ST6Gal1shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究.docx

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ST6Gal1shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究

ST6Gal1--shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究

温州医学院硕士学位论文

ST6Gall．shRNAi对乳腺癌细胞粘附力及紫杉醇的敏感性调节作用研究

目的：

1．考察ST6GAL1及在不同肿瘤细胞中的表达情况；

2．考察较低浓度紫杉醇持续刺激卵巢癌细胞OVCAR3对其ST6GAL1表达的影响：

3．考察利用sh．RNAi技术下调乳腺癌细胞ST6GAL1表达后，其细胞迁移能力、对ECM粘附能力和紫杉醇诱导的细胞凋亡等的变化，并探讨其内在的分子机制。

方法：

1、用荧光定量PCR技术检测不同肿瘤细胞的ST6GAL1的表达水平。

2、使用25nM和lOOnM的Paclitaxel持续刺激OVCAR3肿瘤细胞，在用药后的1，

7，14，21天后，用荧光定量PCR技术检测其ST6GAL1表达水平的变化。

用lOOnM的paclitaxel分别处理MDA-MB-435、Hela、PM8910等细胞24个小时

后，检测各组细胞的ST6GAL1mRNA的表达情况。

3、构建ST6GAL1基因的sh．RNAi干扰载体，利用Lipofectamine2000转染MDA-MB．435细胞。

4、用细胞损伤愈合实验检测转染后各组细胞的迁移能力。

待细胞密度大于95％时，用200¨1的枪头划板，检测转染后各组细胞在划板后24，48小时的愈合率。

‘

5、检测转染后各组细胞对collagenIV和fibronectin的粘附力。

6、检测转染后各组细胞对paclitaxel细胞毒性的敏感性。

7、检测转染后各组细胞对paclitaxel诱导细胞凋亡率的变化。

8、转染后各组细胞与ECM的粘附后，对paclitaxel细胞毒性的抵抗作用。

9、转染后各组细胞与ECM的粘附后对paclitaxel诱导细胞凋亡的抵抗作用。

10、通过考察各组细胞的ST6GAL1、k-ras、paxillin、p-paxillin、FAK、p-FAK的蛋

白水平的表达，初步探讨下调肿瘤细胞ST6GAL1表达对促进paclitaxel敏感性的分子机制。

结果

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1、MDA．MB一435的5T6GALlmRNA表达水平最高，而Hela和PM8910则居中；而OVCAR3细胞则最低，OVCAR3与其他各组细胞的ST6GAL1mRNA表达水平相比均有显著性的统计学差异（P

2、OVCAR3细胞的ST6GAL1mRNA表达水平与paclitaxel作用时间成正相关；与

未加药组相比，OVCAR3细胞的ST6GAL1mRNA表达水平被上调，而

MDA-MB-435、Hela、PM8910细胞的ST6GAL1mRNA表达水平均被下调。

3、sh．ST6GAL1细胞的ST6GAL1mRNA表达水平明显低于MDA-MB一435细胞（P

MDA-MB．435细胞与Sc—Vector细胞相比，在ST6GAL1mRNA水平（P

>0．05）和蛋白水平（P>0．os）均无统计学意义。

4、在24小时后，sh．ST6GAL1细胞的愈合率最低，且与MDA-MB-435细胞相比

有统计学意义（P<0．05），但与Sc—Vector细胞相比无统计学意义（P>0．os）；在48小时后，sh．ST6GAL1细胞的愈合率明显低于MDA-MB-435细胞（P<0．01）和Sc-Vector细胞（P<0．05）。

．

5、ECM（collagenIV或fibronectin）浓度与细胞和ECM粘附力成正相关，而

sh．ST6GAL1细胞和ECM的粘附力最弱。

6、各组细胞的IC50值分别为：

MDA-MB一435细胞（97nM）、Sc-Vector细胞（88nM）、

sh．ST6GAL1细胞（44nM），提示sh．ST6GALl细胞对紫杉醇更加敏感7、流式细胞仪定量各组细胞的凋亡率分别为：

对照组：

MDA-MB-435细胞

（s．17％）、Sc-Vector细胞（6．41％）、sh．ST6GAL1细胞（7．02％）；紫杉醇药物处理24h后，：

MDA．MB435细胞（27．44％）、Sc-Vector细胞（30．700／o）、sh—ST6GAL1细胞（42．24％）。

经紫杉醇处理后，各组细胞的凋亡率均明显增加（vs自身对照），且在实验组中，sh-ST6GAL1细胞的凋亡率明显高于MDA-MB．435细胞（P<0．01）和Sc-Vector细胞（P<0．05），都具有统计学意义。

8、与无ECM粘附作用相比，在collagenIV粘附组，paclitaxel对sh—ST6GAL1细胞的细胞毒性下降了2S．65％，而在MDA．MB-435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了57．53％、56，56％，sh．ST6GAL1细胞细胞毒性下降差值明显低于MDA-MB．435细胞（P<0．001）和Sc-Vector细胞（P<0．001），具有统计学意义。

在fibronectin组，paclitaxel对sh．ST6GAL1细胞的细胞毒性差值下降了73。

34％，而在MDA—MB一435细胞和Sc．Vector细胞则分别下降了88．58％、

88．16％，sh—ST6GAL1．细胞下降的细胞毒性同样明显低于MDA．MB-435细胞（P

<0．001）和Sc．Vector细胞（P<0．001），具有统计学意义。

9、与无ECM粘附相比，在collagenIV粘附组，paclitaxel诱导sh·ST6GAL1细胞

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的凋亡率下降了36．69％，而在MDA_MB一435细胞和Sc—Vector细胞则分别下降了51．86％、48．13％，sh．ST6GAL1细胞下降的凋亡率明显低于MDA-MB·435细胞（P<0．05）和Sc．Vector细胞（P<0．01），具有统计学意义。

在fibronectin组，paclitaxel诱导sh．ST6GAL1细胞的凋亡率下降了36．67％，而在MDA-MB．435细胞和Sc-Vector细胞则分别下降了50．60％、56．02％，sh-ST6GAL1细胞下降的凋亡率同样明显低于MDA-MB．435细胞（P

10、用紫杉醇处理后，各组细胞ST6GAL1的表达均有一定程度降低，在sh-ST6GAL

1处理组下降更为显著。

，

11、ST6Gall被shRNA沉默后，k-ras的表达亦随之下讽同时ST6下调后只发现在FAK和Paxillin的磷酸化水平发生了改变，而非磷酸化的FAK和Paxillin的表达则没有显著性变化。

结论

（1）较低浓度的paclitaxel能下调高表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL1mRNA

的表达，而上调低表达ST6GAL1肿瘤细胞的ST6GAL1mRNA的表达。

肿瘤细胞与ECM的粘附可降低paclitaxel对乳腺癌细胞的杀伤作用。

（2）下调乳腺癌细胞ST6GAL1的表达后，可以抑制其细胞迁移的能力，降低

其与ECM的粘附力，促进paclitaxel的杀伤作用。

（3）Paclitaxel可下调乳腺癌细胞ST6GAL1mRNA水平和蛋白水平的表达。

另外，shRNAi联合Paclitaxel可显著抑制k-ras的表达，进而抑制FAK和Paxillin的活化而增强Paclitaxel对乳腺癌细胞的凋亡诱导作用。

关键词：

RNAiST6GAL1紫杉醇细胞粘附细胞迁移细胞凋亡药物敏感性

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Effectofmediatingcell-ECMadhesionandsensitivityof

breastcancercellstopaclitaxelbyST6GAL1-shRNAi

0bjectives

1．InvestigatingtheexpressionofST6GAL1inseveralkindsoftumorcells；2．InvestigatingtheexpressionofST6GAL1inOVCAR3tumorcellsunderlinedthe

；：

onsistentlyexposingtolowerdosepaclitaxel；’

3·AfterdownregulatingST6GAL1inbreast．ca．ncer“导。

e．．1。

lsMDA-MB-4。

3，5，weinvestigatethechangesofcellularmigrationabIljty,,c譬_IkECM：

adhesionand

paclitaxel—inducedapoptosis，thenexplorethemechanismsinvolved．

Methods

1．QuantifytheexpressionofST6GAL1inseveralkindsoftumorcellsbyreal—time

PCR·；

ConsistentlyexposingOVCAR3tumorcellsto25nM．andl。

OOnMpaclitaxel，andthenassaytheexpressionofST6GAL1byreal·timePCRinthedayof1，7J14and21．Ontheotherhand，wequantifythechangeofST6GAL1expressioninMDA-MB-435，HelaandPM8910tumorcellsaftertreatingwithlOOnMpaclitaxel

for24hours．

、

ConstructionRNAirecombinedvectorofST6GAL1gene．andthentransfectingtherecombinedvectorintoMDA-MB-435tumorcellsbyLipofectamine2000．Woundhealingassayformigrationofthethreegroups“cells．Inbrief,whencells'

densityisupto95％，microscopicobservationwasrecordedat0，24and48hoursafterscratchingthemonolayercellsbya2001．dpipettetip．

5．Detectingtheadhesionofthecell—CollagenIVorcell·Fibronectin．

6．Detectingthecytotoxicityofthethreegroups’cellsinducedbypaclitaxel．

●

7．Detectingthepaclitaxel-inducedapoptosisinthethreegroups’cells．

8．Aftertransfection，enhancingadhesionofcelI-ECMagainstcelIcytotoxicity

inducedbypaclitaxel．

9．Aftertransfection，enhancingadhesionofcell-ECMagainstcellapoptosisinducedbypaclitaxel．

10．InvestigatingtheexpressionofST6GAL1，k-ras，paxillin，p-paxillin，FAKandp-FAK，

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andthenexplorethepotentialmechanismsinvolvedinsensitizingpaclitaxelto

tumorcellsdown—regulatedtheexpressionofST6GAL1．

Results

1．ThehighestexpressionmRNAlevelofST6GAL1isMDA—MB-435cell，HelaandPM8910cellsaremedian，andtheOVCAR3cellistheIowestone，andthedifferenceoftheexpressionmRNAIeveIofST6GAL1isstatisticallysignificantbetweenOVCAR3cellsandtheothercells《allP<0．05）．：

2．Extendingthetimeofexposingtopaclitaxelresultsintheincreasingexpression

。

jrnRNAlevelofST6GAL1inoVcAR3cells．Aftertreatment。

vIf_|妣1—00删．paclitaxel．：

for24hinHela．MDA-MB-435，PM8910andOVCAR3cells，comparedtountreatedgroup，theexpressionmRNAlevelofST6GAL1inOVCAR3cellsareincreasing，but

theexpressionmRNAIeveIofST6GAL1inHela，MDA-MB-435．PM8910cellsare

decreasing．

3．TheexpressionmRNAIeveIofST6GAL1insh—ST6GAL1isstatisticallysignificantlowerthantheMDA-MB-435cells"IP

（P<0．oi}．NeithertheexpressionmRNAnorproteinIevelofST66AL1are

observednostatisticallysignificantdifferencebetweentheMDA-MB-435cells

（P>0．05）andtheSc·Vectorcells（P>O．os）．

4．After24hours，thewoundhealingratioofsh·sT6GAL1cellswasthelowest，thereisastatisticallysignificantbetweenthesh··ST6GAL1cellsandMDA-MB··435

cell（P0．os）．Butafter48hours，thewound

healingratioofsh-ST6GAL1cellsisstillthelowest，anditisstatisticallysignificantlowerthantheMDA—MB-435cells’（P

5．ThereisapositivecorrelationbetweentheconcentrationofECM（collagenIVorfibronectin）andtheadhesionofcell-ECM；otherwise，theadhesionofsh-ST6GAL1cellstoECMiStheweakest．

6．TheIC50valuesareasfollowing：

MDA-MB-435cells（97nM），Sc-Vectorcells（88nM），andsh—ST6GAL1cells（44nM）．Resultsshowsthatsh-ST6GAL1isthemostsensitivecelItopaclitaxelamongthethreecells．

7．QuantitiveapoptosisbyFASCisasfollowing：

forthecontrolgroups，MDA-MB0435

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cells（5．17％），Sc—Vectorcells（6．41％），sh—ST6GAL1cells（7．02％kaftertreatingpaclitaxelfor24h，MDA-MB-435cells127．44％），Sc-Vectorcells（30．70％），sh—ST6GAL1cells（42．24％）．Apoptosisratioofallgroupsarestatistically

significantincreasewhencomparetoselfcontrolledgroups',otherwise，amongtheexperimentalgroups,Apoptosisratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatisticallysignificanthigherthantheMD卢卜MBl435cells’（P

8．Comparedtothenon-ECMexperience，inthecollagenIVgroups,paclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthesh—ST6GAL1cellsdecreaseby25．65％while57．53％ofMDA-MB．435cells；and56．56％ofSc-Vectorcells’；thedecrease

’ofpaclitaxel·inducedcytotoxicityratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatistica'llVsignificantlowerthantheMDA-MB一435cells’（P

9．Comparedtothenon-ECMexperience，inthecollagenIVgroups，paclitaxel·inducedapoptosisratioofthesh·ST6GAL1cellsdecreaseby36．69％，while51．86％ofMDA-MB-435cells；and48．13％ofSc-Vectorcells’：

thedecreaseofpaclitaxel·-inducedcytotoxicityratioofthesh·ST6GAL1cellsisstatisticallysignificantlowerthantheMDAoMB-435cells’（P<0．05）ortheSc-Vectorcells（P<0．0z）．inthefibronectingroups，paclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthe

sh．ST6GAL1cellsdecreaseby36．67％．while50．60％ofMDA-MB-435cells；and56．02％ofSc—Vectorcells',thedecreaseofpaclitaxel-inducedcytotoxicityratioofthesh—ST6GAL1cellsisalsostatisticallysignificantlowerthantheMDA-MB-435cells’（P<0．01）ortheSc-VectorcellsIP<0．001）．

10．AftertreatingwithlOOnMpaclitaxelfor24hours,theproteinexpressionlevelsofalIcellsdecreasetoadifferentextent，butstill，thesh-ST6GAL1istheIowest．11．decreaseintheproteinexpressionIevelsofk-rasisobservedwhentheST6GAL1

expressionwassilence，andthephosphorylationofFAKandpa