9微生物实验指导书109本.docx
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9微生物实验指导书109本
《微生物学》实验指导书
烟台南山学院
工学院食品科学与工程系
二○一三年十二月
前言
1、实验前必须认真预习实验指导书及实验内容，明确实验目的、步骤、原理、回答实验教师的提问，回答不合要求者，须重新预习，才能进行实验。
2、对规定实验外确属需要的内容，可先提出实验原理和方法，经指导教师同意后，方可进行实验。
3、做实验时必须严格遵守实验室的规章制度和仪器设备的操作规程，服从指导教师的指导。
4、爱护仪器设备，节约使用材料，使用前详细检查，使用后要整理就位，发现丢失或损坏应立即报告，未经许可不得动用与本实验无关的仪器设备及其它物品，不准将任何实验室物品带出室外。
5、实验时必须注意安全，防止人身和设备事故的发生，若发生事故应立即切断电源，及时向指导教师报告，并保持现场，不得自行处理，待指导教师查明原因并排除故障后，方可继续实验。
6、进入实验室后应保持安静，不得高声喧哗和打闹，不准随地吐痰，不准乱抛纸屑杂物，要保持实验室和仪器设备的整齐清洁。
7、实验完毕后，经指导教师检查仪器设备、工具、材料及实验记录后方可离开。
8、实验后要认真完成实验报告，包括分析结果、处理数据、绘制曲线及图表等。
对不合格要求的实验报告应退回重做。
9、对违反实验规章制度和操作规程、擅自动用与本实验无关的仅器设备、私自拆卸仪器而造成事故和损失的肇事者必须写出书面检查，视情节轻重和认识程度按规定处理。
目录
实验一环境中微生物的检测1
实验二细菌的革兰氏染色和酵母菌形态观察3
实验三食品中菌落总数的测定6
实验一环境中微生物的检测
实验类型：
验证性实验学时：
4
实验要求：
必修适用专业：
食品科学与工程、食品质量与安全
一、实验目的
1．学习环境中微生物的检测方法。
2．比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。
二、实验内容
1、讲解环境中微生物的检测原理。
2、演示环境中微生物的测定流程。
3、学生操作了解微生物测定的方法和过程。
三、仪器设备
恒温培养箱、记号笔
四、所需耗材
1、营养琼脂平板（NA）:
成分：
蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂17g，蒸馏水1000mL，pH7.2。
制法：
将除琼脂外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂，分装于烧瓶内，121℃，15min高压灭菌备用。
2、马铃薯葡萄糖琼脂平板（PDA）：
成分：
马铃薯（去皮）200g，葡萄糖（或蔗糖）20g，琼脂20g，水1000mL。
制法：
pH值自然。
将马铃薯去皮、洗净、切成小块，称取200g加入1000mL蒸馏水，煮沸20min，用纱布过滤，滤液补足水至1000mL，再加入糖和琼脂，溶化后分装，121℃灭菌20min。
另外，用少量乙醇溶解0.1g氯霉素，加入1000mL培养基中，分装灭菌后可用于食品中霉菌和酵母菌计数、分离。
五、实验原理、方法和手段
1、实验原理
自然环境中普遍存在着各种各样的微生物，检测微生物的存在，简单的方法是应用一般营养琼脂，使微生物细胞或其孢子落到营养琼脂表面，在适宜温度下即可大量繁殖，形成肉眼可见的群体——菌落。
不同微生物各自具有不同的菌落形态。
2、实验手段
以无菌操作倒培养基到平皿中，进行微生物数量的检测。
六、实验步骤
1、取营养琼脂、PDA平板各一个，在皿盖上用记号笔标明班级、姓名及编号。
2、分别打开皿盖，做如下处理：
（1）置实验台上，于空气中暴露5分钟。
（2）置地面上，脚击地板，于振动的空气中暴露5分钟。
（3）用自己的手指分别触摸平板（轻按即可）。
（4）呼出气体于平板上。
3、把经以上处理的平板分别盖上皿盖，将培养皿倒置恒温培养箱内培养，营养琼脂平板置于37℃培养箱中培养48h，PDA平板置于28℃培养箱中培养2-3天后检查结果。
七、实验结果
此处可放实验数据或完成的程序，作品照片等
八、实验注意事项
操作者经专业学习，指导老师同意，才能单独操作，操作中一定要注意安全。
九、预习与思考题
观察平板上有无微生物群体——菌落出现，并比较不同微生物种类所形成的菌落在形态上的差别。
如PDA平板出现菌落较少或尚未长出时，置28℃恒温下继续培养2天观察。
（1）观察NA、PDA平板上微生物的颜色、透明度、光泽度、形态、凸起。
（2）比较NA、PDA平板上微生物的种类、数量。
（3）分别计算不同平板及不同处理下各平板上出现的菌落数。
十、实验报告要求
1、用规范的实验报告纸
2、写清实验的目的、原理、内容、方法、设备等。
3、本实验为验证性实验，写出心得体会。
实验二细菌的革兰氏染色和酵母菌形态观察
实验类型：
综合性实验学时：
4
实验要求：
必修适用专业：
食品科学与工程、食品质量与安全
一、实验目的
1、学习并初步掌握革兰氏染色法。
2、了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
3、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。
4、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。
二、实验内容
1、讲解细菌的革兰氏染色和酵母菌形态观察。
2、演示微生物染色流程。
3、学生操作细菌的革兰氏染色、和酵母菌形态显微镜观察。
三、仪器设备
显微镜、酒精灯、载玻片、盖玻片、接种环、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、滴瓶、放大镜、擦镜纸、吸水纸、生理盐水等。
四、所需耗材
1.菌种：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养18～20h的枯草芽孢杆菌、牛肉膏蛋白胨琼脂培养24h的大肠埃希氏菌、在麦芽汁琼脂平板上培养48～72小时的啤酒酵母。
2.试剂：
草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%乙醇、番红染色液
草酸铵结晶紫染色液：
将2.5g结晶紫研细后，加入25mL95%酒精使之溶解，配成A液，将1.0g草酸铵溶于100mL蒸馏水配成B液，两液混合即成。
路哥氏碘液：
碘1.0g、碘化钾2.0g、蒸馏水300.0mL。
先将碘化钾溶解在一小部分的蒸馏水中，再将碘溶解在碘化钾溶液中，然后加入其余的蒸馏水即成。
番红染色液：
番红2.0g，蒸馏水100.0mL。
用蒸馏水溶解即成2%番红染色液。
吕氏碱性美蓝染色液：
溶液A美蓝（亚甲基蓝、甲烯蓝）0.3g、95%酒精30.0mL，溶液B氢氧化钾0.01g、蒸馏水100.0mL，分别配制溶液A及溶液B，然后混合即可。
五、实验原理、方法和手段
1、实验原理
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
由于革兰氏阳性菌细胞壁含肽聚糖多、脂类少，且是紧密的立体网状结构，用乙醇洗脱不出染料，故为蓝紫色；革兰氏阴性菌细胞壁含肽聚糖少、脂类多，且呈疏松的片层结构，乙醇使脂类溶解将染料洗脱，因此可被复染而呈现红色。
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细胞质有明显的分化，细胞形态一般呈圆形、卵圆形、圆柱形或柠檬形，有的形成藕节状或竹节状的假菌丝。
酵母菌的无性繁殖方式主要是芽殖，其大小通常是常见细菌的几倍至几十倍。
酵母菌的菌落一般较细菌菌落大且厚，圆形、湿润、较光滑，多数呈乳白色，少数呈红色，偶见黑色。
美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。
用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。
2、实验方法和手段
使用显微镜观察细菌革兰氏染色，并对酵母菌进行染色观察其形态，根据其运动形态鉴定酵母菌的生存状况。
六、实验步骤
（一）细菌的革兰氏染色
1、涂片：
取一块干净的载玻片，并在其中央滴一小滴生理盐水。
接种环在酒精灯上杀菌后从斜面挑取少量菌种与玻片上的水滴混匀后并涂布成一均匀的薄层。
涂布面一般以直径1cm大小范围为宜。
2、干燥：
自然晾干或在火焰上烘干。
3、固定：
置于酒精灯火焰上加热固定（迅速通过火焰三次）。
4、染色
（1）初染：
将结晶紫滴于涂片上染色1min，用蒸馏水冲洗。
（2）媒染：
滴加路哥氏碘液，媒染1min，用蒸馏水冲洗。
（3）脱色：
用95%乙醇边滴边洗25s，或在涂片处加1～2滴95%酒精浸泡25s后，立即用水冲洗。
（4）复染：
用1～2滴番红复染2min，用蒸馏水冲洗。
5、干燥：
用吸水纸将多余的水分吸干。
6、镜检：
先低倍镜，后高倍镜，最后用油镜观察。
（二）酵母菌形态观察
1、菌落特征观察
观察菌落表面是湿润还是干燥、有无光泽、隆起形状、边缘整齐度、菌落的大小及颜色等特征。
2、酵母菌形状与出芽繁殖的观察
（1）制片：
在载玻片上滴一小滴美蓝液，无菌操作用接种环取啤酒酵母少许（注意观察酵母菌与培养基结合是否紧密、是否粘稠、是否容易挑取），与美蓝液混合均匀，染色2～3min。
（2）加盖玻片：
先将盖玻片一端与菌液接触，然后慢慢放下使其盖在菌液上。
（3）镜检：
先用低倍镜，后用高倍镜观察酵母细胞的形态、构造和出芽情况，并注意区分死细胞和活细胞。
七、实验结果
1、将观察结果记入下表
菌名
菌体颜色
细胞形态
G+或G-
枯草芽孢杆菌
大肠杆菌
2、描述啤酒酵母的菌落特征。
3、绘制啤酒酵母的细胞和芽体的形态结构图，并注明各部分名称
八、实验注意事项
操作者经专业学习，指导老师同意，才能单独操作，操作中一定要注意安全。
九、预习与思考题
1、革兰氏染色法成败的关键是什么？
为什么？
2、革兰氏染色应选用何种菌龄的细菌？
为什么？
3、在同一平板培养基上，如何鉴别细菌和酵母菌的菌落？
十、实验报告要求
1、用规范的实验报告纸
2、写清实验的目的、原理、内容、方法、设备等。
3、本实验为验证性实验，写出心得体会。
实验三食品中菌落总数的测定
实验类型：
综合性实验学时：
8
实验要求：
必修适用专业：
食品科学与工程、食品质量与安全
一、实验目的
学习和掌握平板活菌计数法的基本原理和方法。
二、实验内容
1、讲解食品中菌落总数测定原理、方法。
2、演示食品中菌落总数测定的流程。
3、学生操作食品中菌落总数测定。
三、仪器设备
恒温培养箱（37℃）、恒温水浴锅、酒精灯、试管（18*180mm）、试管架、无菌培养皿、无菌移液管（10mL和1mL）、电炉、pH试纸（pH5.5～9.0）、锥形瓶（300mL和500mL）、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、酒精棉球、打火机等。
四、所需耗材
1、检样：
鲜牛奶
2、培养基：
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水
五、实验原理、方法和手段
1、实验原理
菌落总数是指食品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1mL检样中所含细菌菌落总数，主要作为判别食品被污染程度的标志。
菌落总数测定最常用的方法是平板活菌计数法，即将待测样品经适当稀释后，制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，取一定量的稀释液和适量的培养基于平板中混匀，经培养后，平板上出现单一菌落，即为一个菌落形成单位（CFU），根据平板上长出的菌落数，计算每g（mL）样品中的含菌数。
2、实验方法和手段
对检测样品进行稀释，对不同稀释度倒平皿，每个稀释度倒3个平皿，同时做平行，倒置培养，48h后观察菌落生长情况。
六、实验步骤
1、取样：
以无菌操作取样。
2、样品的稀释：
以无菌操作吸取检样25mL，放于盛有225mL灭菌生理盐水的三角瓶中，振摇10min，制成1:
10的均匀稀释液。
取1mL灭菌吸管吸取1:
10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管中，振摇混匀，制成1:
100的稀释液。
另取1mL灭菌吸管，按上述操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。
根据样品情况，做成10-3、10-4、10-5稀释液。
3、 检样的吸取：
另取一支1mL吸管，从生理盐水开始依次10-5、10-4、10-3各吸取1mL注入无菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。
4、培养：
将稀释液移入平皿后，将凉至46℃的营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。
待琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）℃温箱内培养（48±2）h。
5、菌落计数：
可用肉眼观察，必要时可用放大镜观察，记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数以菌落形成单位（CFU）表示。
（1） 选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数，低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计，每个稀释度的菌落数采用两个平板的平均数。
（2）其中一个平皿有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平皿作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，则可以计算半个平皿后乘以2以代表一个平板菌落数。
（3）当平板上出现菌落间无明显界限的链状生长时，则应每条链作为一个菌落计数。
6、结果报告
（1）菌落总数的计算方法
①若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）样品中菌落总数结果。
②若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内，按下式计算:
式中：
N：
样品中菌落数；
C：
平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；
n1：
第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；
n2：
第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；
d：
稀释因子（第一稀释度）。
③若所有稀释度的平板菌落总数均大于300CFU，则对最高稀释度的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
④若所有稀释度的平板菌落总数均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数计算。
⑤若所有稀释度的平板菌落总数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30CFU，或大于300CFU，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
⑥若所有稀释度的平板（包括液体样品的原液）均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数计算。
（2） 报告：
单位CFU/g（mL）
七、实验结果
1、结果
项目
10-3
10-4
10-5
菌落总数
2、计算
3、经测定牛乳中的菌落总数是：
八、实验注意事项
操作者经专业学习，指导老师同意，才能单独操作，操作中一定要注意安全。
九、预习与思考题
1、为什么要对检样进行稀释处理？
2、食品中检出的菌落总数是否代表该食品上的所有细菌数？
为什么？
3、为什么营养琼脂培养基在使用前要保持在46±1℃的温度？
十、实验报告要求
1、用规范的实验报告纸
2、写清实验的目的、原理、内容、方法、设备等。
3、本实验为验证性实验，写出心得体会。
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