浙江中医药大学学生科研基金项目标书一份.docx
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浙江中医药大学学生科研基金项目标书一份
附件：
浙江中医药大学学生科研基金项目
申报表
（一式三份）
项目名称microRNA在肿瘤多药耐药形成过程中的作用探讨
项目负责人张副兴
专业年级中医学七年制2008级
起止时间2012.11-2013.11
浙江中医药大学
团委科研处
项目名称
microRNA在肿瘤多药耐药形成过程中的作用探讨
项目类别
√1、自然科学类学术论文2、社会科学类社会调查报告和学术论文3、科技发明制作4、其他
申请资助金额
√1.资助项目：
1500元；2.立项项目
项目负责人情况
姓名
张副兴
性别
男
出生年月
专业、年级
联系电话
项目组
成员情况
姓名
性别
专业、年级
出生年月
联系电话
研究意义、国内外同类研究现状
（一）研究意义
肿瘤多药耐药（multidrugresistance,MDR）是肿瘤化疗失败的重要原因之一。
MDR指除对诱导其产生耐药的药物产生抗药性外，对其他结构和功能存在差异的药物也可产生抗药性。
MDR的机制较为复杂，主要涉及ATP结合盒（ATP-bindingcassettetransporters，ABC）转运蛋白超家族成员介导的药物外排、肿瘤细胞对凋亡的耐受、肿瘤微环境改变等{1}。
越来越多的研究发现微小RNA（miRNA）与MDR高度相关。
miRNA是一类长约21-25个核苷酸的单链非编码RNA，通过结合到mRNA的3'非编码区（3’UTR）,降解mRNA或者抑制其翻译过程，从而抑制转录后基因表达。
miRNA通过对ABC转运蛋白、细胞凋亡的调节等途径，使其与MDR形成了密切的联系。
彻底探明microRNA在肿瘤多药耐药形成过程中的作用将有助于逆转剂的开发。
研究意义、国内外同类研究现状
研究意义、国内外同类研究现状
研究意义、国内外同类研究现状
研究意义、国内外同类研究现状
研究意义、国内外同类研究现状
研究意义、国内外同类研究现状
（二）国内外同类研究现状
1．基于ATP结合盒的MDR
ABC转运蛋白是通过依赖ATP的药物外排泵、介导MDR的一类膜转运蛋白，ABC转运蛋白的异常表达导致MDR。
人类49种ABC转运蛋白广泛涉及各种生理过程[2]，其中至少15种ABC转运蛋白被证实与MDR相关[3]。
ABC转运蛋白根据序列和结构同源性，可分为ABCA～ABCG七个亚家族[4]。
其中对ABCB1、ABCC1、ABCC2、ABCG2等研究较为透彻。
1.1调控ABCB1的表达
ABCB1（multidrugresistanceprotein1/P-glycoprotein，MDR1/P-gp，P-糖蛋白）是一种分子量为170KD的磷酸糖蛋白，属于ABC跨膜转运蛋白超家族一员，它可以转运包括药物、多肽、类脂等在内的数百种结构各异的复合物，从而影响药物的摄取和分布，是MDR经典机制之一[5]。
Zhu等[6]首次报道了miRNA通过调控MDR1/P-glycoprotein的表达调节耐药性。
作者发现MDR细胞株A2780DX5和KB-V中miR-27a和miR-451的表达量相对于其亲本A2780和KB-3-1显著上调。
用miR-27a和miR-451反义核苷酸转染A2780DX5细胞后，P-gp和MDR1mRNA的表达均降低。
相反，拟miR-27a和miR-451寡核苷酸处理后却使A2870中MDR1的表达量增加。
细胞对P-gp转运药物的敏感性和细胞内药物蓄积量在转染反义miR-27a和miR-451后均增加，从而证明miRNA通过MDR1/P-glycoprotein调节MDR。
1.2调控ABCC1的表达
ABCC1（multidrugresistance-associatedprotein1,MRP-1，多药耐药相关蛋白1）是ABC跨膜转运蛋白超家族一员，分子量190KD，在MRP蛋白家族中发现最早、研究最为深入[4]。
Liang等[7]在探索miRNA是否参与对MRP-1的调节与影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性时，使用miRNA微阵列分析了miRNA在VP-16耐药细胞MCF-7/VP及其亲本MCF-7中的表达水平,结果发现MCF-7/VP中MRP-1mRNA和蛋白表达量增高，而MCF-7/VP细胞miR-326的表达量低于其亲本MCF-7。
miR-326在一些晚期乳腺癌组织中也呈现低表达，且与MRP-1的表达量呈负相关。
此外，提高miR-326的水平可使MCF-7/VP细胞MRP-1的表达量降低，同时使细胞对VP-16和阿霉素的敏感性提高。
这些发现证实miRNA可通过MRP-1介导细胞耐药性。
1.3调控ABCC2的表达
ABCC2（multidrugresistance-associatedprotein2，MRP-2，多药耐药相关蛋白2）是ABC跨膜转运蛋白超家族一员，含1545个氨基酸，其结构与ABCC1相同[8]。
Xu等[9]研究了miRNA在结肠癌细胞MDR形成过程中的作用。
作者使用miRNA微阵列分析了结肠癌MDR细胞株HCT116/L-OHP及其亲本HCT116miRNA的表达水平。
miR-297在HCT116/L-OHP中的表达相对于其亲本HCT116显著降低。
MRP-2在铂类耐药细胞中是一种重要的MDR蛋白，同时MRP-2可能是miR-297作用的潜在靶点。
miR-297在一些结肠癌组织中表达下调且与MRP-2的表达水平呈负相关。
miR-297的异常表达降低了MRP-2蛋白表达水平且使细胞对药物敏感性均增加。
综上所述，miR-297可能通过调控MRP-2的表达从而产生耐药性。
1.4调控ABCG2的表达
ABCG2（breastcancerresistanceprotein，BCRP，乳腺癌耐药蛋白）是ABCG亚家族的第二大成员，分子量75KD，最初发现于乳腺癌MDR细胞[10]。
Li等[11]基于对以下研究的分析，建立了miR-328通过调节ABCG2造成胶质母细胞瘤干细胞的化疗耐药性的假设：
①Malzkorn等[12]发现高分级胶质瘤细胞miR-328表达量呈低水平；②ABCG2减少细胞内化疗药物的蓄积，与胶质瘤分期和耐药正相关[13]；③ABCG2表达水平越高，胶质瘤的分期越高。
ABCG2的过表达在多种肿瘤耐药形成过程中起重要作用。
ABCG2的表达量在肿瘤干细胞中尤其增高[14]；④Jin等[15]证明100%的胶质瘤干细胞（即CD133+细胞）ABCG2呈阳性，然而与其对应的CD133阴性（CD133-）细胞呈ABCG2阴性。
更进一步，用竞争性抑制剂尼卡地平抑制ABCG2表达可使CD133阳性（CD133+）细胞对米托蒽醌敏感。
从而提出合理的假设，即ABCG2阳性（ABCG2+）干细胞在胶质瘤化疗耐药中起重要作用，ABCG2可能是miR-328的作用靶点。
2.细胞对凋亡的耐受
凋亡是细胞内在的程序性死亡，对维持组织内稳定十分重要。
越来越多的研究发现肿瘤细胞对凋亡的耐受可能与MDR有关。
miRNA通过众多途径使得细胞对凋亡产生耐受，从而促成了MDR。
2.1Bcl-2和XIAP
Bcl-2是细胞凋亡的抑制基因,在大多数人类肿瘤中都表现为过度表达。
Bcl-2的异常表达是MDR的重要机制之一。
而XIAP是人类凋亡抑制蛋白家族的重要成员,是一种具有细胞凋亡抑制作用的蛋白。
Zhu等[16]在探索miRNAs在人类胃癌和肺癌细胞株MDR形成过程中的作用时，发现miR-200bc/429簇下调，而Bcl-2和XIAP在MDRSGC7901/VCR和A549/CDDP细胞中相对于其亲本SGC7901、A549均上调。
miR-200bc/429簇的高表达可使SGC7901/VCR和A549/CDDP对抗癌药敏感。
Bcl-2和XIAP3’UTR又都与MDR密切相关，从而表明Bcl-2和XIAP是miR-200bc/429族的共同靶基因。
miR-200bc/429簇的强化表达导致Bcl-2和XIAP蛋白水平降低，同时使这两种耐药细胞对VCR和CDDP引起的凋亡敏感，从而证明miR-200bc/429在MDR形成过程中起重要作用，其可能机制是通过以Bcl-2和XIAP为靶点对细胞凋亡产生调节作用。
2.2PTEN
PTEN作为一个重要的肿瘤抑制基因,可通过PIP3途径、FAK途径、MAPK途径等发挥其脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性,诱导细胞凋亡。
Liang等[17]在探究miR-19是否参与调节细胞MDR和癌细胞对化疗药物的敏感性时，发现miR-19在三种MDR细胞MCF-7/TX200、MCF-7/VP-16、MCF-7/MX100中的表达均高于其亲本MCF-7，miR-19a的表达与PTEN成负相关。
应用miR-19a抑制剂可使MDR细胞对化疗药物敏感。
体内应用化学修饰的miR-19a抑制剂LNA-antimiR-19a可使细胞对化疗药物敏感，说明miR-19a可通过调节PTEN从而调节MDR。
2.3E-cadherin
E-cadherin（上皮性钙黏附蛋白）是粘附分子中钙离子依赖的细胞粘附素家族中的一员,对维持正常上皮细胞形态和结构完整性起着重要作用。
Chen等[18]研究了miRNA-200c对胃癌细胞SGC7901/DDP的生物学特点的影响及钙粘蛋白在miRNA-200c调节路径中的作用。
将SGC7901/DDP细胞及其亲本SGC7901分别转染pre-200c和E-cadherinsiRNA，RT-PCR检测SGC7901/DDP转染Pre-200c后miRNA-200c的表达，显示miRNA-200c在SGC7901/DDP细胞的表达量相对于其亲本SGC7901显著提高。
MTT法检测细胞对顺铂、5-FU、紫杉醇和阿霉素的药物敏感性，发现转染pre-200c组显著低于阴性对照组。
同时检测转染后SGC7901/DDP细胞增殖情况，发现细胞增殖相对于阴性对照组显著降低。
Westernblot法检测钙粘蛋白、Bax、Bcl-2的表达，发现E-cadherin和Bax的表达量在pre-200c转染组显著高于阴性对照组，而Bcl-2显著低于对照组。
此外，钙粘蛋白在SGC7901转染钙粘蛋白siRNA后明显的被抑制。
E-cadherinsiRNA显著下调了Bax的表达量而显著上调Bcl-2的表达量。
以上结果证明miRNA-200c可直接通过钙粘蛋白调节细胞凋亡，这可能是逆转耐药的机制。
2.4ADAM-17
ADAM-17（去整合素-金属蛋白酶17）是一种锌依赖的多结构域N型跨膜蛋白,在肿瘤的病理过程中起重要作用。
XU等[19]在探究了ADAM-17和miR-222在MDR大肠癌中的作用时，发现ADAM-17呈高表达，miR-222的表达水平与ADAM-17的表达水平呈负相关。
提高HCT116/L-OHP和HCT-8/VCR细胞miR-222量可降低ADAM-17蛋白量水平，使细胞凋亡增加。
从而说明miR-222对调节ADAM-17在MDR形成过程中起到重要作用。
3.其他
CSF-1（M-CSF,巨噬细胞集落刺激因子），由单基因编码的包含一个链间二硫键的同源二聚体糖蛋白，在恶性肿瘤多异常升高。
Yang等[20]在研究miR-130b在卵巢癌MDR形成过程中的作用时发现，卵巢癌中miR-130b的下调与FIGOIII-IV临床分期和组织学分化的恶性程度有关。
miR-130b在MDR卵巢癌细胞中表达下调，而恢复miR-130b的表达可使细胞对抗癌药物敏感。
在卵巢癌组织和耐药细胞中均发现miR-130b高甲基化，甲基化程度与miR-130b的表达水平呈负相关，用5-aza-CdR脱甲基化可激活miR-130b在卵巢癌细胞中的表达，同时使细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性增强。
CSF-1在卵巢癌组织和细胞株中的表达和miR-130b的表达水平呈负相关，荧光素酶检测（Luciferaseassay）证实CSF-1是miR-130b的直接靶点。
去除CSF-1可使卵巢癌细胞对抗癌药物产生敏感性，部分减弱耐药性起到类似miR-130b抑制剂作用。
综上所述，miR-130b的低表达通过结合CSF-1的3’UTR,促成了卵巢癌MDR的形成。
参考文献
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（2）:
325-334.
研究内容、
预期研究目标
研究内容
本课题旨在通过基于ATP结合盒、对凋亡的耐受及其他可能的作用途径的分析，探讨microRNA在肿瘤多药耐药形成过程的作用，分析其潜在的研究价值，
预期研究目标
1.总结出microRNA逆转肿瘤多药耐药的若干经典的途径及非经典途径。
2.分析出microRNA在各自途径中所发挥的作用。
3.提出肿瘤多药耐药逆转剂开发的相关建议。
拟采取研究（实验）方法步骤和解决主要问题
拟采取研究（实验）方法步骤
1.通过对pubmed、springer、OVIDLWW、EBSCO等外文数据，以microRNA、drugresistance，multiple，neoplasma等MeSH为主题词，检索出相关研究文献。
2.将获得的文献按照ATP结合盒介导的耐药、对凋亡耐受介导的耐药、其他耐药机制等分类。
3.总结分析各个肿瘤疾病所涉及的microRNA种类、介导耐药的机制，形成相关研究报告，发表相关学术论文。
4.提出有关肿瘤多药耐药逆转剂的开发建议。
解决主要问题
1、外文文献的查全率与查准率的权衡、外文文献全文的免费获得。
2、文献分类标准的建立。
3、MicroRNA介导肿瘤多药耐药机制的总结和分析。
预期
成果
1、完成本项目相关研究报告1份。
2、在省级及以上医学期刊发表学术论文1-2篇。
经费
预算
文献资料打复印费用:
300元
论文审稿费、版面费：
1200元
总计：
1500元
指导老师意见
拟同意推荐
（盖章）
2012年10月30日
所在学院审核意见
（盖章）
年月日
专家评审意见
（盖章）
年月日
基金项目委员会
意见
（盖章）
年月日
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