溶解于50ml高纯水后加碘0.17g
③95%乙醇溶液
④番红复染液：
0.25g番红溶解于10ml95%乙醇加高纯水定容至50ml
1.6.2革兰氏染色：
步骤如下
①在载玻片上滴加1滴无菌蒸馏水，用接种环挑取平板上的菌体均匀地混匀于无菌蒸馏水中，然后用酒精灯火焰微热将菌体固定。
②向固定的菌体滴加一滴草酸铵结晶紫染色液，1分钟后用清水缓缓冲洗，直至清水无色，将载玻片上的水滴甩干。
③向菌体中心部位滴加一滴卢戈氏碘液，1分钟后用清水缓缓冲洗，直至清水无色，将载玻片上的水滴甩干。
④向菌体部位滴加一滴95%乙醇溶液，30秒后用清水缓缓冲洗，直至清水无色，将载玻片上的水滴甩干。
⑤向菌体部位滴加一滴番红染色液，2分钟后用清水缓缓冲洗，直至清水无色，将载玻片上的水滴甩干。
⑥晾干水滴后在显微镜下观察。
1.7菌液制备:
将已鉴定、保存的大肠杆菌活化后，接种于3mLMH培养基，37℃恒温培养18h。
1.8中药提取物对耐药性的大肠杆菌体外试验:
[9]
①用无菌棉签蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60°，最后沿平板缘涂抹1周。
②平板在室温下干燥3-5min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面，置于35℃培养16-18h，记录抑菌圈的直径。
③药敏实验重复三次，以3次平均值为该味药的抑菌直径。
实验结果
鉴定结果：
通过形态学鉴定和生化鉴定，证实所用菌为大肠杆菌。
一、镜检图片：
从图可见到2-3mm，两端钝圆，散在或成对存在的卵圆形或短杆状的红色细菌，根据该形态特征，初步判断为大肠杆菌。
大肠杆菌图
二、生理生化结果
大肠杆菌生化鉴定结果
葡萄糖
乳糖
麦芽糖
蔗糖
甘露糖
MR试验
吲哚试验
V-P试验
-
+
+
-
注：
“+”阳性“-”阴性“
”产酸产气
三、中药提取物对耐药性大肠杆菌的体外实验结果：
不同中草药对大肠杆菌的抑菌效果不同，甘草、黄芩、石榴皮对大肠杆菌的抑制最为明显，党参对大肠杆菌不太敏感。
中草药（1.0g/mL）对耐药性大肠杆菌的药敏实验数据
中草药名称
抑菌直径（mm）
平均直径（mm）
黄芩
16.69
17.26
18.29
17.41
夏枯草
11.18
11.72
12.64
11.85
连翘
11.15
18.73
16.91
14.93
黄连
9.77
9.81
9.82
9.80
甘草
17.04
17.16
17.16
17.12
石榴皮
16.26
16.54
16.46
16.42
秦皮
9.16
9.17
9.12
9.15
苦参
8.94
8.93
8.98
8.95
大黄
7.71
7.71
7.74
7.72
党参
0
0
0
0
讨论或小结
近年来，随着广谱抗生素的广泛应用，耐药细菌的不断增多，特别是像大肠杆菌这些高度变异菌株，耐药性尤为突出。
[10]目前，医学界一直致力于寻找安全有效的抗菌药物。
中草药是我国医学宝库中最珍贵的财富之一，它存在很多活性强、毒性低的有效成分，如从大黄中提取的大黄素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、枯草杆菌、痢疾杆菌等均有抑制作用，能抑制细菌线粒体呼吸链电子传递、抑制呼吸与氨基酸、糖和蛋白质代谢中间产物的氧化和脱氢，导致细菌核酸和蛋白质合成受到干扰。
本实验中夏枯草和黄芩对耐药性的大肠杆菌抑制效果比较明显，这对治疗耐药性大肠杆菌引起的疾病起到了很好的的指导作用。
但是，夏枯草和黄芩中哪些成分起作用，如何发生作用，如何快速提取有效成分是值得我们继续研究的内容。
良好抑制药物的选择，以及提取种草药的有效成分并确定其分子结构、作用机制，对探讨中草药对耐药性大肠杆菌的抑制作用具有重要的意义。
实验中对大肠杆菌的鉴定采用了生理生化和形态学的鉴定方法，由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位，在形态学的鉴定方法中，主要是在显微镜下观察，看是否符合大肠杆菌的形态特征。
通过本次实验我们证实了不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；了解了糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用以及IMViC的原理；并掌握了微生物大分子物质水解实验的原理和方法以及通过糖发酵鉴别不同微生物的方法，及显微镜的操作方法。
体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验（AST），是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。
随着新型致病菌的不断出现，抗菌药的防治效果越来越差。
并且各种致病菌对不同的抗菌药物的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药物的敏感性也有差异。
长期以来，各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药物往往失去药效，以及不能很好的掌握药物对细菌的敏感度，所以一个正确的结果，可供临床医师选用抗菌药物的参考，并提高疗效。
鉴于细菌耐药的复杂性和严重性，部分或全部恢复其对抗生素的敏感性成为当今人们关注的焦点，降低细菌耐药性有多种途径。
中草药和天然植物的低毒性、普遍性和廉价性，使探索它们对耐药性大肠杆菌的抑制作用成为一种新的途径。
中药作为耐药性细菌抑制剂的优势主要有：
一、中药资源丰富，治疗疾病历史悠久，二、许多中药本身具有抗菌活性，三、中药及其配方具有天然高效、低毒副作用、不易产生耐药性的特点，四、已有一些中药被用耐药性细菌抑制剂。
因此，研究大肠杆菌耐药性的中药消除剂（resistancereversalherbalagents）无疑是可行的，且可开发出新型的中药制剂或中西药复方抗菌制剂用于临床，其不仅能更有效地防治大肠杆菌病，而且可以延长抗菌药物的使用周期，减少化学药物的使用，有利于减少动物性食品的药物残留，减少细菌耐药性的传播，丰富中医药学的应用理论。
【参考文献】
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[10]张秀英，宋立，赵晖，等.中药制剂对大肠杆菌耐药性逆转的作用研究[J].中国兽药杂志，2012,46（9）：
11-14.
致谢
在此真诚感谢欧阳厚淦老师、实习单位的领导和其他各位老师们，他们严谨细致、一丝不苟的工作作风是我工作学习的榜样，他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。
在他们的细心帮助下，我得以顺利完成毕业论文。
在这次实习过程中我学到了很多，将理论知识和实践有机结合起来，为以后的学习工作打下了良好的基础。
最后，再次衷心感谢曾经给与我帮助、支持的所有的人，感谢江西中医药大学给我提供了良好的学习环境和机会！
此致
敬礼！
10生物工程
（2）班：
程德伟
2014年5月
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