登革热实验室检测指南.docx
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登革热实验室检测指南
附件2
登革热实验室检测指南
一、目的
（一）及时发现、诊断病例.
（二）及时了解伊蚊媒介携带登革病毒状况。
（三）病毒分型和溯源。
（四）为登革热流行趋势的预测、预警和制定防治对策、措施提供科学依据。
二、检测对象
（一）疑似和临床诊断病例（按照登革热诊断标准WS216—2008）。
（二）伊蚊成蚊和幼虫.
三、样本采集、保存和运输
（一）临床标本采集
用无菌真空干燥管，采集患者非抗凝血,及时分离血清，分装2份,保存于带螺旋盖、内有垫圈的冻存管内，标记清楚后低温保存,其中1份用于现场实验室检测，1份用于上级预防控制机构复核（附件1，附表1）。
1。
登革热临床诊断病例及疑似病例,每次采集血液标本5mL。
2。
登革热临床诊断和疑似的住院病例（包括初筛阴性）,应采集双份血液标本，入院当天和出院前1天各一份。
3。
疫点首发病例,必要时应采集第二份血标本，距第一份血样采集日期间隔在7天以上。
（二）蚊媒标本采集
疫点内采集的伊蚊成蚊及幼虫，分类鉴定后，填写媒介标本采集信息表，按照采集地点分装，每管10—20只.
（三）标本保存、运送
标本应-70℃以下保存，血液标本可—20℃以下保存，但不超过1周。
标本运送时采用低温冷藏运输,避免冻融，样本运输应遵守国家相关生物安全规定。
四、检测内容
（一）实验室检测
登革热疑似病例发生所在地医院和/或县（市）疾控机构采集病例血清,检测登革病毒抗原、核酸或抗体，检测流程参见图1.
（二）复核检测
1.送市或省级疾病预防控制机构的临床标本,抽样30％进行复核检测，疫点首发病例需采用病原学和/或双份标本血清学方法复核检测，暴发疫情复核检测不少于5例，疫情少于5例者应全部检测,病毒核酸阳性标本应分型检测。
2.疫点首发病例，重症病例、输入病例急性期标本应采用PCR方法进行分型检测，阳性者分离病毒，从临床标本或所分离病毒中扩增E蛋白编码基因，完成序列分析。
3。
每次暴发疫情应开展病毒全基因组序列分析。
4.实验室检测阴性临床病例以及重症病例，应对恢复期血清进行IgM、IgG抗体和/或中和抗体检测。
（三）媒介标本检测
1.核酸检测
捕获的伊蚊成蚊或幼虫，进行核酸分型检测，并扩增病毒E蛋白编码基因，完成序列分析。
2.病毒分离
病毒核酸阳性的标本由国家、省或有条件的市级疾病预防控制机构进行病毒分离、基因组序列分析。
图1登革热疑似病例实验室检测流程
五、实验室检测方法
（一）临床标本检测
1、病原学检测
病原学检测主要适用于急性期血液标本。
（1）抗原检测：
一般发病后6天内血液标本NS1抗原检出率高。
标本中检出NS1抗原可以确诊病毒感染，适用于现场快速检测,可用于早期诊断（附件2，3）。
（2）核酸检测:
一般发病后6天内血液标本病毒核酸检出率高.在病人血清中检出病毒核酸，可确诊而且能够分型，可用于早期诊断，但核酸检测容易因污染而产生假阳性，因此要求严格分区操作（附件4）。
（3）病毒分离：
一般发病后5天内血液标本病毒分离率较高。
将标本接种于蚊源细胞（C6/36）或哺乳动物细胞（BHK21、Vero）进行分离培养（附件5），出现病变以后,用检测抗原或核酸的方法鉴定病毒.分离到登革病毒可以确诊，但其耗时长,不适于快速诊断。
2.血清学检测
血清学特异性抗体检测主要适用于发病5天以后血液样本,但需注意可能与其他黄病毒感染发生交叉反应。
（1）血清特异性IgM抗体：
采用ELISA、免疫层析等方法检测。
IgM抗体阳性，提示患者可能新近感染登革病毒，适用于登革热早期诊断，但单份标本不能确诊（附件6）。
（2）血清特异性IgG抗体:
采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测.患者恢复期血清IgG抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊（附件7,8）。
（3）中和抗体：
采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测,可用于分型。
患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。
（二）媒介标本检测
1.标本处理
将分类后的伊蚊成蚊或幼虫，按照采集地点,每10～20只为一份进行研磨处理（附件9）.
2.病毒核酸检测
用RT—PCR的方法进行登革病毒核酸检测（见附件4）。
3.病毒分离
病毒核酸阳性的标本进行病毒分离（见附件5）。
六、实验室质量控制
（一）标本采集、保存和运送
采集的标本要做好标识，并记录标本的基本信息和流行病学信息,按本指南要求采集、保存和运送。
（二）实验室检测
1.根据发病时间，按本指南要求选择不同的检测方法。
2.核酸检测要防止各种污染,按操作规范设立相应对照。
3.应对检测试剂开展质控评价.
（三）各级疾病预防控制机构应定期开展督导检查、实验室技术人员培训与考核，及时发现问题。
七、结果的报告和反馈
疫点首发病例、重症病例和输入病例实验室检测结果24小时内反馈标本送检单位。
省级疾病防控机构应每年1月将上一年登革热实验室病原学（包括核酸检测、病毒分离、序列测定）监测结果,报国家疾病预防控制中心（见附表2），将结果发送至denguetest＠126。
com。
八、生物安全
登革热实验室检测应按照《病原微生物实验室生物安全管理条例》等相关规定要求，做好生物安全工作。
附件：
1.血液标本采集.血清分离。
运送.保存标准化操作程序
2。
酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
3.免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
4.RT-PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序
5.细胞培养分离登革病毒
6。
IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体
7.酶联免疫法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
8。
免疫荧光法检测登革病毒IgG抗体标准操作程序
9.蚊媒标本处理标准操作程序
附表:
1。
疑似登革热病人检材送检一览表
2.病原学检测结果一览表
附件1
血液标本采集、血清分离、运送、保存标准化操作程序
1目的
正确采集血液标本、分离血清、运送和保存。
2范围
适用于有资质的人采集登革热患者或疑似患者血液标本、分离血清、编号、分装、保存和运送.
3操作步骤
3。
1采血
3。
1。
1用70％酒精擦拭静脉穿刺部位待30秒钟以上。
3.1.2然后用一根碘酊或碘伏棉签消毒皮肤（1—2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒），从穿刺点向外以1.5—2cm直径画圈进行消毒。
3.1.3用70％酒精脱碘。
3.1.4严格执行三步消毒后（注意对碘过敏的患者，只能用70%酒精消毒，消毒60秒钟）,待穿刺部位酒精挥发干燥用无菌真空管,采集患者非抗凝血5mL.
3。
2分离血清
3.2.1轻缓颠倒采血管数次，使血液与促凝剂混匀后静置，待血块完全凝固（放置时间过长会造成溶血，避免留置过夜）。
3.2。
23000rpm离心，5分钟,然后用无菌吸管小心取上清转入3支冻存管，应避免吸取血细胞.
3.2.3标记。
用标签纸或持久性标记笔在冻存管的侧壁标记标本编号，顶端标记序列号，标记清楚后将血清放进标本盒，保存于2—8℃冰箱待初筛检测或运送保存。
在编码规则为“地区拼音首字母（JH）年份（2位）月（2位）—序列号（3位）"，如景洪市2013年8月份采集的第12份血标本的血清编号为JH1308-012，冻存管顶端分别标记012—1，012—2和012—3。
3。
3运送保存.
3。
3。
1如果24小时能够完成初筛检测，并将标本运送至上级单位，运送前应将标本保存于2-8℃冰箱,运送时采用低温冷藏运输。
3.3.2如果不能及时运送，运送前应将标本保存于-20℃冰箱,运送时采用干冰或低温冷藏运输。
3。
3。
3样本长期保存应记录剩余血清量和盒中位置，保存于—70℃以下冰箱。
3.3.4所有样本运输和保存应遵守国家相关生物安全规定。
4注意事项
4。
1使用后的注射器和针头应放置于耐扎的容器中,最后集中高压消毒，在任何情况下均不应试图将针头重新盖帽。
4.2采血结束后脱掉手套并弃于耐高压的废弃袋中，以备集中高压灭菌，并立即用肥皂和水洗手。
4.3若发生针刺、皮肤破损或其它损伤，应立即用肥皂和水清洗伤口,不要立即止血.
4。
4当血液污染了身体的任何地方或发生针刺等事故时，均应及时报告上级并按医疗救护规程进行评估和救护。
附件2
酶联免疫法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
1目的
酶联免疫法检测患者血清中登革病毒NS1抗原.
2适用范围
适用于患者血清或血浆中登革热病毒NS1抗原的快速检测。
3实验前准备
3。
1核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2—8℃冰箱或冰上。
4检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒抗原检测试剂盒（酶联免疫法）（万泰公司）
6检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL-2）中进行,灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL-1）内进行。
7操作步骤
7.1将试剂盒在冰箱中取出，放置室温平衡30分钟,使用前将试剂轻轻震荡混匀。
7.2配液：
将试剂盒中浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释。
7.3编号：
将样品对应微孔板编号，每板设阴性对照3孔,阳性对照2孔和空白对照1孔.
7。
4加稀释液：
每孔加稀释液50µL，空白孔除外。
7.5加样：
分别在相应孔加入待测样品或阴阳性对照各50µL，空白孔除外.
7.6温育：
用封板膜封板后,置37℃温育60分钟.
7.7每孔加酶标试剂50µL，空白孔除外，轻轻震荡混匀。
7。
8温育:
用封板膜封板后，置37℃温育30分钟.
7.9洗板：
小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
7。
10显色：
每孔加入显色剂A、B液各50µL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
7.11测定：
每孔加终止液50µL，10分钟内测定结果。
设定酶标仪波长于450nm处（建议使用双波长450nm/600—650nm检测），用空白孔调零后测定各孔A值。
8结果判定
8.1临界值计算：
临界值=0。
10+阴性对照孔A值均值（阴性对照孔A值低于0。
05者以0.05计算）。
8.2阴性对照的正常值范围：
阴性对照孔A≤0。
1（若1孔A大于0。
1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照大于0.1,应重复实验）.
8.3阳性对照正常值范围：
A≥0。
8。
8.4阳性判定：
样品A值≥临界值者为登革病毒抗原阳性。
8.5阴性判定:
样品A值＜临界值者为登革病毒抗原阴性。
9意义
结合临床信息，阳性结果可以诊断为登革病毒感染，但阴性结果并不排除登革病毒感染的可能。
附件3
胶体金免疫层析法检测登革病毒NS1抗原标准操作程序
1目的
检测患者血液中登革病毒抗原。
2适用范围
检测患者血清、血浆、全血中登革热病毒抗原水平，主要用于登革病毒感染的辅助诊断。
3实验前准备
3。
1核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2检测前应将待测样品置于2—8℃冰箱或冰上。
4检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中登革热病毒抗原。
5检测仪器设备和材料
加样器、登革热病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）
6检测的环境条件
生物安全二级实验室（BSL—2）中进行，灭活后样本在生物安全一级实验室（BSL—1）内进行。
7检测步骤
7。
1将试剂盒和待检样本自冰箱中取出平衡至室温.
7.2当准备好测试时,打开密封的铝箔袋，取出检测卡，平放于水平桌面上。
7.3在检测卡上标记病人的样本号。
7。
4加样:
用滴管从样本中取1滴（约30-45µL）血清或血浆标本，加于检测卡/条上的加样区内，另外加1滴（约30-45µL）稀释液，保证操作过程中没有气泡产生。
（如果加样后30秒钟，没有看到样本移动，可能是由于样本太黏稠，可在样本加样孔内再加1滴样本稀释液。
7。
5加入样本后20-25分钟内判读结果,并将结果拍照。
8结果解释
8.1阴性结果：
仅质控线C出现肉眼可见条带。
8。
2阳性结果：
质控线C和检测线T均出现肉眼可见条带。
8。
3无效结果：
未肉眼可见的质控线C
8.4质量控制：
如遇下列情况，请按上述操作步骤使用实验室备用的阳性和阴性样本对该批产品进行质量控制：
8。
4。
1新检验员使用本产品。
8。
4。
2使用新批号产品。
8。
4.3试剂卡储存温度在2—30℃以外。
8.4。
4测试区温度在2—30℃以外。
9意义
阳性结果说明检测到登革病毒抗原，结合临床可以诊断为登革病毒感染；阴性结果说明没有检测到登革病毒抗原，但不能排除登革病毒感染。
附件4
RT—PCR法分型检测登革病毒核酸标准操作程序
1目的
登革热患者和/或媒介伊蚊标本中病毒核酸的提取及PCR分型检测。
2适用范围
适用于患者血标本及其传播媒介标本的检测。
3检测的环境条件
在标本中提取登革病毒RNA的实验要求在BSL—2实验室操作，PCR分型检测在专门PCR室或区域操作.
4实验步骤
4。
1实验准备
4。
1.1在标本中提取登革病毒RNA要求在BSL-2实验室，PCR分型在综合实验室独立区域或专门PCR室操作。
4。
1。
2进入实验场所之前，要事先准备好所需试剂,样品。
预约实验场所，并看前一位实验者是否已经清场。
4.2RNA的提取
4。
2。
1使用QIAampViralRNAMini试剂盒提取血清标本中病毒RNA
4。
2.1。
1吸取560μl包含载体RNA的AVL缓冲液至1.5ml的离心管中。
4。
2。
1.2向上述的液体中加入140μl样品，脉冲涡旋式混匀15秒，室温孵育10分钟，简单离心使离心管顶端液体落到底部.
4。
2.1.3在样品中加入560μl96－100％的乙醇，混匀15秒，再简单离心。
4。
2.1.4小心将630μl液体加入未浸湿的QIAamp小柱中,盖好盖,离心8000rpm/min1min，弃去收集管,将柱子置于一新的2ml收集管上。
4.2.1.5打开QIAamp小柱的盖子，重复步骤6，直至样品全部离心.
4.2。
1.6打开盖子，向柱中加入500μlAW1缓冲液,盖好盖，离心8000rpm/min1min，弃去收集管，将柱子置于一新的2ml收集管上。
4。
2.1.7打开盖子,加入500μlAW2缓冲液，盖好盖，离心14，000rpm/min3min。
4.2。
1.将柱子置于一新的2ml收集管上,空离1min。
h.将柱子置于一新的1。
5ml离心管上，加入50μlAVE洗脱缓冲液，室温孵育1min,离心8000rpm/min1min。
4。
2.2RNeasyMiniKit提取媒介组织标本或血液标本病毒RNA
4.2。
2.1从Kit中取出RLT液，根据标本数量分装适量RLT液按照1：
100体积比分别加入β-巯基乙醇，分装至相应的预先标记好的微量离心管中，每管600µL。
4。
2.2。
2将150µl组织研磨混悬液分别加入相应的RLT液管中，充分混匀.
4.2.2.3混匀后依次加入750µl70％的乙醇，充分混匀。
4。
2。
2.4从Kit中取出带收集管的滤柱，打开包装将其做好标记.取步骤2中的混合液750µl加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
4.2.2.5滤柱仍放回收集管上,将步骤2剩余的混合液全部转入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液；
4.2.2。
6于滤柱中加入700µlWashBufferRW1液，12000rpm，离心15s.
4.2.2。
7从QIAGENRNeasyMiniKit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，加入500µlWashBufferRPE液，12000rpm，离心15s。
4。
2.2.8弃收集管中的离心液,再于滤柱中加入500µlWashBufferRPE液，13000～14000rpm，离心2min。
4.2。
2.9将滤柱移到一个无RNA酶的干净的1。
5mLeppendorf管上，向滤柱中加入30~50µl的RNase-freeWater,室温静置1～3min.
4。
2.2。
1012000rpm，离心1min,离心液即为病毒RNA,立即检测或-70℃以下保存。
4。
3常规半套式RT-PCR方法检测登革病毒核酸
4.3.1引物：
引物序列见下表
引物
序列
片段大小
D1
5'-TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG-3’
511
D2
5’-TTGCACCAACAGTCAATGTCTTCAGGTTC-3’
511
TS1
5’—CGTCTCAGTGATCCGGGGG-3'
482（D1+TS1）
TS2
5’-CGCCACAAGGGCCATGAACAG-3’
119（D1+TS2）
TS3
5’—TAACATCATCATGAGACAGAGC—3'
290（D1+TS3）
TS4
5’—CTCTGTTGTCTTAAACAAGAGA—3’
392（D1+TS4）
4。
3。
2PCR扩增
根据实验室内所使用病毒核酸PCR扩增试剂盒特点，正向引物D1和反向引物D2配置第一轮PCR体系，进行第一轮PCR扩增.推荐反应条件为94℃预变性2min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟,反应40循环,最后72℃延伸10分钟。
第二轮分型PCR扩增体系配置采用正向引物D1与反向引物TS1、TS2、TS3和TS4。
推荐反应条件为94℃预变性2min，然后94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟,反应30循环,最后72℃延伸10分钟。
4.3.31。
5％浓度琼脂糖电泳分析，确定病毒型别。
4.3。
4结果判读
4.3.4。
1阳性:
1型：
电泳显示略小于500bp的DNA片段.
2型：
电泳显示略大于100bp的DNA片段。
3型:
电泳显示略小于300bp的DNA片段。
4型：
电泳显示略小于400bp的DNA片段。
4。
3.4。
2阴性：
无特异性核酸片段扩增.
4.3。
5意义
阳性结果可以确诊登革病毒感染,可用于登革热早期诊断。
4。
4实时定量RT-PCR法分型检测登革病毒核酸
4。
4。
1引物与探针
引物/探针
序列
荧光标记
DEN-18973F
CAAAAGGAAGTCGTGCAATA
DEN-19084C
CTGAGTGAATTCTCTCTACTGAACC
DEN—18998probe
CATGTGGTTGGGAGCACGC
FAM/BHQ—1
DEN—21443F
CAGGTTATGGCACTGTCACGAT
DEN-21518C
CCATCTGCAGCAACACCATCTC
DEN-21469probe
CTCTCCGAGAACAGGCCTCGACTTCAA
HEX/BHQ—1
DEN-3740F
GGACTGGACACACGCACTCA
DEN-3813C
CATGTCTCTACCTTCTCGACTTGTCT
DEN-3762probe
ACCTGGATGTCGGCTGAAGGAGCTTG
TesasRed/BHQ-2
DEN-4904F
TTGTCCTAATGATGCTGGTCG
DEN—4992C
TCCACCTGAGACTCCTTCCA
DEN-4960probe
TTCCTACTCCTACGCATCGCATTCCG
Cy5/BHQ-3
4.4。
2实时荧光定量RT—PCR扩增
实时荧光定量RT-PCR扩增反应配置体系,参考如下：
RNA模板5µl，酶0.5µl，缓冲液12。
5µl，引物各0。
5µl（共4对,8条），探针各0。
25µl，加水至总体积25µl。
推荐反应条件为50℃30min,95℃2min，95℃15s、60℃30s反应40个循环。
4.4.3结果判断
以荧光PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为本底信号,以本底信号标准差的10倍作为荧光阈值，标本扩增产生的荧光信号达到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct值），以Ct<35荧光信号数据线性化处理后对应循环数生成的曲线图成“S"形的标本，可判断为相应的登革病毒核酸检测阳性。
4。
4.4意义
是一种灵敏、特异、低污染的登革病毒RNA检测方法，可以定性或定量检测登革热患者血清或蚊媒标本中的登革病毒。
附件5
细胞培养分离登革病毒
1目的
分离登革病毒。
2适用范围
2。
1无菌采集发病后5日内的登革患者血标本。
2。
2经研磨处理的媒介蚊标本（参见附件11）。
4实验前准备
4。
1核对被检样品：
患者标本应核对患者的姓名、性别、年龄、编号及检测项目等。
蚊媒标本应核对标本种类、编号、性状等.
4。
2生长状态良好的单层登革病毒敏感细胞C6/36,BHK21，VERO等
4。
3待测样品在检测前应放置于2-8℃冰箱或置于冰上.
5、操作步骤
5.1取10µL患者血清或蚊悬液20µL用Hank's液稀按1：
10稀释至0。
1mL或0。
2mL备用。
5.2将在24孔细胞培养板上培养好的单层细胞上清弃掉,用Hank’s液洗涤2遍。
5。
3将稀释好的标本接种细胞，接种C6/36细胞在28℃吸附1小时，BHK21细胞在37℃吸附1小时，补加维持液至1mL，C6/36细胞在28℃培养，BHK21细胞在37℃培养。
5.4第二天开始观察细胞病变情况。
如果没有细胞病变，则盲传3代（每次取细胞悬液0。
1ml）接种细胞传代。
5。
4免疫荧光法鉴定登革病毒
5。
4.1细胞抗原片的制备：
出现“++”细胞病变的细胞倒去维持液（若盲传无细胞病变出现，仍然按此方法制备），用pH7。
2PBS洗涤2次，加PBS用滴管把细胞从管壁上吹下，吹散，1000转/分钟离心5分钟，弃去PBS，细胞沉淀用0.2mlPBS吹散，滴加在抗原片上,吹干,冷丙酮固定10分钟,PBS冲洗2次，蒸馏水漂洗1次,吹干备用；
5.4.2按顺序滴加荧光标记单克隆抗体2孔，对照2孔（加PBS），置湿盒内37℃水浴30分钟；
5。
4。
3取出，用PBS冲洗3次，蒸馏水漂洗1次,吹干;
5。
4。
4荧光显微镜观察结果。
5。
5其他检测病毒抗原或核酸鉴定登革病毒参见附件2、4、5。
5。
6结果判断：
免疫检测有特异性黄绿色颗粒状荧光，检测出病毒NS1抗原或病毒核酸可确定病毒分离成功。
5.7意义：
从病人血清或蚊媒中分离出登革病毒，可确诊登革感染。
6废弃物处理
所有实验用品都应严格按照有关传染病处理方法高压处理。
附件6
IgM捕捉ELISA法（MacELISA）检测登革热IgM抗体
1目的
检测出登革病毒特异性IgM抗体。
2适用范围
适用于人血清或血浆中登革病毒特异性IgM抗体的快速检测。
3样品接收和准备
3。
1核对被检样品（血清或血浆）患者的姓名、编号及检测项目等。
3.2待测样品在检测前应放置于2-8℃冰箱或置于冰上。
4检测项目及参数
本方法检测项目为检测血清或血浆中病毒特异性IgM抗体
5检测仪器设备和材料
加样器、温箱、洗板机、含波长450nm的酶标仪、登革病毒IgM抗体检测试剂盒，或实验室自备材料：
5.1抗原：
阳性抗原:
采用
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