生物制药工艺学总结.docx
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生物制药工艺学总结
生物制药工艺学
第一章生物药物概述
1、我国药物三大药源指是化学药物、生物药物、中草药。
2、现代生物药物已形成四大类型,包括基因工程药物、基因药物、天然生物药物、医学生物制品。
3、药物、生物药物、生物制品
药物:
用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健物质,有4大类:
预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。
生物药物:
是利用生物体、生物组织、细胞或其成分,综合应用生物和医学、生物化学和分子生物学、微生物学和免疫学、物理化学和工程学和药学原理和方法进行加工、制造而成一大类预防、诊断、治疗和康复保健制品。
广义:
从动物、植物、微生物和海洋生物为原料等制取各种天然生物活性物质以及人工合成或半合成天然物质类似物;还包括生物工程技术制造生产新生物技术药物。
医学生物制品:
一般指:
用微生物(包括细菌、噬菌体、立克次体、病毒等)、微生物代谢产物、动物毒素、人或动物血液或组织等加工制成预防、治疗和诊断特定传染病或其它有关疾病免疫制剂,主要指菌苗、疫苗、毒素、应变原和血液制品等。
《新生物制品审批办法》生物制品定义:
是应用普通或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得微生物、细胞及各种动物和人源组织和液体等生物材料制备,用于人类疾病预防、治疗和诊断药品。
4、生化药物、微生物药物
生化药物:
指从生物体(动物、植物、和微生物中获得天然存在生化活性物质(或者合成、半合成天然物质类似物),其有效成分和化学本质多数比较清楚,通常按其化学本质和药理作用分类命名。
微生物药物:
是一类特异天然有机化合物,包括微生物初级代谢产物、次级代谢产物和微生物结构物质,还包括借助微生物转化产生药物或中间体。
5、基因重组药物和基因药物有什么区别?
基因重组药物属于基因工程药物,这类药物主要是应用基因工程和蛋白质工程技术制造重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。
而基因药物不是基因工程药物,这类药物是以基因物质(RNA或DNA及其衍生物)作为治疗物质基础,包括基因治疗用重组目DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等。
6、生物药物有哪些作用特点?
答:
药理学特性:
1)活性强:
体内存在天然活性物质
2)治疗针对性强,基于生理生化机制
3)毒副作用一般较少,营养价值高
4)生理副作用常有发生,可能具免疫原性或产生过敏反应
理化特性:
1)生物材料中有效成分浓度低,杂质种类多且含量相对较高
2)生物活性物质组成结构复杂、稳定性差
3)生物材料易染菌、腐败
4)生物药物制剂特殊要求:
缓释、控释
第二章生物制药工艺技术基础
1、生化活性物质浓缩可采用方法有盐析浓缩、有机溶剂沉淀浓缩、用葡聚糖凝胶浓缩、用聚乙二醇透析浓缩、超滤浓缩、真空减压浓缩和薄膜浓缩。
2、生化活性物质常用干燥方法有减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。
3、冷冻干燥是在低温、低压条件下,利用水升华性能而进行一种干燥方法。
4、固定化酶常采用方法可分为吸附法、包埋法、交联法和共价键结合法四大类。
选择题:
5、由于目蛋白质和杂蛋白分子量差别较大,拟根据分子量大小分离纯化并获得目蛋白质,可采用(C)
❑A、SDS凝胶电泳B、盐析法C、凝胶过滤D、吸附层析
6、分离纯化早期,由于提取液中成分复杂,目物浓度稀,因而易采用(A)
❑A、分离量大分辨率低方法B、分离量小分辨率低方法
❑C、分离量小分辨率高方法D、各种方法都试验一下,根据试验结果确定
7、简述生物活性物质分离纯化主要原理。
生物大分子分离纯化主要原理是:
1)根据分子形状和大小不同进行分离,如差速离心和超离心、膜分离、凝胶过滤等;
2)根据分子电离性质(带电性)差异进行分离,如离子交换法、电泳法、等电聚焦法;
3)根据分子极性大小及溶解度不同进行分离,如溶剂提取法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等;
4)根据物质吸附性质不同进行分离,如选择性吸附和吸附层析等;
5)根据配体特异性进行分离,如亲和层析法等。
8、生化制药六个阶段
(1)原料选择和预处理
(2)原料粉碎
(3)提取:
从原料中经溶剂分离有效成分,制成粗品工艺过程。
(4)纯化:
粗制品经盐析、有机溶剂沉淀、吸附、层析、透析、超离心、膜分离、结晶等步骤进行精制工艺过程。
(5)浓缩、干燥及保存
(6)制剂:
原料药(精制品)经精细加工制成片剂、针剂、冻干剂、粉剂等供临床应用各种剂型。
9、生物活性物质来源及生物材料选择质量准则
(一)生物活性物质来源
●动物脏器
●血液、分泌物和其他代谢物
●海洋生物
●植物
●微生物
●开发生物新资源
(二)生物原料选择质量准则:
⏹有效成分含量高新鲜材料;
⏹来源丰富易得;
⏹成本比较低;
⏹杂质含量少
⏹原料采集不破坏生态环境,对环境友好原材料资源。
10、常用活性物质提取方法有哪些?
①酸、碱、盐水溶液提取方法②表面活性剂提取方法和反胶束提取方法③有机溶剂提取
④双水相萃取法⑤超临界萃取法
11、盐溶作用原理?
在稀盐溶液中,盐离子作用于生物大分子表面,增加了表面电荷,使之极性增加,水合作用增强,促进形成稳定双电层,对生物大分子起到助溶作用。
12、活性物质提取时保护性措施哪些?
活性物质保护措施:
(1)缓冲盐系统:
防止pH大幅度变化
(2)保护剂:
还原剂、酶底物、金属鳌合剂
(3)抑制水解酶作用
■加EDTA除去重金属抑制酶活性
■选择热变性,使蛋白酶变性
■添加酶抑制剂
(4)其它保护措施(防过冷、过热、酸、碱、紫外线、搅拌、高频振荡等)
13、生物制药中分离制备方法基本原理有哪些?
(1)据分子形状和大小:
差速离心和超离心、膜分离(透析,电渗析)和超滤,凝胶过滤法。
(2)据分子电离性质差异性:
离子交换法,电泳法,等电聚集法。
(3)据分子极性大小及溶解度不同:
溶剂提取法,盐析法,等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。
(4)据物质吸附性质不同:
选择性吸附法和吸附层析法。
(5)据配体特异性进行分离:
亲和层析法。
第三章生物材料预处理、细胞破碎和液-固分离
1.细胞培养液预处理方法。
(书P117-120)
1)细胞及蛋白质处理
(1)加入凝聚剂
(2)加入絮凝剂(3)变性作用(4)吸附
(5)等电沉淀(6)加各种沉淀剂沉淀
2).多糖去除
3).高价金属离子去除
2.凝聚作用和絮凝作用原理各是什么?
凝聚作用:
指在某些电解质作用下,使胶体粒子扩散双电层排斥电位降低,破坏了胶体系统分散状态,而使胶体粒子聚集过程。
絮凝作用:
当往胶体悬浮液中加入絮凝剂时,胶粒可强烈吸附在絮凝剂表面功能团上,而且一个高分子聚合物许多链节分别吸附在不同颗粒表面上,形成架桥联接,形成粗大絮凝团沉淀出来,有助于过滤。
3.常用细胞破碎方法有哪些?
1)机械法:
匀浆法、珠磨法、超声波
2)物理法:
干燥、冻融、渗透压冲击
3)化学法:
化学试剂处理、制成丙酮粉
4)生物法:
酶解法、自溶
4.固液分离方法有哪些?
1)、细胞及蛋白质处理
(1)加入凝聚剂
Al2(SO4)3·18H2O、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3
(2)加入絮凝剂
❑絮凝剂:
有机高分子,易溶,链长,活性功能基团多
❑影响因素:
分子量、用量、pH、操作条件(搅拌)
(3)变性作用
(4)吸附
❑加入吸附剂:
活性碳除热原
❑加入反应剂:
相互作用形成沉淀吸附蛋白质
(5)加各种沉淀剂沉淀
2)过滤:
常规和错流
3)离心:
过滤式离心和沉降式离心
第四章萃取法
1.掌握萃取和反萃取,分配系数和分配比,萃取比和萃取率,分离因素概念。
(1)萃取:
料液和萃取剂接触后,料液中溶质向萃取剂转移过程
(2)反萃取:
将萃取液和反萃取剂(含无机酸或碱水溶液或水)相接触,使某种被萃入有机相溶质转入水相过程。
(3)分配定律:
一定温度、一定压力下,某一溶质在互不相溶两种溶剂间分配时,达到平衡后;在两相中活度之比为一常数,如果是稀溶液,可以用浓度代替活度,即:
K称为分配系数。
(4)在萃取过程中,溶质在两相分子形式常常并不相同,仍然采用类似分配定律公式作为基本公式。
这时候溶质在萃取相和萃余相中浓度,以分配比表示。
分配比(D):
两相中各种化学形式进行分配溶质总浓度比值
K表示在特定平衡条件下,被萃物在两相中有效浓度(即分子形式一样)比值;
D表示实际平衡条件下被萃物在两相中总浓度(即不管分子以什么形式存在)比值。
分配比随着萃取条件变化而改变。
(5)萃取因素:
也称萃取比,指被萃取溶质进入萃取相总量和该溶质在萃余相中总量之比。
通常以E表示。
(6)萃取率:
一种萃取剂对某种溶质萃取能力(工业上用)
(7)分离因素:
料液中溶质并非是单一组分,除了所需产物(A)外,还存在有杂质(B)。
分离因素常用b表示,其定义为:
在同一萃取体系内两种溶质在同样条件下分配系数比值。
值越大(或越小)分离效果越好,越接近于1,分离效果越差。
2.萃取方法有哪些?
萃取按照操作方式分类:
(一)单级萃取
(二)多级错流萃取(三)多级逆流萃取
方法:
溶剂萃取、双水相萃取、反胶团萃取、超临界萃取
3.影响溶剂萃取因素?
(1)、乳化和破乳化
(2)、pH影响
(3)、温度和萃取时间影响
(4)、盐析作用影响
(5)、溶剂种类、用量及萃取方式选择
4.萃取步骤有哪些?
(1)、混合
(2)、液—液两相分离
(3)、离心萃取
(4)、溶剂回收
5.双水相萃取、反胶束萃取、超临界流体萃取基本原理及各自优点?
(1)双水相萃取
原理:
利用生物物质在互不相溶两水相间分配系数差异进行分离过程。
优点:
保留产物活性、可连续化操作
(2)反胶束萃取:
原理:
表面活性剂溶于非极性溶剂中,并使其浓度超过临界胶束浓度,便会在有机溶剂内形成聚集体,非极性基团在外,极性基团则排列在内,形成一个极性核,此极性核具有溶解极性物质能力。
当含有此种反胶束有机溶剂和蛋白质水溶液接触后,蛋白质及其他亲水性物质能够溶于极性核内部水中,由于周围水层和极性基团保护,蛋白质不和有机溶剂接触,从而不会造成失活。
优点:
具有成本低、溶剂可反复使用、萃取率和反萃取率都高等。
(3)超临界流体萃取
原理:
利用处于临界压力和临界温度以上一些溶剂流体所具有特异增加物质溶解能力来分离纯化技术。
当气体物质处于其临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上时,不会凝缩为液体,只是密度增大,具有许多特殊物理化学性质:
❑流体密度接近于液体密度,
❑粘度接近于气体;
❑在临界点附近,超临界流体溶解度对温度和压力变化非常敏感;
优点:
①具有广泛适应性:
②萃取效率高,过程易于调节:
③分离工艺流程简单:
④有些分离过程可在接近室温下完成
缺点:
分离过程必须在高压下进行,设备及工艺技术要求高,投资比较大,普及应用较为困难。
6.什么是流体,利用CO2作为超临界萃取优点
流体是液体和气体总称。
流体是由大量、不断地作热运动而且无固定平衡位置分子构成,它基本特征是没有一定形状和具有流动性。
利用CO2作为萃取剂主要有以下优点:
(1)二氧化碳超临界温度(Tc=31.06℃)是所有溶剂中最接近室温,可以在35~40℃条件下进行提取,防止热敏性物质变质和挥发性物质逸散。
(2)在CO2气体笼罩下进行萃取,萃取过程中不发生化学反应;又由于完全隔绝了空气中氧,因此,萃取物不会因氧化或化学变化而变质。
(3)由于CO2无味、无臭、无毒、不可燃、价格便宜、纯度高、容易获得,使用相对安全。
(4)CO2是较容易提纯和分离气体,因此萃取物几乎无溶剂残留,也避免了溶剂对人体毒害和对环境污染。
(5)CO2扩散系数大而粘度小,大大节省了萃取时间,萃取效率高。
7、破乳方法主要有哪些?
1)加表面活性剂:
改变界面张力
2)离心:
促进乳状液滴碰撞聚集
3)电解质:
中和电荷,盐析蛋白质
4)加热:
促液滴布朗运动增加,降低黏度
5)吸附:
介质对油和水吸附能力差异破乳
6)高压电:
破坏双电层等
7)稀释:
降低乳化剂浓度
8)其他:
超滤、反应萃取、结合萃取剂和破乳剂筛选
第五章固相析出分离
1.固相析出法主要包括盐析法,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,结晶法及其它多种沉淀方法等。
2.按照一般习惯,析出物为晶体时称为结晶法,析出物为无定形固体则称为沉淀法。
3.KS盐析法、β盐析法
右下图示:
盐离子浓度和蛋白质溶解度关系曲线,在盐析区,符合公式
logS=b-Ksm
S——蛋白质溶解度,g/L;m—盐离子强度;Ci——i离子浓度,mol/L;Zi——i离子化合价;
b——常数,为纵坐标上截距;Ks——盐析常数
两种类型:
(1)在一定pH和温度下改变离子强度(盐浓度)进行盐析,称作Ks盐析法。
由于蛋白质对离子强度变化非常敏感,易产生共沉淀现象,因此常用于提取液前处理。
(2)在一定离子强度下仅改变pH和温度进行盐析,称作β盐析法。
由于溶质溶解度变化缓慢,且变化幅度小,因此分辨率更高,后期分离(结晶)。
4.结晶包括三个过程:
(1)形成飽和溶液;
(2)晶核形成;(3)晶体生长。
5.晶体质量主要是指晶体大小、形状和纯度等3个方面。
选择:
1、在一定pH和温度下改变离子强度(盐浓度)进行盐析,称作(A)
A.KS盐析法B.β盐析法C.重复盐析法D.分部盐析法
2、盐析法和有机溶剂沉淀法比较,其优点是(B)
A.分辨率高B.变性作用小C.杂质易除D.沉淀易分离
3、将配基和可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物,该复合物可选择性地和蛋白质结合,在一定条件下沉淀出来,此方法称为(A)
A.亲和沉淀B.聚合物沉淀C.金属离子沉淀D.盐析沉淀
4、影响晶体大小主要因素和下列哪些因素无关(D)
A.过饱和度B.温度C.搅拌速度D.饱和度
思考题
1.沉淀和结晶有何不同?
常用沉淀方法包括哪些?
结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出,形成新相过程。
沉淀是溶液中难溶解固体物质从溶液中析出过程。
⏹结晶法:
析出物为晶体。
⏹沉淀法:
析出物为无定形固体。
沉淀方法:
(1)有机溶剂沉淀法
(2)等电点沉淀(3)成盐沉淀法
(4)亲和沉淀(5)高分子聚合物沉淀法(6)表面活性剂沉淀法
2.何谓盐析?
其原理是什么?
常用盐析方法有哪些?
影响盐析主要因素有哪些?
盐析操作时常用盐是什么?
(1)盐析法是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度差异,通过向溶液中引入一定数量中性盐,使目物或杂蛋白以沉淀析出,达到纯化目方法。
(2)原理:
盐溶现象和盐析作用
盐析作用原理是:
破坏双电层:
在高盐溶液中,带大量电荷盐离子能中和蛋白质表面电荷,使蛋白质分子之间电排斥作用相互减弱而能相互聚集起来。
破坏水化层:
中性盐亲水性比蛋白质大,盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去了水化膜,暴露出疏水区域,由于疏水区域相互作用,使其沉淀。
(3)影响盐析因素
①无机盐种类
盐析用盐选择:
盐析作用要强
盐析用盐需有较大溶解度
盐析用盐必须是惰性
来源丰富、经济
②溶质(蛋白质等)种类:
Ks、β
③溶质(蛋白质等)浓度:
2~3%
④温度
⑤pH
(4)盐析中常用盐:
硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠。
硫酸铵是最常用蛋白质盐析沉淀剂
3.有机溶剂沉淀法主要原理是什么?
影响有机溶剂沉析主要因素有哪些?
(1)主要原理:
①亲水性有机溶剂加入溶液后降低了介质介电常数,使溶质分子之间静电引力增加,聚集形成沉淀。
②水溶性有机溶剂本身水合作用降低了自由水浓度,压缩了亲水溶质分子表面原有水化层厚度,降低了它亲水性,导致脱水凝集。
以上两种因素相比较,脱水作用比静电作用强。
(2)影响沉淀效果因素
①有机溶剂种类②pH影响③温度④无机盐含量
⑤某些金属离子助沉淀作用⑥样品浓度
4.什么是结晶?
结晶过程包括哪些?
在何种条件下,溶液中才有晶体析出?
(1)溶液中溶质在一定条件下因分子有规则排列而结合成晶体。
结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出,形成新相过程。
(2)过程:
①形成过饱和溶液;②晶核形成;③晶体生长
(3)溶质只有在过饱和溶液中才能析出
条件:
推动力:
形成新相(固体)需要一定表面自由能。
因此,溶液浓度达到饱和溶解度时,晶体尚不能析出,只有当溶质浓度超过饱和溶解度后,才可能有晶体析出。
晶核:
最先析出微小颗粒是以后晶体中心,称为晶核。
首先形成晶核,由Kelvin公式,微小晶核具有较大溶解度。
实质上,在饱和溶液中,晶核是处于一种形成—溶解—再形成动态平衡之中,只有达到一定过饱和度以后,晶核才能够稳定存在。
5.提高晶体质量途径
晶体质量包括三个方面内容:
晶体大小、形状和纯度
(1)晶体大小
1)过饱和度
过饱和度值应大至使结晶操作控制在亚稳区内,又保持较高晶体生长速率,使结晶高产而优质。
2)温度(缓慢冷却)
3)搅拌速度:
适当,不宜太快
4)晶种:
诱导结晶,控制晶体形状大小均匀度
(2)晶体形状
⏹控制晶体生长速度和结晶温度
⏹控制过饱和度
⏹选择不同溶剂
⏹调节溶液pH
⏹有目地加入某种能改变晶形杂质
(3)晶体纯度
杂质对晶体成长速率影响较为复杂,有杂质能抑制晶体成长,有能促进成长,有能改变晶型。
⏹过滤分离母液中杂质
⏹晶体越细小,杂质越多
⏹洗涤有利提高纯度
⏹结晶速度过快,易产生“晶蔟”,包含杂质
(4)晶体结块
原因:
粒度不齐、空气湿度高、温度高、受压、贮存时间增长
措施:
控制粒度分布、良好外形、干燥密闭容器贮存
(5)重结晶:
晶体用合适溶剂溶解后再次结晶,提高纯度
第六章吸附分离法
1、吸附剂按其化学结构可分为两大类:
一类是有机吸附剂,如活性炭、淀粉、大孔吸附树脂等;另一类是无机吸附剂,如白陶土、氧化铝、硅胶、硅藻土等。
2、常用吸附剂有活性炭、硅胶和白陶土等。
3、大孔网状聚合物吸附剂按骨架极性强弱,可分为非极性、中等极性、极性和强极性吸附剂四类。
选择:
⏹1、用大网格高聚物吸附剂吸附弱酸性物质,一般用下列哪种溶液洗脱(D)
❑A.水B.高盐C.低pHD.高pH
⏹2、“类似物容易吸附类似物”原则,一般极性吸附剂适宜于从何种溶剂中吸附极性物质(B)
❑A.极性溶剂B.非极性溶剂C.水D.溶剂
⏹3、活性炭在下列哪种溶剂中吸附能力最强?
(A)
❑A.水B.甲醇C.乙醇D.三氯甲烷
⏹4、关于大孔树脂洗脱条件说法,错误是:
(A)
❑A.最常用是以高级醇、酮或其水溶液解吸。
❑B.对弱酸性物质可用碱来解吸。
❑C.对弱碱性物质可用酸来解吸。
❑D.如吸附系在高浓度盐类溶液中进行时,则常常仅用水洗就能解吸下来。
问答:
1、吸附原理
吸附作用:
界面上分子同时受到不相等两相分子作用力,界面分子力场不饱和,即存在一种固体表面力,能从外界吸附分子、原子或离子,并在吸附剂表面附近形成多分子层或单分子层。
2、大网格吸附剂及其吸附特点
大孔网状吸附剂(大网格吸附剂):
在树脂聚合时加入惰性致孔剂,待网格骨架固化和链结构单元形成后,用溶剂萃取或蒸馏水洗将致孔剂去掉,形成不受外界环境条件影响孔隙,其孔径远大于2~4nm,可达100nm,故称“大孔”。
特点:
①选择性好、解吸容易、理化性质稳定、机械强度好、可反复使用等优点。
②其孔隙大小、骨架结构和极性,可按照需要,根据不同原料和合成条件而改变,因此可③适用于吸附各种有机化合物。
④适合弱电解质及非离子型化合物分离。
3、大网格吸附剂吸附操作过程
⑴树脂选择⑵吸附条件选择⑶洗脱条件选择
预处理、上样、吸附、洗杂、洗脱、再生
第七章凝胶层析
⏹1、葡聚糖凝胶孔径大小取决于交联度,其越小,凝胶孔径越大;而琼脂糖凝胶孔径却依赖于琼脂糖浓度。
⏹2、琼脂糖凝胶一个特征是分离分子量范围非常大,其分离范围随着凝胶浓度上升而下降,颗粒强度随浓度上升而提高。
选择:
⏹1、凝胶层析中,有时溶质Kd>1,其原因是(B)
❑A.凝胶排斥B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低
⏹2、凝胶层析中,有时小分子溶质Kd<1,其原因是(A)
❑A.水合作用B.凝胶吸附C.柱床过长D.流速过低
⏹3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出是(A)
❑A.分子量最大B.体积最大C.分子量最小D.体积最小
⏹4、为了进一步检查凝胶柱质量,通常用一种大分子有色物质溶液过柱,常见检查物质为蓝色葡聚糖,下面不属于它作用是(C)
❑A.观察柱床有无沟流B.观察色带是否平整
❑C.测量流速D.测量层析柱外水体积
思考题
1.凝胶层析原理及特点。
凝胶层析原理:
是将样品混合物通过一定孔径凝胶固定相,由于各组分流经体积差异,使不同分子量组分得以分离层析方法。
特点:
(1)凝胶层析操作简便、设备简单(仅需一根层析柱)。
(2)分离效果较好,重复性高,样品回收率高,接近100%。
(3)分离条件缓和。
(4)应用广泛。
(5)分辨率不高,分离操作较慢。
2.柱床体积、内水体积、外水体积、基质体积、洗脱体积、分配系数、全渗入、全排阻
⑴柱体积(VA):
柱体积是指凝胶装柱后,从柱底板到凝胶沉积表面体积,又称“床”体积(VA)。
⑵外水体积(Vo):
色谱柱内凝胶颗粒间隙,这部分体积称外水体积,亦称间隙体积,常用V0表示。
⑶内水体积(Vi):
因凝胶为三维网状结构,颗粒内部仍有空间,液体可进入颗粒内部,水总和为内水体积,又称定相体积,常用表示。
不包括基质体积(Vg)。
VA=V0+Vi+Vg
V柱内空间=Vo+Vi
柱床体积VA可以通过加入一定量水至层析柱预定标记处,然后测量水体积来测定。
VA=1/4pD2h计算
外水体积Vo可以通过测定完全排阻大分子物质洗脱体积来测定,一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积物质。
因为它分子量大(为200万),在各种型号凝胶中都被排阻,并且它呈蓝色,易于观察和检测。
⑷峰洗脱体积(淋出体积Ve):
是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液体积,常用Ve表示。
Ve=V0+Vi,aceVi,ace是Vi一部分,它和Vi之比成为Kd(分配系数)
Ve=V0+ViKd
(5)(排阻系数)分配系数Kd
⏹当Kd=1时,洗脱体积Ve=V0+Vi,为全渗入。
⏹当Kd=0时,洗脱体积Ve=V0,为全排阻。
⏹0<Kd<1时,洗脱体积Ve=Vo+KdVi,为部分渗入。
因此分子正常Kd值0~1之间,这种由小到大Kd值顺序决定了物质流出顺序。
3.了解葡聚糖凝胶、生物凝胶、琼脂糖凝胶结构及特点
⑴葡聚糖凝胶(Sephadex)
①结构
商品名为SephadexG类。
交联葡聚糖基本骨架是葡聚糖。
再经3-氯-1,2-环氧丙烷为交联剂,形成三维网状结构高分子化合物。
其交联度是通过交联剂加量及反应条件来控制。
②性质:
稳定性。
存在非特异性吸附
⑵聚丙烯酰胺凝胶(生物凝胶)
①结构:
商品名为生物凝胶-P(Bio-GelP)。
该凝胶由丙烯酰胺