枸杞组培快速繁殖技术研究报告.docx
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枸杞组培快速繁殖技术研究报告
枸杞组培快速繁殖技术研究
①本文通过对“宁杞２号”枸杞离体组织培养的研究，进行了丛生芽诱导，试管母本的建立，嫩梢增殖，生根状况分析及其移栽等方面的探讨，进而探索了组培快速繁殖以及生产上适用的组培技术，结果表明：
改良ＭＳ＋ＢＡ０．２＋ＫＴ０．３＋ＮＡＡ０．５和改良ＭＳ＋ＢＡ０．７５＋ＮＡＡ１＋ＩＢＡ０．１交替使用，可加快增殖速度；以较短的根系移栽试管苗，既省工、省力，又能提高成活率，从而确立了一套较为理想的快速繁殖体系，为大规模工厂化育苗提供了可靠依据
②选用“宁杞2号”离体组织进行了愈伤组织诱导和生根状况的研究．筛选出了适宜的愈伤组织诱导和生根的培养基．结果表明，最适的愈伤组织诱导培养基为1／2MS＋BA1．0mg／L＋NAA1．0mg／L,最适的生根培养基是；1／2MS＋NAA0．6mg／L＋IBA0．2mg／L．
③本实验以枸杞嫩枝及顶芽作外植体进行组织培养。
结果表明,不定芽诱导用MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L。
增殖培养基以MS+6-BA0.5mg/L+IBA1.0mg/L较佳。
生根培养基为1/2MS（大量元素减半,其它成分不变）+IBA0.1mg/L+活性碳0.1%。
④植物名称:
宁夏枸杞（Lyciumbarbarum）材料类别:
多年生植株上当年萌生出的嫩枝茎尖。
培养条件:
基本培养基为MS。
长芽培养基中的激素成分为（毫克/升）:
①IAA0.5,KT1,②IAA0.5,BA1。
蔗糖浓度为3％。
生根培养基成分为1/2MS（大量元素减半）,附加Zt0.2,NAA0.4,蔗糖浓度2％。
培养温度25～30℃,自然光照。
⑤MS和MS（1/2大量、微量元素全量）培养基均适于枸杞的培养、芽增殖和发根.在培养基的附加成分中激素的调节是重要的,激素以IBA浓度在0～1.1×10-6mol/L均适其培养,但以IBA的浓度为5.5×10-7mol/L效果最佳,在有机成份中VB1的含量对发根有明显的促进作用.微量全量对枸杞的发根是必需的.MS（1/2大量、微量元素全量）+VB12.96×10-5mol/L+IBA5.5×10-7mol/L（其他有机成分常量）是枸杞芽增殖与发根同步的最佳培养基.
⑥枸杞属植物（LyciumhaminifoliumMill）花粉粒发育成胚和植株的形成已有报导。
本文报导枸杞叶外植体的愈伤组织诱导及其植株的再生。
从未开花植株上摘取无病虫害的叶片作材料,先用流水冲洗除去尘土,然后在70％的酒精中浸20秒左右,再在含万分之二昇汞和5％安替福民的溶液中消毒4～5分钟（消毒时间不能过长,以免伤害叶片）。
用无菌水淋洗3～5次后,在无菌条件下将叶片横切成1厘M左右的切段,接种在Murashige和Skoog培养基上,培养基附加激动素（K）2.0,吲哚乙酸（IAA）2.0或K4.0,IAA
枸杞髓组织离体培养及高频率植株再生的研究*
曹有龙 陈 放 罗 青 曲 琳
摘 要：
枸杞髓组织在4种MS培养基上都能诱导出愈伤组织，诱导率53.7%～100%。
在培养基MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.5mg/L获得的愈伤组织，呈颗粒状，分散性能好，胚性细胞多。
将其转移到MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.01mg/L的分化培养基上获得大量绿色小芽，小芽在MS+6-BA0.2mg/L的培养基上得到快速繁殖，繁殖系数50～150株/芽.月。
丛生芽在MS+NAA0.2mg/L的培养基上形成完整植株。
关键词：
枸杞；髓组织；离体培养；植株再生
枸杞（LyciumbarbarumL.）是重要的药用植物，多年来，国内外科技工作者十分重视枸杞的组织培养，已有用叶片、花药、下胚轴、茎端及幼嫩子房为材料进行组织培养分化出植株的〔1,2,3〕，我们在此基础上，以枸杞髓组织为实验材料进行组织培养，获得了再生植株，为枸杞细胞突变体的筛选、细胞悬浮培养、原生质分离、细胞杂交、基因转移的研究提供依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料供试材料为宁夏农科院枸杞研究所培育的高产优质枸杞新品种——宁杞１号。
1.2.1 愈伤组织的诱导 取当年生长的明显分化成髓组织的枝条，摘除叶子、侧芽和带有分生组织的顶端100mm，把外植体的切端蘸熔蜡封着伤口，然后浸入70％酒精中20s，再转入0.1%HgCl2溶液中，经过8～10min后，用无菌水冲洗3遍，最后以吸水纸吸干，从茎的两端各切除10mm，余下部分切成20mm的小段，用无菌镊子夹着茎的切段，用瓶塞打孔器从切段中取出圆柱体髓组织，并将其转移到90mm的无菌培养皿中，用解剖刀切成2～3mm厚的小圆片，接种到4种含不同激素的MS固体培养基上诱导愈伤组织发生。
1.2.2 愈伤组织的继代培养 在P2培养基中加入500mg/L的水解酪蛋白作为继代培养的培养基。
挑选色泽鲜艳、生长迅速的愈伤组织进行继代培养，每次20d，2～3次继代后，出现疏松颗粒状胚性愈伤组织，选择颗粒较细的愈伤组织，加快继代频率（2周1次），当愈伤组织易碎，颗粒均匀且生长迅速时，改为3周1次保存之。
1.2.3 分化培养 将上述继代过程中产生的胚性愈伤组织转移到含不同浓度的6－BA和NAA的MS培养基上，4周后观察不同培养基上愈伤组织的分化出芽情况。
1.2.4 生根培养 选择较为健壮的丛生芽，切除底部的叶片，只保留上部2～3片叶，插入生根培养基中，3周后观察其生根情况。
在上述各步骤中，各外植体均接种于容量为120ml的三角瓶中，每瓶3～4个外植体，每处理3～4次重复。
培养条件：
温度20～25℃，每日光照10～12h，光照强度为2500～3000lx。
2 结果与分析
2.1 愈伤组织的诱导和生长 枸杞髓组织切片接到诱导培养基上3d后开始膨大，在切面上开始形成白色愈伤组织（图版Ⅰ:
1），其中P1培养基诱导频率最高，可达95.7%；P3与P4培养基诱导的愈伤组织白色紧密，不易分散，经过30d继代培养，有的可直接分化出苗，但频率很低（表1），而P2培养基上诱导的愈伤组织为淡黄色松散型，这种愈伤组织继代转接后能迅速生长，多次继代培养后，颗粒小，分散好，难以用镊子夹起来，而且胚性细胞多，分化频率高。
表１ 枸杞髓组织在不同激素配比培养基上的诱导情况Table1EffectsofhormonesoncalliinductionofLyciumbarbarumL.pithtissue
培养基编号
No.ofmedium
培养基组分
（mg/L）
Contentsofmedium
开始启动时间
（d）
Timeofcalliproduced
接种块数
（块）
Numberofexplantsplanted
出愈块数
Numberofexplantswithcalliinduction
诱导频率
（%）
Percentageofcalliinduction
P1
MS+2,4-D0.5
3
95
95
100
P2
MS+6-BA0.1+NAA0.5
10
95
75
78.9
P3
MS+6-BA0.5+NAA0.5
14
95
70
73.7
P4
MS+NAA0.1+KT0.5
14
95
51
53.7
2.22,4-D对愈伤组织继代的影响
在P1培养基中，我们加入植物激素2,4-D0.5mg／L诱导愈伤组织发生，诱导率为100%。
这说明2,4-D对枸杞愈伤组织的诱导有一定的促进作用，将其转入含不同激素成分的培养基中进行继代培养，结果如表2。
表2 2,4-D对枸杞愈伤组织的影响Table2Effectsof2,4-DoncalliofLyciumbarbarumL.
培养基编号
No.ofmedium
激素浓度
（mg/L）
Hormoneconcentration
生长情况
Growthstatus
褐化时间（d）
Timeofcallibecomebrown
愈伤组织特点
Callicharacteristics
（1）
MS+2,4-D2
++++
10
白色水质状，生长快
（2）
MS+2,4-D1
+++
12
白色水质状，生长快
（3）
MS+2,4-D0.5
++
25
白色松散，生长较快
（4）
MS+2,4-D0.5+CH
++
28
白色松散，生长较快
（5）
MS+2,4-D0.5+KT0.5
+
2
白色紧密，颜色由白转绿
（6）
MS+NAA0.5+6-BA0.5
+++
－
淡黄色，颗粒状
注:
愈伤组织生长情况分四级:
+很少 ++少 +++中等 ++++大量
Fourclassesweredividedaccordingtothecallusgrowth:
+verysmall ++small +++medium ++++large.
表2可以看出,2,4-D对枸杞愈伤组织的形成在一定范围内（0.5～2mg／L）随2,4-D浓度的增加,愈伤组织生长加快,但褐化时间提前。
当0.5mg／L2,4-D与0.5mg／LKT配合使用时，愈伤组织生长速度很低，而且变得十分坚硬，颜色也由白色转为绿色，近培养基部分2d后出现褐化；培养基中添加500mg／LCH对愈化组织的生长有很好的促进作用。
当把培养基含2,4－D0.5mg／L诱导出的愈伤组织转接到P2培养基后，愈伤组织逐渐转变为颗粒状胚性愈伤组织，与P2培养基上诱导的愈伤组织物质很相似（图版Ⅰ:
2）。
因此，如果用含2,4－D0.5mg／L的培养基诱导愈伤组织发生，用P2培养基进行继代培养，将获得大量颗粒状胚性愈伤组织。
因此，这种方法是枸杞进行离体快繁较为适宜的途径。
表3 不同植物激素对枸杞愈伤组织分化频率的影响Table3EffectsofdifferenthormonesondifferentiationrateofLyciumbarbarumL.calli
培养基（mg/L）
Medium
分化频率（％）
Regenerationrate
每块愈伤组织平均的苗数（个）
Averagenumberofshootsonasinglecallus
特征
Characteristics
6-BA2
100
12
大多数玻璃化
6-BA1
90
10
部分玻璃化
6-BA0.5
97
8
正常
6-BA0.5+NAA0.5
90
10
芽基部有愈伤组织产生
6-BA0.5+NAA0.01
93
11
正常
2.3分化培养
将经过P2培养基进行继代培养15d的愈伤组织转入附加3%蔗糖、0.8%琼脂，500mg／LCH,pH5.8～6.0含不同6-BA浓度的MS分化培养基，两周后开始形成芽点，可进一步发展成芽丛（图版Ⅰ:
3），所做不同植物激素配比实验结果表明，枸杞愈伤组织芽的分化需要一定浓度使用的5种含6-BA的培养基分化频率都在90％以上，6-BA浓度高,每块愈伤组织得苗数多,但玻璃化苗也多,6-BA与NAA配合使用,能显著提高愈伤组织的分化频率,但同时愈伤组织也得到增殖,分化得到的苗必须及时转移，否则苗的基部又会转化为愈伤组织。
单独使用6-BA，浓度为0.5mg／L或者附加NAA0.01mg／L时愈伤组织分化频率略为下降，但分化出的苗正常，比较几种培养基分化出苗的结果，以MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.01mg／L结果最好（表4）。
表4 枸杞芽的扩繁Table4Reproductionofbuds
培养基
Medium
繁殖系数（株／月.芽）
Coefficientofreproduction
特征
Characteristics
MS+6-BA1
0-5
转变为玻璃化苗
MS+6-BA0.5
10-30
部分有玻璃化现象
MS+6-BA0.2
50-150
正常苗
2.4芽的扩增
在愈伤组织上分化形成的芽，等长到2cm高时，将其沿基部切下，转入含不同6-BA浓度的培养基中，使其扩增，结果如表5。
从表5可以看出，以MS+6-BA0.2mg／L时，芽生长正常，经过20d的培养，每芽可产生50～150株无根苗（图版Ⅰ：
4），但BA为1mg／L时，芽不能进行扩增，培养20d后就转变为玻璃化苗，6-BA0.5mg／L的培养基虽能进行扩繁，但随着培养时间的延长，部分也转化为玻璃化苗。
2.5生根培养
将丛生芽沿基部切下，接种到生根培养基上诱导生根，结果如表5．
表5 不同植物激素浓度对枸杞幼芽生根的影响Table5EffectsofdifferenthormonesofLyciumbarbarumL
培养基（mg／L）
Medium
接种苗数（个）
Numberofplantedshoots
生根芽数（个）
Numberofshootswithinducedroot
生根率（％）
Rateofrootformation
MS0
50
2
4
MS+NAA1
50
0
0
MS+NNAA0.5
50
1
2
MS+NAA0.2
50
46
92
从表5可以看出，无激素或者高浓度的生长素不利于枸杞幼芽根的形成，低浓度的生长素对根的形成有促进作用，当培养基中含有NAA0.2mg/L时，能形成大量完整植株（图版Ⅰ：
5），生根率可达92%，且不定根较粗，并有侧根出现。
2.6试管苗移栽
培养基中取出立即移栽的幼苗一般不易成活，7d后就枯萎死亡。
但再生苗经过7d的练苗后，再进行移栽，所栽6盆36株幼苗，成活14株，成活率38.9%，再生苗移栽20d后开始生长，叶片变绿、变厚、侧枝萌发,30d后主茎杆形成,开始木质化,三个月后形成完整植株（图版Ⅰ:
6）。
3 讨 论
细胞胚的诱导和植株再生已有过报道〔4,5〕,并已用愈伤组织进行了悬浮培养〔6,7,8〕,最近,通过原生质体培养得到了愈伤组织,但没有形成再生植株。
本文报道的实验结果与以往相比,一是培养材料选用枸杞髓组织，二是筛选出了具高分化潜能的颗粒状愈伤组织,继代一年多仍保持较高的分化频率，为枸杞抗病突变体筛选、原生质体融合培养以及外源基因转移的研究提供了一个有用的系统。
杞髓组织由薄壁细胞组成，细胞间隙较大，在诱导培养条件下易于发生突变〔9〕，我们以其为材料进行离体培养并获得再生植株，这为枸杞筛选新的品种打下基础。
我们以枸杞髓组织为实验材料，在取材方面，采用石蜡封着切口，防止HgCl2和酒精等消毒液侵入髓组织内部而使髓细胞遭到破坏，得到比较满意的效果。
植物激素2,4-D在枸杞髓组织的愈伤组织诱导中有重要的作用，但高浓度的2,4-D不利于愈伤组织的诱导，而以0.5mg／L效果最佳，诱导率达100%。
以MS+0.5mg／L2,4-D诱导愈伤组织发生；以P2培养基进行继代培养；以MS+6-BA0.5mg／L+NAA0.01mg／L进行分化培养；以MS+0.2mg／LNAA进行生根培养，这是枸杞进行离体培养的一条理想途径。
第三章枸杞的栽培技术
第三章枸杞的栽培技术
第一节构杞对自然环境的要求
环境条件直接影响枸杞的生长发育及其体内的生理活动。
只有搞清楚枸杞同自然条件的关系，才能制定正确的田问管理技术措施，这对于枸杞获得丰产和提高品质均具有重要意义。
温度、光照、水分和土壤是枸杞所要求的最基本的自然条件，是枸杞生长不可缺少的生存因子。
枸杞是一种适应性很强的树种，对温度、光照、水分、土壤等条件要求不太严格。
下面逐一介绍这些生存因子。
一、温度
宁夏枸杞对温度的要求不太严格，并且具有一定的耐寒性。
其野生种的自然分布区处在北纬35。
。
45。
范围内，1月份平均气温一3．3。
C一一15．4℃，绝对最低气温一25．5℃-一41．5。
E，年平均气温4．4℃--12．7℃，7月份平均气温17．2℃--26．6。
C，绝对最高气温33．9。
C一42．9。
C。
在栽培条件下，它既能在海拔2807．7m、年平均气温4．2。
C、极端最低气温一33．6。
C的青海格尔木正常生长结果，也能在绝对气温一41．5℃的乌鲁木齐安全越冬，还能在无霜期135天、全年日照时数2970．5小时、≥l0。
C积温2804．。
C的内蒙古呼和浩特市开花结果（表5）。
据调查，1月份平均气温一4．8℃--7．1℃，年平均气温8．6℃。
9．2℃的区域是宁夏枸杞最适宜的栽培区。
但近年在一些枸杞新发展区，l月份平均气温为一3．3。
C一一15．4。
C，年平均气温为4．4℃--12．7℃也能生长良好，并获得较高产量。
宁夏枸杞一年中对温度的要求，因品种和生长发育阶段不同而异。
在休眠期需要低温，生长期需要高温。
冬季休眠时期耐寒能力很强，在一41．5℃的绝对低温条件下能安全越冬。
当春季气温稳定在7℃左右时，种子即可萌发，幼苗可抵御短期一2℃--一3℃低温。
3月下旬当地温达到0℃以上时，新根就开始生长，4月上旬地温达到8℃--14％时，新根生长最快，10月底地温降到l0。
C以下时，根系基本停止生长。
当4月初气温达5℃以上时，春芽开始萌动，花芽开始分化；4月中旬气温达l0％以上时，开始展叶；12。
（2以上时，春梢生长；15％以上时，生长迅速。
5月上旬气温达16。
C以上时，开始开花，17℃--22％开花最适宜。
果实生长发育的温度在16％以上，20％--25％最适宜。
秋季当气温下降到11℃时，果实生长发育缓慢，体形小，品质降低，但还能成熟。
当旬气温降到l0．8。
C以下时，进入冬季落叶期，随后进入休眠期。
二、光照
宁夏枸杞是强阳性树种，喜光。
光照强弱和日照长短直接影响枸杞的生长和发育。
光照不足，植株发育不良，结果少；光照充分，则植株发育良好，结果多，产量高。
在生产实践中常看到，被遮荫的枸杞树比在正常照下的生长弱，枝条细长，节间也长，木质化程度低，发枝力弱，枝条寿命短，尤其树膛内因缺光照而枯死的枝条多。
被遮荫树的叶片薄，色泽发黄，花果很少。
据调查，树冠各部位因受光照强弱不一样，枝条座果率也不一样。
例如，树冠顶部枝条的座果率比中部枝的高，外围枝座果率比内膛的高，南面枝座果率比北面高。
光照还会影响果实中可溶性固形物含量。
据测定，在同一株树上，树冠顶部光照充足，鲜果的可溶性固形物含量为16．33％，而树冠中部光照弱的果实可溶性固形物含量为13．68％。
由于光照对枸杞生长发育影响大，所以在生产中应很好地选择栽植密度、方式和修剪量，充分利用土地、空间和光照，才能既提高产品质量，又获得丰产。
三、水分
水是一切生物有机体必不可少的极重要的生态因子。
枸杞的生存和生产，水分是不可缺少的条件。
据测定，在成熟的枸杞浆果中水分的含量约占83％。
枸杞耐旱能力强。
野生种在年降雨量不足250ram的干旱、半干旱区仍能正常生长，开花结实。
这是因为枸杞的根系发达并能伸向较深远的土层吸收水分。
同时，从形态解剖上看，枸杞是等面叶，正反两面的栅栏组织都很发达，这种组织的细胞间隙小，使叶面水分蒸发受到节制，相对地保持了更多的水分，增强了耐旱能力。
但是，在栽培条件下若是获得丰产，就必须有足够的土壤水分供应。
有的枸杞园在结果期没有及时灌水，长期处于干旱状态，产量受到严重影响。
枸杞喜湿润条件，但又怕积水。
宁夏枸杞老产区的茨农说：
"枸杞离不开水，又怕水"。
枸杞最忌地表淹水和表土长期积水，在过湿的土壤中，容易诱发根腐病，引起枸杞树死亡。
据吴以德调查，宁夏中宁县恩和乡沙滩村曾在枸杞园周围种水稻，导致枸杞园地下水位上升，使l．9hm2枸杞受浸死亡。
可见枸杞园的地势要高，不能积水，一旦积水，应马上排除，才有利于枸杞生长。
据调查，枸杞在地下水位1．5m以下、20。
40cm土壤含水量15．27％一18．1％时，生长正常，最适宜的土壤含水量为20％。
25％。
地下水位过高，则对枸杞生长不利。
当地下水位在60--10Oem时，树体生长弱，发枝量少，枝条短，花果少，果实也小，叶色提早发黄，容易加重落花落果和落叶。
因为地下水位过高，土壤的通气条件恶化，会影响枸杞根系的呼吸和生长。
另外，地下水位过高会引起土壤次生盐渍化，使土壤可溶性盐含量增加，导致枸杞生长衰弱，产量低。
枸杞对水质的要求不严，宁夏枸杞老产区中宁县用矿化度为19／L以下的黄河水灌溉枸杞园，生长良好。
宁夏干旱地区的同心县王团乡和海原县高崖乡，用3。
69／L的苦水灌溉枸杞园，也生长良好。
水对枸杞树生长的影响因季节不同而异。
春季土壤水分不足时，影响萌芽和枝叶生长；秋季干旱，使枝条和根系生长提前停止；在花果期，尤其是果熟期，如果土壤水分足，果实膨大快，体积大；如果缺水，就会抑制树体和果实生长发育，使树体生长慢，果实小，还会促进花柄和果柄离层形成，加重落花落果，降低产量。
在生长季节，若连续阴雨时间长，枸杞易得霜霉病和黑果病，红熟了的果实会破裂，从而降低果实质量。
四、土壤
土壤作为枸杞的生存基础，供给其生长结实的营养和水分。
枸杞对土壤的适应性很强，在一般的土壤，如沙壤土、轻壤土、中壤土或粘土上，都可以生长。
枸杞的耐盐能力较强，一般在含盐量小于0．2％的土壤上生长良好，并且能获得高产。
甚至在含盐量达0．5％--l．0％的轻盐土上也能生长。
据有关资料介绍，枸杞的耐盐性仅次于胡杨。
但为了获得高产优质的果实，应选择在土层深厚、肥沃的轻壤土上建园最好，沙壤和中壤次之。
在盐渍化严重的土壤上，只能维持生存，不能正常生长和结实。
轻壤土之所以较适于枸杞生长，是因为它土质疏松，透水快，通气好。
但如果土壤沙性过强，则会造成肥水保持能力差，容易干旱，枸杞生长不良。
但如果土质过于粘重，如粘土和粘壤土，虽然养分含量较高，但因经常板结，土壤通气性差，对枸杞根系呼吸及生长都不利，枝梢生长缓慢，花果少，果粒也小。
如果粘土经过改良，如向地里增施麦秆、稻草或羊粪之类，既增加了土壤的疏松性又丰富了土壤养分，枸杞也能生长良好。
亦有资料表明，在土壤肥力较差、含钙量高、有机质少、质地较沙的灰钙土地区，只要加强培肥管理，也适于发展枸杞栽培。
枸杞的耐盐碱能力很强，适应范围也很广。
在新疆0一10Ocm土层含盐量0．5％时生长正常；在以硫酸盐为主的盐碱地上，土壤含盐量达l％时也能生长。
吴以德报道：
宁夏栽种枸杞的土壤大部分可溶性盐含量小于0．2％，凡丰产枸杞园的土壤含盐量多在0．5％以下，而且绝大部分小于0．1％。
丰产枸杞园土壤的盐分组成是以含钙的重碳酸盐为主，HC03-占阴离子总量的50．4％--74．6％，Ca2+占阳离子总量的40．2％。
66．4％。
个别土层随含盐量的增加，氯化物的相对含量增加较快，其盐分组成以碱金属（钾、钠）、氯化物为主。
在土壤表土和心土层含有少量的苏打（NazC03），土壤pH值达8．7的土壤中枸杞生长和结实很好，单产1500。
2250千克／hm2；宁夏主产区宁夏枸杞能在pH值8．2。
8．6、含盐量0．o9％--0．11％的土壤条件下形成单产23萄一4200千克／hm2的丰产园；个别新栽枸杞的土壤pH值9．8，在加强田问管理的情况下，枸杞仍然能正常生长，如新品种宁杞1号能
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