蛭弧菌高密度培养方法.docx

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蛭弧菌高密度培养方法

蛭弧菌高密度培养方法

一.大肠杆菌的发酵罐培养

1.斜面菌种制作：

培养基：

蛋白胨10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠5g/L琼脂15-20g/LPH7.0-7.2

＊方法1：

冻干管（青霉素瓶）中加入4ml生理盐水，震荡均匀制成菌悬液，转接于30m/150ml牛膏蛋白胨培养液中，37℃200rpm/min培养24h，用接种环划线于固体培养基上，37℃培养18-24h，选择表面光滑园整大小形态均一的多个单菌落接种于斜面，其中22x200mm大斜面数十支（一月生产用种），15x150mm斜面4-5支作为保种，保种至少两种方式，2支液体矿油保种，2支甘油保种（每支斜面注入2-4ml生理盐水、无菌水或培养液刮洗菌苔，然后集中于灭菌空试管中，震荡均匀，另取含灭菌（至少两次）的浓度50％甘油的溶液备用，取灭菌2ml离心管数个，分别用灭菌长径滴管吸取菌悬液0.8-0.9ml甘油浓度50％甘油的溶液0.8-0.9ml注入离心管中，旋盖震荡均匀后置于-20冰箱保存（甘油管的多少根据月生产量而定，每月使用1-2支甘油管活化，划线取单菌落于生产斜面的制作，暂不进行保种），一般保存6-12月，甘油冷冻保藏适用于好氧细菌和酵母菌中长期保存。

方法2：

取一支冻干管在无菌条件下用无菌吸管吸取0.3-0.5ml培养液，滴入内管内，轻微震荡（吸管协助），直到均匀制成菌悬液。

用无菌滴管吸取0.2-0.3ml菌悬液滴在两支空白斜面（18x180mm）上涂布（余下的菌悬液转接于4-5ml液体培养基中适温培养，镜检菌体个体形态等），用接种环蘸去少量菌液在平板或茄型瓶（45-50ml/200ml）平面划线，挑取典型菌落（生长快菌落大）转接于斜面，37℃培养18-24h，再次转接于10支斜面，其中2-3支保种（至少两种保种方式），其余作为生产用种出发种。

生产使用大试管（22x200mm），注入20ml培养基/支，棉塞牛皮纸扎好，高压灭菌30-40min，稍冷，摆放斜面12-24h，37℃空培24h，基本无冷凝水，无杂菌时方可转接，每支出发菌种转接20-30支，37℃培养18-24h，置于4-6℃冰箱保存备用，使用期不过30d。

2.三角瓶培养：

培养基：

蛋白胨10g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）5g/L葡萄糖5g/L氯化钠5g/L氯化铵1.0g/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠6.0g/LPH7.0-7.2

三角瓶培养：

4x200-250ml/1000ml三角瓶，八层纱布或棉塞密闭，高压灭菌待接。

取一支生产斜面试管，加灭菌自来水5ml，用接种环轻轻刮取菌苔，然后将倒入三角瓶中，纱布密闭，置于摇床上37℃180-200rpm/min培养12-16h。

3.种子罐培养（30L/50L）

3.1培养基：

蛋白胨15g/L牛肉膏5g/L酵母粉（膏）10g/L葡萄糖12g/L或甘油10ml/l氯化钠5g/L氯化铵1.0g/L磷酸二氢钾3.0g/L磷酸二氢钠6.0g/L硫酸镁0.25g/LPH7.0-7.2

3.2准备材料：

消泡剂：

0.1-0.2％豆油或0.01-0.03％泡敌，由于这些消泡剂难溶于水，使用

前制成悬浊液，在0.5mpa，30min备用。

注：

开始培养时消泡剂少用。

可直

接加入与培养基一起灭菌。

补料：

500g/l葡萄糖溶液或甘油，补加甘油培养液PH下降较慢。

酸碱调节剂：

20％氢氧化钠溶液或氨水，流加维持PH在7.0-7.4

3.3种子罐培养：

30L/50L种子罐

1-3h迟缓期3-12h对数期13-18h稳定期

30L/50L种子罐，500ml/500ml补料瓶，先用500ml/1000ml三角瓶高压灭菌，然后在无菌条件下转入灭菌的补料瓶。

补料培养基：

葡萄糖500g/l蛋白胨80g/l酵母膏50g/lMgSO410g/lPH7.5-7.8（灭菌前）灭菌温度115℃30min

3.1通气量：

1-4h1:

0.5-0.65-7h1:

0.8-0.98-16h1:

1.0

溶氧量的变化：

通过搅拌和改变通气量控制溶氧量在20％以上。

培养8h左右溶氧突然升高，显示发酵液中的葡萄糖已经耗尽，随后PH开始升高（菌体利用乙酸），加入葡萄糖后溶氧迅速下降。

3.2转速：

1-4h150r/min，5-16h180-200r/min，罐压保持0.05mpa。

3.3PH：

20％NaOH溶液或28％氨水调节，10％HCl溶液，酸碱瓶灭菌，酸碱液可不灭。

3.4消泡剂：

添加量：

泡敌（GPE聚醚型—聚氧乙烯氧丙烯甘油）0.01-0.02％（1.0ml/10L培养液），豆油0.10-0.15％宁少勿多。

3.5补料：

对数期前期补料，补料时间及补料量：

4-6h30ml/h90ml，7-12h50ml/h300ml,13-16h30ml/h120ml，总计510ml左右。

每小时分三次平均添加，即20min添加一次。

3.6移种与取样：

一般对数期后期移种，平板培养结合镜检

注：

培养3-12h对数生长期，8-12h菌体生长速率下降，适合移种。

4.发酵罐300L/500L发酵罐

300L/500L种子罐，12L/20L补料罐补料培养基同种子罐补料培养基。

4.1通气量：

1-4h1:

0.5-0.6，5-15h1:

1.0，16-20h1:

0.6-0.8。

21-24h1:

0.5-0.6

4.2转速：

1-4h150r/min5-15h200r/min16-20h160-180r/min,21-24h150r/min，罐压保持0.05mpa

4.3PH调节：

流加10％盐酸及20％NaOH溶液，使种子罐的PH稳定在7.0-7.2

20％NaOH溶液（酸碱瓶灭菌，溶液最好灭菌）补加量一般4-6L（90ml/150ml发酵罐培养8h补加160g/l的NaOH溶液4.0L）.

4.4消泡剂：

添加量：

泡敌0.01-0.02％（1.0ml/10L培养液）豆油0.10-0.15％宁少勿多。

4.5接种量：

4-5％，较大接种量，种子液中含大量的水解酶类，利于对基质的

利用，缩短延迟期，过高菌体生长过快，消耗大量营养，影响后期的生长。

4.6补料：

补料时间及补料量：

4-6h550ml/h1650ml，7-12h900ml/h5400ml，13-16h补料550ml/h2200ml，17-24h350ml/h2800ml，约12000ml.每小时分四次平均添加，即15min添加一次。

4.7乳糖诱导液：

乳糖200g/l，对数期中后期适合加乳糖对细胞诱导，即培养8-10h，葡萄糖消耗基本完毕，菌体生长缓慢，开始利用乙酸为碳源进行二次生长，此时开始诱导，保存乳糖在培养液的浓度1.0g/l，持续诱导4-6h至发酵结束，诱导开始以后停止补糖，此阶段暂不做。

4.8放料与取样时机：

发酵液培养24h，取样染色镜检.对培养液灭活121℃30min

4.9分装：

用灭菌血清瓶分装菌液（8L/10L）或将在发酵罐灭活的大肠杆菌14000r/min离心分离15min得菌泥，灭菌自来水清洗2-3次，然后按1:

1加入灭菌自来水或生理盐水混均后置于4-6℃保存备用。

二.噬菌蛭弧菌培养

1．工艺流程

冷冻管（5ml生理盐水或无菌水）→30ml/150ml三角瓶→4x250ml/500ml三角瓶培养→4x5l/10l血清瓶或30l/50l种子罐→300l/500l发酵罐→检验→分装→调配→检测→包装出厂注：

冻干管活化后部分菌悬液保种用，生产用种一般使用保存种。

2．生产工艺

原材料，100ml浓缩宿主菌C600，蛭弧菌冻干管，氯化钙，氯化镁等。

2.1三角瓶培养

冷冻管活化及保种：

取冷冻管一支，加入4-5mL无菌水制成菌悬液，接种于灭菌自来水（5mlC600浓菌液）30ml/150ml三角瓶中，30-31℃150r/min44-48h。

适度稀释（107108）双平板培养2-3d，取菌斑数量多且清晰的平板培养至融汇菌斑，分别用8-10ml灭菌自来水、1/500NB液或脱脂牛奶（冷冻干燥法保存），浸泡2-3h，为提高浸泡效果可用接种针平板划线，制成菌悬液。

，在超净工作台上并酒精灯火焰封口条件下，用灭菌的长滴管吸取浸泡菌液转移至浓度50％甘油的溶液5ml/试管中，震荡摇匀，取灭菌2ml离心管数个，分别用灭菌长径滴管吸取菌悬液2.0ml注入离心管中，旋盖震荡均匀后置于冰箱冷冻（-20℃）保存（甘油管的多少根据月生产量而定，每月使用1-2支甘油管活化），生产用菌种的制备：

取多个融汇菌斑（无杂菌）平板，每个加入8-10ml1/500NB培养液，划线浸泡2-3h，吸取菌悬液集中于灭菌试管，根据一月内的生产用菌量确定菌悬液的量，用灭菌长滴管吸取菌悬液约2.0ml于灭菌2ml离心管中，旋盖震荡均匀后置于4-6℃冰箱保存。

4x250mL自来水/500mL三角瓶（20-30mg/l氯化钙,20-30mg/l氯化镁）,调PH7.2-7.5，于121℃高压灭菌30min，冷却后加入15mL灭菌的C600浓宿主菌,2.0ml（2ml离心管）蛭弧菌悬液，八层纱布扎好，25-30℃震荡培养30-35h即为种子液（对数期中、后期）。

2.2血清瓶或30l/50l种子罐

10L血清瓶内装5L自来水（20-30mg/l氯化钙,20-30mg/l氯化镁）,调PH7.2-7.5，于121℃灭菌30min，冷却后备用。

培养后的种子液按3-5%（250mL）接种量种入已灭菌血清瓶内，同时加入C600浓宿主菌150mL，并用八层纱布（灭菌）包扎瓶口，放入30℃恒温培养室内震荡培养30-35h，

注：

若为产品培养时间适当延长至40-44h，培养18-22h补加C600菌液50ml。

30l/50l种子罐培养：

宿主菌添加量：

3-5％即0.9-1.0L（宿主菌的起始浓度107-109cfu/ml）

消泡剂：

0.1-0.2％豆油或0.01-0.02％泡敌（泡沫少适当减量）。

接种量：

3-5％（1x107cfu/ml）

通气量：

1-15h1:

0.3-0.5，16-35h1:

1.0。

溶氧量不低于20％（对氧的要求不太明显）

补料时间及补料（C600菌液）量：

18-22h20ml/h100ml，23-35h30ml/h390ml.约500ml.每小时分四次平均添加。

（海洋蛭弧菌经过大约13h的潜伏期后进入对数期）

转速：

1-15h50-60r/min，16-35h100-120r/min。

罐压保持0.05mpa

据资料介绍：

一般迟缓期1-13h，存在两次生长现象，一次14-27h呈对数期生长，二次35-45h对数期生长，期间稳定10h.

做试验检测培养过程中培养液的OD值和PH的变化，确定接种时机和补料时间。

2.3.300l/500l发酵罐：

宿主菌添加量：

9-10L（培养基中宿主菌的浓度106-109cfu/ml蛭弧菌均可生长，高浓度宿主菌更利于生长），即10L培养液灭菌后静止沉淀，吸取上清液，保留1L沉淀菌液作为宿主菌的来源。

消泡剂：

0.1-0.2％豆油或0.01-0.02％泡敌（1ml/10l）（泡沫少适当减量）。

接种量：

4-5％（1x107cfu/ml）

通气量：

1-15h1:

0.3-0.5，16-35h1:

1.0溶氧量20％.罐压0.05mpa.

补料时间及补料（C600菌液）量：

18-22h200ml/h1.0L，23-35h300ml/h

3.9L.36-48h150ml/h1.95L,约6.85L，每小时分四次平均添加。

转速：

1-15h50-60r/min，16-35h100-120