胶体金显微镜单个核细胞.docx

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胶体金显微镜单个核细胞

胶体金-概述

胶体金（colloidalgold），又称金溶胶（goldsolution），是指分散相粒子直径在l—150nm之间的金溶胶，属于多相不均匀体系，颜色呈桔红色到紫红色。

胶体金可以作为标记物用于免疫组织化学，近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术。

胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视。

胶体金-结构

胶体金（colloidalgold）也称金溶胶（goldsolution），是由金盐被还原成原金后形成的金颗粒悬液。

胶体金颗粒由一个基础金核（原子金Au）及包围在外的双离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子（AuC12－），外层离子层H+则分散在胶体间溶液中，以维持胶体金游离于溶胶间的悬液状态。

胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。

在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。

胶体金-特征性质

胶体金因而具有胶体的多种特性，特别是对电解质的敏感性。

电解质能破坏胶体金颗粒的外周永水化层，从而打破胶体的稳定状态，使分散的单一金颗粒凝聚成大颗粒，而从液体中沉淀下来。

某些蛋白质等大分子物质有保护胶胶体金、加强其稳定性的作用。

呈色性微小颗粒胶体呈红色，但不同大小的胶体呈色有一定的差别。

最小的胶体金（2～5nm）是橙色的，中等大小的胶体金（10～20nm）是酒红色的，较大颗粒的胶体金（30～80nm）则是紫红色的。

根据这一特点，用肉眼观察胶体金的颜色可粗略估计金颗粒的大小。

光吸收性胶体金在可见光范围内有一单一光吸收峰，这个光吸收峰的波长（λmax）在510～550nm范围内，随胶体金颗粒大小而变化，大颗粒胶体金的λmax偏向长波长，反之，小颗粒胶体金的λmax则偏于短波长。

胶体金-鉴定和保存

胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。

因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

在日光下仔细观察比较胶体金的颜色，可以粗略估计制得的金颗粒的大小。

当然也可用分光光度计扫描λmax来估计金颗粒的粒径。

制备的胶体金最好作电镜观察，并选一些代表性的作显微摄影，可以比较精确地测定胶体金的平均粒径；良好的胶体金应该是清亮透明的，若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物，提示此次制备的胶体金有较多的凝集颗粒。

胶体金在洁净的玻璃器皿中可较长时间保存，加入少许防腐剂（如0.02％NaN3）可有利于保存。

保存不当时会有细菌生长或有凝集颗粒形成。

少量凝集颗粒并不影响以后胶体金的标记，使用时为提高标记效率可先低速离心去除凝集颗粒。

胶体金-发展简史

胶体金标记技术

胶体金作为标记物用于免疫组织化学始于1971年,Faulk等应用电镜免疫胶体金染色法（IGS）观察沙门氏菌,此后他们把胶体金与多种蛋白质结合.1974年Romano等将胶体金标记在第二抗体（马抗人IgG）上，建立了间接免疫胶体金染色法。

1978年geoghega发现了胶体金标记物在光镜水平的应用。

胶体金在免疫化学中的这种应用，又被称为免疫金．之后，许多学者进一步证实胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变．它可以作为探针进行细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位,也可以用于日常的免疫诊断，进行免疫组织化学定位，因而在临床诊断及药物检测等方面的应用已受到广泛的重视．目前电镜水平的免疫金染色（IGS），光镜水平的免疫金银染色（IGSS），以及肉眼水平的斑点免疫金染色技术日益成为科学研究和临床诊断的有力工具．胶体性质胶体金颗粒大小多在1～100nm，微小金颗粒稳定地、均匀地、呈单一分散状态悬浮在液体中，成为胶体金溶液。

近10多年来胶体金标记已经发展为一项重要的免疫标记技术．胶体金免疫分析在药物检测、生物医学等许多领域的研究已经得到发展，并越来越受到相关研究领域的重视。

胶体金-制备方法

氯金酸（HauC14）是主要还原材料，通过各种方法进行还原制备金溶胶，常用还原剂有柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。

根据还原剂类型以及还原作用的强弱，可以制备0.8nm～150nm不等的胶体金。

常见的制备方法有一下几种：

1、紫外光引发还原可制备金溶胶——其还原过程经历了自由基机理。

用紫外可见光谱观察了不同反应时间溶胶状态的变化。

结果表明，光照反应2h时明显出现金溶胶粒子，7h后氯金酸基本转化完毕。

同时,研究了稳定剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的加入对还原过程的影响,结果表明,PVP的加入不仅稳定了溶胶,而且降低了反应速率.用SEM观察了溶胶粒子聚集体的形貌.最后以1,4-bis（4-vinylpyridyl）phenylene为探针分子研究了这种溶胶的SERS活性.

2、纳米金溶胶制备——以水为分散介质,PVP为分散剂,抗坏血酸作还原剂,用较高浓度的氯金酸溶液,在弱酸性条件下,通过化学还原法制得球状、最大粒径为20nm的金溶胶结果表明,还原剂用量为抗坏血酸/Au（摩尔比）=3,PVP的用量取PVP/HAuCl4（质量比）=1,还原体系自身pH值3～5,常温293K为金溶胶制备的最佳条件.在此条件下制得的金粉粒度小,分散性好,且十分稳定,无反溶现象.

3、磷钼酸作为光催化还原剂制备纳米金溶胶——由于DMF与磷钼杂多阴离子间的电荷转移作用,导致钼系杂多酸可成为制备纳米金溶胶的光催化还原剂.实验结果表明,紫外光照作用及光照时间、DMF用量等是影响纳米金的形成和形貌的主要因素,选择适宜的合成条件可以得到粒径均匀、分散性好的纳米金溶胶.

4、超短脉冲激光诱导制备金溶胶的方法——其制法为以氯金酸浓度在0～5mmol/L范围内的水溶液作为反应溶液，调节可见/近红外超短脉冲激光光束并聚焦，利用焦点附近的光束辐照氯金酸水溶液来制备金溶胶。

本发明的制备方法工艺和装置简单，无需还原剂的引入，制备的金溶胶浓度高，稳定性好，杂质含量非常低，可用作高级非线性光学薄膜的前驱体，催化材料，也可用作食品、饮料及化妆品的添加剂。

6、一种采用激光轰击固液界面连续制备纯净金溶胶——本发明系采用聚焦脉冲激光束在适当气体保护下轰击浸于连续流动液相中的，不断相对移位的金靶表面，在固液界面产生高温高压微区而生成纯净的金溶胶流出反应器。

本发明方法可连续制备纯净的金溶胶，不含过量还原剂及其反应副产物、保护剂、分散剂等有害杂质，无须提纯，作为添加剂可直接应用于微电子器件、超大规模集成芯片、医学、免疫标记以及食品、饮料、饮用水、酒类、化妆品等行业。

胶体金-应用

１、胶体金在电镜水平的应用 

胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。

其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。

直径为3～15nm 胶体金均可用作电镜水平的标记物。

3～15nm 的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm 多用于检测量较多的感染细胞。

胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：

①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。

②单层培养中细胞内抗原的检测。

③组织抗原的检测。

金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：

包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。

实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。

２、胶体金在光镜水平的应用 

胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。

各种细胞涂片、切片均可应用。

主要用于：

①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。

②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。

胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。

３、胶体金在流式细胞仪中的应用：

应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。

但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。

这样可以同时进行几种标记。

该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。

４、凝集试验：

单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。

５、免疫印迹技术（immunoblotting）：

免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、ＲＩＡ）进行定量。

免疫胶体金也可用于该法的定量。

转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。

利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至 0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。

由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。

６、胶体金在肉眼水平的应用 

胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。

除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：

①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul；②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用； ③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；④实验结果可以长期保存；⑤时间大大缩短，提高了检测速度。

金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。

因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。

实验结果表明，胶体金的敏感性可达到 ELISA的水平。

而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。

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胶体金-注意事项

1、氯金酸易潮解，应干燥、避光保存。

2、氯金酸对金属有强烈的腐蚀性，因此在配制氯金酸水溶液时，不应使用金属药匙称量氯金酸。

3、用于制备胶体金的蒸馏水应是双蒸馏水或三蒸馏水，或者是高质量的去离子水。

4、是以制备胶体金的玻璃容器必须是绝对清洁的，用前应先经酸洗并用蒸馏水冲净。

最好是经硅化处理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡数分钟，用蒸馏水冲净后干燥备用。

5、胶体金的鉴定和保存：

胶体金的制备并不难，但要制好高质量的胶体金却也并非易事。

因此对每次制好的胶体金应加以检定，主要检查指标有颗粒大小，粒径的均一程度及有无凝集颗粒等。

胶体金-影响因素

影响胶体金溶液稳定性的主要原因是：

1、胶粒间的相互吸引力。

当胶粒相距很近时，这种吸引力可能导致胶粒合并变大。

2、水化层的带电情况。

一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷。

同性电荷相斥，双电层愈厚，胶粒带电量愈大，排斥力愈大，愈能阻止胶粒合并聚结，溶胶愈稳定。

3、胶体界面的溶剂膜，当二固体间夹有一厚层液体时，这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力。

两个胶粒要进一步接近，只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能，因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一。

胶体金-应用

１、胶体金在电镜水平的应用。

胶体金应用电镜水平的研究最早，发展最快，应用最广泛。

其最大优点是可以通过应用不同大小的颗粒或结合酶标进行双重或多重标记。

直径为3～15nm胶体金均可用作电镜水平的标记物。

3～15nm的胶体金多用于单一抗原颗粒的检测，而直径15nm多用于检测量较多的感染细胞。

胶体金用于电镜水平的研究，主要包括：

①细胞悬液或单层培养中细胞表面抗原的观察。

②单层培养中细胞内抗原的检测。

③组织抗原的检测。

金标记在电镜水平的应用，主要方法包括：

包埋前染色、包埋后染色、免疫负染色、双标记技术和原位杂交技术等。

实验证明，该法样本用量少、检测速度快、对比明显、操作简单、敏感性和特异性高，既可用于抗原检测，也可用于抗体检测，因此，可同时适用于科研和诊断。

２、胶体金在光镜水平的应用。

胶体金同样可用做光镜水平的标记物，取代传统的荧光素、酶等。

各种细胞涂片、切片均可应用。

主要用于：

①用单克窿抗体或抗血清检测细胞悬液或培养的单层细胞的膜表面抗原。

②检测培养的单层细胞胞内抗原，③组织中或亚薄切片中抗原的检测。

胶体金用于光镜水平的研究，可以弥补其它标记物不可避免的本底过高和内部酶活性干扰等缺点。

胶体金标记

３、胶体金在流式细胞仪中的应用。

应用荧光素标记的抗体，通过流式细胞仪计数分析细胞表面抗原，是免疫学研究中的重要技术之一。

但由于不同荧光素的光谱相互重叠，区分不同的标记困难，因此必须寻找一种非荧光素标记物，用于流式细胞计数。

这样可以同时进行几种标记。

该标记物必须能够改变散射角，胶体金可以明显地改变红激光散射角，因而可以作为流式细胞仪的标记物之一。

４、凝集试验：

单分散的免疫金溶胶呈清澈透明的溶液，其颜色随溶胶颗粒大小而变化，当与相应抗原或抗体发生专一性反应后出现凝聚，溶胶颗粒极度增大，光散射随之发生变化，颗粒也会沉降，溶液的颜色变淡甚至变成无色，这一原理可定性或定量地应用于免疫反应。

５、免疫印迹技术（immunoblotting）：

免疫印迹是一种较新的免疫化学技术。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，得到的区带转移至硝酸纤维素膜，然后用酶免疫法（或免疫荧光、ＲＩＡ）进行定量。

免疫胶体金也可用于该法的定量。

转移后的硝酸纤维素膜与某特异性的抗体保温后，再与经葡萄球菌Ａ蛋白致敏的胶体金温育，彻底洗去多余的胶体金，根据膜上胶体金颗粒颜色深浅可测知样品中的特异性抗原。

利用金颗粒可催化银离子还原成金属银这一原理，采用银显影剂增强金颗粒的可见性，更可大大提高测定灵敏度，检测下限可低至0.1ng，这种免疫金银染色法应用已日趋广泛。

由于胶体金免疫印迹技术简便、快速，且有相当的高的灵敏度，在临床免疫诊断上有很大的应用潜力。

６、胶体金在肉眼水平的应用。

胶体金取代传统三大标记物，用于肉眼水平的免疫检测中。

除了胶体金本身具有的特点外，还有以下优点：

①试剂和样本用量极小，样本量可低至1～2ul；②不需γ－计数器、荧光显微镜、酶标检测仪等贵重仪器，更适于现场应用；③没有诸如放射性同位素、邻苯二胺等有害物质参与；④实验结果可以长期保存；⑤时间大大缩短，提高了检测速度。

金标过程中，无共价键形成，是一定离子浓度下的物理吸附。

因此几乎所有的大分子物质都可被金标记，标记后大分子物质活性不发生改变。

实验结果表明，胶体金的敏感性可达到ELISA的水平。

而结合银染色时，检测的敏感性更大大提高。

显微镜的种类及其使用方法

一、光学显微镜

光学显微镜是一种精密的光学仪器。

当前使用的显微镜由一套透镜配合，因而可选择不同的放大倍数对物体的细微结构进行放大观察。

普通光学显微镜通常能将物体放大1500～2000倍（最大的分辨力为0.2μm）。

（一）光学显微镜的基本结构（附图-1）

1．光学部分包括目镜、物镜、聚光器和光源等。

（1）目镜通常由两组透镜组成，上端的一组又称为“接目镜”，下端的则称为“场镜”。

两者之间或在场镜的下方装有视场光阑（金属环状装置），经物镜放大后的中间像就落在视场光阑平面上，所以其上可加置目镜测微尺。

在目镜上方刻有放大倍数，如10×、20×等。

按照视场的大小，目镜可分为普通目镜和广角目镜。

有些显微镜的目镜上还附有视度调节机构，操作者可以对左右眼分别进行视度调整。

另有照相目镜（NFK）可用于拍摄。

（2）物镜由数组透镜组成，安装于转换器上，又称接物镜。

通常每台显微镜配备一套不同倍数的物镜，包括：

①低倍物镜：

指1×～6×；②中倍物镜：

指6×～25×；③高倍物镜：

指25×～63×；④油浸物镜：

指90×～100×。

其中油浸物镜使用时需在物镜的下表面和盖玻片的上表面之间填充折射率为1.5左右的液体（如香柏油等），它能显著地提高显微观察的分辨率。

其他物镜则直接使用。

观察过程中物镜的选择一般遵循由低到高的顺序，因为低倍镜的视野大，便于查找待检的具体部位。

显微镜的放大倍数，可粗略视为目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积。

（3）聚光器由聚光透镜和虹彩光圈组成，位于在载物台下方。

聚光透镜的功能是将光线聚焦于视场范围内；透镜组下方的虹彩光圈可开大缩小，以控制聚光器的通光范围，调节光的强度，影响成像的分辨力和反差。

使用时应根据观察目的，配合光源强度加以调节，得到最佳成像效果。

（4）光源较早的普通光学显微镜借助镜座上的反光镜，将自然光或灯光反射到聚光器透镜的中央作为镜检光源。

反光镜是由一平面和另一凹面的镜子组成。

不用聚光器或光线较强时用凹面镜，凹面镜能起会聚光线的作用；用聚光器或光较弱时，一般都用平面镜。

新近出产的显微镜一般直接在镜座上安装光源，并有电流调节螺旋，用于调节光照强度。

光源类型有卤素灯、钨丝灯、汞灯、荧光灯、金属卤化物灯等。

显微镜的光源照明方法分为两种：

透射型与反射（落射）型。

前者是指光源由下而上通过透明的镜检对象；反射型显微镜则是以物镜上方打光到（落射照明）不透明的物体上。

2.机械部分包括镜座、镜柱、镜壁、镜筒、物镜转换器、载物台和准焦螺旋等。

（1）镜座基座部分，用于支持整台显微镜的平稳。

（2）镜柱镜座与镜臂之间的直立短柱，起连接和支持的作用。

（3）镜臂显微镜后方的弓形部分，是移动显微镜时握持的部位。

有的显微镜在镜臂与镜柱之间有一活动的倾斜关节，可调节镜筒向后倾斜的角度，便于观察。

（4）镜筒安装在镜臂先端的圆筒状结构，上连目镜，下连接物镜转换器。

显微镜的国际标准筒长为160mm，此数字标在物镜的外壳上。

（5）物镜转换器镜筒下端的可自由旋转的圆盘，用于安装物镜。

观察时通过转动转换器来调换不同倍数的物镜。

（6）载物台镜筒下方的平台，中央有一圆形的通光孔。

用于放置载玻片。

载物台上装有固定标本的弹簧夹，一侧有推进器，可移动标本的位置。

有些推动器上还附有刻度，可直接计算标本移动的距离以及确定标本的位置。

（7）准焦螺旋装在镜臂或镜柱上的大小两种螺旋，转动时可使镜筒或载物台上下移动，从而调节成像系统的焦距。

大的称为粗准焦螺旋，每转动一圈，镜筒升降10mm；小的为细准焦螺旋，转动一圈可使镜筒仅升降0.1mm。

一般在低倍镜下观察物体时，以粗准焦螺旋迅速调节物像，使之位于视野中。

在此基础上，或在使用高倍镜时，用细准焦螺旋微调。

必须注意，一般显微镜装有左右两套准焦螺旋，作用相同，但切勿两手同时转动两侧的螺旋，防止因双手力量不均产生扭力，导致螺旋滑丝。

（二）普通光学显微镜的基本成像原理

光线→（反光镜）→遮光器→通光孔→镜检样品（透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再次放大成虚像）→眼。

（三）普通光学显微镜的使用过程

1．镜检前的准备室内应清洁而干燥，实验台台面水平，稳固无震动，显微镜附近不应放置腐蚀性的试剂。

从显微镜柜或镜箱内取出显微镜时，要用右手紧握镜臂，左手托住镜座，平稳地取出，放置在实验台桌面上，置于操作者左前方，距实验台边缘约10cm，镜臂朝自己，镜筒朝前。

实验台右侧放绘图用具。

2．调节光源如需利用外置光源，宜采用散射的自然光或柔和的灯光。

直射的太阳光会对观察者的眼睛造成伤害。

转动转换器，使低倍镜正对通光孔，将聚光器上的虹彩光圈开到最大，观察目镜中视野亮度，同时调节反光镜角度，使光照达到最明亮最均匀。

自带光源的显微镜，可通过调节电流旋钮来调节光照的强弱。

3．装置待检玻片将待观察的样品制作成临时或永久装片，放在载物台上，用弹簧夹固定，有盖玻片的一面朝上。

移动推进器，调节待检样品至通光孔的中心。

4．低倍镜观察将低倍镜对准通光孔，缓缓转动粗准焦螺旋，将物镜与装片的距离调至最近。

注意不要压碎盖玻片。

通过目镜观察，同时用粗准焦螺旋缓慢调节，直至物像出现，再用细准焦螺旋微调，同时调节光源亮度与虹彩光圈的大小，使物像达到最清晰的程度。

并利用推进器把需要进一步放大观察的部分移至视野中央。

如果使用双筒目镜，应在观察前先调整双筒距离，使两眼视场合并。

5．高倍镜观察转动转换器，选择较高倍数的物镜，用细准焦螺旋调节焦距，到物像清晰为止。

6．油镜观察油浸物镜的工作距离（指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离）很短，一般在0.2mm以内，且一般光学显微镜的油浸物镜没有“弹簧装置”，因此使用油浸物镜时，调焦速度必须放慢，避免压碎玻片，并使物镜受损。

（1）在低倍镜下找到观察目标，中、高倍镜下逐步放大，将待观察部位置于视野中央，调节光源和虹彩光圈，使通过聚光器的光亮达到最大。

（2）转动粗准焦螺旋，将镜筒上旋（或将载物台下降）约2cm，加一小滴香柏油于玻片的镜检部位上。

（3）将粗准焦螺旋缓缓转回，同时注意从侧面观察，直至油镜浸入油滴，镜头几乎与标本接触。

（4）从目镜中观察，用细准焦螺旋微调，直至物象清晰。

（5）镜检结束后，将镜头旋离玻片，立即清洁镜头。

一般先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油滴。

再用擦镜纸蘸少许乙醚-酒精混合液（2：

3），擦去残留油迹，最后再用干净的擦镜纸擦净（注意向一个方向擦拭）。

7．还原显微镜关闭内置光源并拔下电源插头，或使反光镜与聚光器垂直。

旋转物镜转换器，使物镜头呈八字形位置与通光孔相对。

再将镜筒与载物台距离调至最近，降下聚光器。

罩上防尘罩，将显微镜放回柜内或镜箱中。

二、几种特殊的光学显微镜

（一）暗视野显微镜

暗视野显微镜不具备观察物体内部的细微结构的功能，但可以分辨0.004μm以上的微粒的存在和运动。

因而常用于观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

暗视野显微镜的基本原理是丁达尔效应。

当一束光线透过黑暗的房间，从垂直于入射光的方向可以观察到空气里出现的一条光亮的灰尘“通路”，这种现象即丁达尔效应。

暗视野显微镜在普通的光学显微镜上换装暗视野聚光镜后，由于该聚光器内部抛物面结构的遮挡，照射在待检物体表面的光线不能直接进入物镜和目镜，仅散射光能通过，因而视野是黑暗的。

操作者通过目镜观察到的，是检物体的衍射光图像（附图1-2）。

暗视野显微镜的基本使用方法如下：

1．安装暗视野聚光器（或用厚实的黑纸片制成遮光板，放在普通显微镜的聚光器下方，也能得到暗视野效果）。

2．选用强光源，一般用显微镜灯照明，以防止直射光线进入物镜。

3．在聚光器和玻片之间加一滴香柏油，避免照明光线于聚光镜上进行全反射，达不到被检物体，而得不到暗视野照明。

4．进行中心调节，即水平移动聚光器，使聚光器的光轴与显微镜的光轴严格位于一直线上。

升降聚光器，将聚光镜的焦点（图2中圆锥光束的顶点）对准待检物。

5．选用与聚光器相应的物镜，调节焦距，按普通显微镜的方法操作。

（二）体视显微镜

体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间发 1 城cheng（神辫）发表于2008-2-1410:

07:

42 

（二）体视显微镜

体视显微镜又称实体显微镜或解剖镜，其成像为正立三维的空间影像，并具有立体感强、成像清晰宽阔、长工作距离（通常为110mm）以及连续放大观看等特点。

生物学上常用于解剖过程中的实时观察（附图1-3）。

普通光学显微镜的光源为平行光，因而形成的是二维平面影像；而体视显微镜采用双通道光路，双目镜筒中的左右两光束具有一定的夹角--体视角（一般为12º-15º），因而能形成三维空间的立体图像。

体视显微镜与普通光学显微镜的使用方法相近，但更为便捷。

二者的主