大豆异黄酮对缺血性脑梗塞大鼠氧化损伤保护作用的研究.docx
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大豆异黄酮对缺血性脑梗塞大鼠氧化损伤保护作用的研究
大豆异黄酮对缺血性脑梗塞大鼠氧化损伤保护作用的研究
时间:
2014-10-28
大豆异黄酮对缺血性脑梗塞大鼠氧化损伤保护作用的研究
【摘要】目的：
观察大豆异黄酮（soybean isoflavone，SI）对缺血性脑梗塞大鼠的神经保护作用，并探讨其机制。
方法：
SD大鼠60只，雌雄各半。
随机分成6组，即模型组，假手术组，VE对照组，SI高、中、低剂量组（50、20、10mg/kg体重）。
灌胃前内眦取血，灌胃给药4周后采用线栓法制备大脑中动脉栓塞模型，造模成功后24小时股动脉放血处死。
取动脉血，测血清中，超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH—PX）活力，丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）含量。
结果：
与模型组相比中、高SI剂量组GSH- PX活性、NO含量较高，LDH活性、MDA含量较低，低、中、高SI剂量组SOD活力较高。
结论：
大豆异黄酮可使缺血性脑梗塞大鼠抗氧化能力有一定提高。
【关键词】大豆异黄酮；脑梗塞；NO
Effects of soybean isoflavones on antioxidant system in rat
with focal cerebral ischemia injury
【ABSTRACT】Objective:
To investigate the protective effects and mechanisms of soybean isoflavone （SI） on antioxidant capacity in rat with cerebral ischemia injury. Methods:
60 SD rats assigned randomly into model， sham operation， VE control， high， middle and low SI dosage groups（The dosages were 50、20、10mg/kg，respectively）. 4 weeks later， the rats were made into the model of cerebral ischemia reperfusion by suture method. The content of MDA and NO and activity of SOD， GSH-PX and LDH were measured. Results:
The activity of GSH-PX and LDH and the level of MDA and NO in the middle and high dose groups were statistically significant， respectively. There were no significant differences among the activity of SOD in the， middle and high dose groups. Conclusion:
SI plays some roles in enhancing the function of antioxidant system in the rats with cerebral ischemia injury.
【KEY WORDS】Soybean isoflavones；Cerebral ischemia；NO
近年来心脑血管疾病的发病率日益上升，其中缺血性脑血管病（Ischemic cerebral vascular diseases，ICVD）作为常见病、多发病，愈后差，致死率和致残率高，给家庭和社会造成很大负担，引起人们的广泛关注。
ICVD损伤的机制十分复杂，目前的研究认为引发并加重脑缺血损伤的主要是氧自由基和一氧化氮（NO）[1]，因此有效清除自由基是减轻脑缺血损伤的靶点之一。
大豆异黄酮（soybean isoflavones，SI） 是一种天然的抗氧化剂。
目前已发现的SI有12种，包括染料木素（genistein，金雀异黄素、三羟异黄酮）、大豆黄素（daidzein，二羟异黄酮、黄豆苷原）、黄豆黄素（glicitein）及其相应衍生物[2]。
70年代以后，人们发现SI具有广泛的生物学作用，如抑制肿瘤、降低血脂、软化血管[3]，并对妇女更年期综合征和骨质丢失有一定的预防作用。
研究发现其具有清除自由基和抗氧化作用[4]。
本实验利用线栓法建立大鼠脑缺血模型，研究SI的神经保护作用并对其作用机制加以探讨。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 药品与试剂
大豆提取物（批号：
20040720，SIF含量41.18%）购于天津尖峰天然产物公司。
VE购于Sigma公司。
超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒，丙二醛（MDA）测定试剂盒，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力测试试剂盒，乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒，一氧化氮（NO）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 受试动物
SD成年大鼠60只，雌雄各半，体重（230±30）g，购于北大医学部实验动物中心，许可证号：
SCXK（京）：
2002-0001。
1.2 实验仪器
酶标仪为奥地利TECAN公司产品，离心机、水浴恒温箱为国产仪器。
1.3 实验方法
1.3.1 实验动物处理
SD成年大鼠72只，雌雄各半，随机分成6组，即模型组、假手术组、VE对照组、低剂量SI组、中剂量SI组、高剂量SI组，每组10只。
实验共进行4周，灌胃前内眦取血，3个剂量组分别以不同剂量的SI（10、20、50mg/kg体重）灌胃给药，假手术组和模型对照组灌以等量生理盐水，VE组剂量以20mg/kg体重灌胃给药，4周后停药。
手术造模，造模成功后24小时股动脉放血处死，取动脉血。
1.3.2 建立大鼠脑缺血模型
首先进行栓线处理：
栓线全长80mm，在距一端18mm处做一标记（蓝色）。
大鼠用10％水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3ml/100g体重），仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，剪开浅筋膜，显露左侧胸锁乳突肌。
钝性分离胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌问的肌间隙，暴露左侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）和迷走神经。
钝性分离CCA和迷走神经，注意避免损伤迷走神经。
找到左侧颈外动脉（extemal carotid artery，ECA）和颈内动脉（intemal carotid artery，ICA）分叉，分离ECA、ICA，结扎ECA近分叉端。
在近心端和分叉前分别用动脉夹夹住CCA，在距动脉分叉5mm处用针扎一小口，插入栓线，松开分叉前的微动脉夹，线栓缓慢向ICA入颅方向推进，直到标记至分叉处为止。
将栓线与CCA结扎固定，松开近心端微动脉夹，剪除线栓多余末端，以防止其内的线栓移动和出血，最后缝合皮肤。
假手术组除不插线外，其余步骤同其他各组。
1.3.3 实验指标测定
1.3.3.1 造模成功指标
左侧Horner征；右前肢瘫痪；脑组织，TTC染色：
缺血部位苍白，正常部位红色。
大鼠麻醉清醒后，提尾悬空时右侧前肢内收、屈曲，自主运动时身体向右侧转圈。
神经功能评分（longa评分）：
0级，无神经系统功能缺损症状，活动正常；1级，对侧前肢不能完全伸展；2级，爬行时相对侧转圈；3级，行走时身体向偏瘫侧倾倒；4级，不能自发行走，意识丧失。
1-3级为造模成功。
1.3.3.2 GSH-PX活性测定
采用DTNB直接法，操作步骤按GSH-PX测试盒说明进行。
于波长412nm处测测定管、对照管、空白管、标准管吸光度，，通过公式计算可求出被测样品中的GSH-PX活力。
血清中GSH-PX活性定义为每0.1毫升血清在37℃反应5分钟，扣除非酶促反应作用，是反应体系中GSH浓度降低1μmol/L为一个活力单位。
1.3.3.3 SOD活性测定
采用黄嘌呤氧化酶法，操作步骤按SOD测试盒说明进行。
于波长550nm处测测定管、对照管吸光度，借助反应体系得稀释倍数，通过公式计算可求出被测血清中的SOD活力。
血清血浆中SOD活性定义为每毫升反应中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个活力单位。
1.3.3.4 NO含量测定
采用硝酸还原酶法，操作步骤按NO试剂盒说明进行。
于550nm处测测定管、空白管、标准管吸光度，利用公式计算出NO的含量。
1.3.3.5 LDH活性的测定
采用常规酶方法，操作步骤按试剂盒说明进行。
于波长440nm处测测定管、测定空白管、标准管、标准空白管吸光度，通过公式计算可求出被测血清血浆中的LDH活力。
血清中LDH活性定义为1000ml血清37℃与基质作用15分钟，在反应体系中产生1μmol丙酮酸为1单位。
1.3.3.6 MDA含量测定
采用硫代巴比妥酸（TBA）法，操作步骤按MDA测定试剂盒说明进行，于532nm处测测定管、对照管、空白管、标准管吸光度，通过公式计算可求出被测定血清内MDA含量。
1.4 统计学处理
各项指标均以
±s表示，实验数据采用SPSS11.5统计软件进行分析。
多组间比较用单因素方差分析（F检验），若组间差别有统计学意义，采用SNK-q检验进行两两比较，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 造模结果
假手术组无症状，其余各组大鼠出现左侧Horner征；右侧前肢瘫痪：
右侧前肢不能前伸，爬行时向右倾倒或向右转圈；TTC染色：
缺血部位苍白，正常部位红色（如图1），表明造模成功。
图1：
TTC染色结果，白色为 梗死部位
2.2 抗氧化指标测定结果
2.2.1 大鼠血清中抗氧化指标
表1 大鼠血清中GSH-PX、SOD、LDH活性
组别
n
GSH-PX
（U/ml）
SOD
（U/ml）
LDH
（U/L）
低剂量组
10
373.00±12.83
400.62±35.08
6174.90±617.94
中剂量组
10
372.00±10.45
388.15±56.49
5987.04±607.33
高剂量组
10
376.20±8.02
373.05±43.03
5763.56±745.78
VE对照组
10
368.40±8.73
401.63±58.99
5922.26±913.80
假手术组
10
381.20±8.55
396.19±36.83
5904.45±590.26
模型组
10
369.40±7.43
401.22±61.62
4833.20±977.66
经方差分析，灌胃前六组血中GSH-PX、SOD、LDH活性之间差异无统计学差异（F=8.454，F=0.507，F=0.352，P>0.05）（见表1）。
表2 大鼠血清中NO、MDA含量
组别
n
NO
（μmol/l）
MDA
（nmol/ml）
低剂量组
10
3.17±0.53
10.84±2.95
中剂量组
10
3.07±0.82
10.33±2.86
高剂量组
10
3.33±1.09
8.76±2.66
VE对照组
10
2.61±1.00
9.89±2.48
假手术组
10
3.33±0.96
11.08±0.99
模型组
10
2.99±0.55
11.0±2.48
经方差分析，灌胃前六组血中NO、MDA含量之间差异无统计学差异（F=0.991，F=1.296，P>0.05）（见表2）。
2.2.2 SI对大鼠血清中GSH-PX活性的影响
表3 SI对大鼠血清中GSH-PX活性的影响（
±s，U/ml）
组别
n
造模后
低剂量组
8
363.37±40.93bc
中剂量组
9
372.71±54.50abc
高剂量组
9
420.36±44.64a
VE对照组
5
433.17±45.33a
假手术组
9
349.19±46.65c
模型组
8
324.06±41.44
a P<0.05，与模型组比较 b P<0.05，与高剂量组比较；c P<0.05，与VE对照组比较
图2 SI对大鼠血清中GSH-PX活性的影响（U/ml）
造模后GSH-PX活性经方差分析各组差异具统计学意义，F=5.965，P=0.000。
与模型组相比SI中、高剂量组、VE对照组GSH-PX活力均升高，差异有统计学意义，P值分别为0.035，0.000，0.000。
SI低、中剂量组与高剂量组间差异具统计学意义，GSH-PX活力高剂量组与中剂量组，高剂量组与低剂量组比较差别分别由统计学意义。
SI低、中剂量组、假手术组、模型组与VE组比较均有差异，且差异具统计学意义，而高浓度组与VE组比较差异无统计学意义。
（见表3，见图2）
2.2.3 SI对大鼠血中SOD活性的影响
表4 SI对大鼠血清中SOD活性的影响（
±s，U/ml）
组别
n
造模后
低剂量组
8
319.77±55.96abcd
中剂量组
9
373.48±43.19abd
高剂量组
9
422.17±38.80a
VE对照组
5
431.42±42.16a
假手术组
9
270.78±55.75ad
模型组
8
219.65±31.53
a P<0.05，与模型组比较；b P<0.05，与高剂量组比较；c P<0.05，与中剂量组比较；d P<0.05，与VE对照组比较；
图3 SI对大鼠血清中SOD活性的影响（U/ml）
造模后SOD活性经方差分析各组差异具统计学意义，F=26.170，P=0.000。
与模型组相比SIF低、中、高剂量组、VE组、假手术组SOD活力均升高，差异有统计学意义，P值分别为0.000，0.000，0.000，0.000，0.026。
SI低、中、高剂量组间差异具统计学意义。
SIF低、中剂量组、假手术组、模型组与VE组比较均有差异，且差异具统计学意义，而高浓度组与VE组比较差异无统计学意义（见表4，见图3）。
2.2.4 SI对大鼠血中NO含量的影响
表5 SI对造模后大鼠血清中NO含量的影响（
±s，μmol/L）
组别
n
造模后
低剂量组
8
6.74±1.70abc
中剂量组
9
10.75±2.93abc
高剂量组
9
19.54±5.76a
VE对照组
5
18.10±4.72a
假手术组
9
25.33±5.92
模型组
8
5.65±1.84ac
a P<0.05，与模型组比较；b P<0.05，与高剂量组比较；c P<0.01，与VE对照组比
图4 造模后大鼠血清中NO含量（μmol/L）
经方差分析各组差异具统计学意义，F=30.197，P=0.000。
与模型组相比SI低、中、高剂量组、VE对照组、假手术组NO含量均降低，差异有统计学意义，P值分别为0.000，0.000，0.003，0.014，0.000。
SI低、中剂量组与高剂量组间差别具统计学意义。
SI低、中剂量组、假手术组、模型组与VE组比较均有差异，且差异具有统计学意义，而高剂量组与VE组比较差异无统计学意义（见表5，见图4）。
2.2.5 SI对大鼠血清LDH活性的影响
表6造模后大鼠血清中LDH活性（
±s，U/L）
组别
n
造模后
低剂量组
8
7905.70±633.79bc
中剂量组
9
7247.14±997.46abc
高剂量组
9
6108.15±1204.85a
VE对照组
5
5988.79±1456.30ac
假手术组
9
7438.38±740.21c
模型组
8
8345.72±810.94
a P<0.01，与模型组比较；b P<0.01，与高剂量组比较；c P<0.01， 与VE对照组比较
图5 造模后大鼠血清中LDH活性（U/L）
经方差分析各组差异具统计学意义，F=6.963，P=0.000。
与模型组相比SI中、高剂量组、VE对照组LDH活性均降低，差异有统计学意义，P值分别为0.025，0.000，0.000。
SI低、中剂量组与高剂量组间差异具统计学意义。
SI低、中剂量组、假手术组、模型组与VE组比较均有差异，且差异具有统计学意义，而高浓度组与VE组比较差异无统计学意义（见表6，见图5）。
2.2.6 SI对大鼠血清中MDA含量的影响
表7 造模后大鼠血清中MDA含量（
±s ，nmol/ml）
组别
n
造模后
低剂量组
8
28.96±3.67abc
中剂量组
9
22.88±5.46abc
高剂量组
9
16.94±5.48a
VE对照组
5
16.09±5.14a
假手术组
9
34.10±3.39ac
模型组
8
49.55±6.49
a P<0.01，与模型组比较；b P<0.01，与高剂量组比较；c P<0.01， 与VE对照组比较
图6 造模后大鼠血清中MDA含量（nmol/ml）
经方差分析各组差异具统计学意义，F=47.975，P=0.000。
与模型组相比SIF低、中、高剂量组、VE对照组、假手术组MDA含量均降低，差别有统计学意义，P值分别为0.000，0.000，0.000，0.000，0.000。
SI低、中剂量组与高剂量组间差异具统计学意义。
SI低、中剂量组、假手术组、模型组与VE组比较均差别且具统计学意义，而高剂量组与VE组比较差异无统计学意义。
（见表7，见图6）。
2.2.7 SI与各指标双变量相关性分析结果
表8 SI与各指标双变量相关性分析结果
GSH-PX
SOD
NO
LDH
MDA
SI
0.489**
0.657**
0.786**
-0.618**
-0.689**
**P<0.05
经相关分析各剂量组和抗氧化指标之间有相关性（P<0.05）。
3 讨论
3.1 SI与脑缺血损伤
许多研究表明脑缺血损伤与氧自由基的大量产生有密切关系。
活性氧自由基可导致膜脂质、蛋白质、DNA等生物大分子的损伤，引起脑细胞功能破坏。
机体清除自由基、抗氧化的防御系统主要由酶促防御体系（如SOD、GSH-PX等）和非酶促防御体系（如维生素C、维生素E以及食物中其它营养成分等）两部分组成的[5]。
SI具有直接使自由基熄灭的能力，特别是金雀异黄素和大豆素。
金雀异黄素含3个酚羟基，大豆甙元含2个酚羟基。
酚羟基作为供氢体能与自由基反应，使之形成相应的离子或分子，熄灭自由基，终止自由基的链式反应[6]。
SI不仅自身具有一定的抗氧化作用而增强非酶促防御体系，它还可使体内酶促抗氧化防御系统能力提高[7]。
SI可以增强机体重要的抗氧化蛋白如SOD、MT、CAT等的活力，以起到间接清除自由基的作用。
在生物膜的不饱和脂质中，自由基的过氧化作用可破坏生物膜的结构，影响膜的生理功能。
异黄酮类物质可通过降低膜的流动性来稳定膜，进而起到抗氧化的作用[8]。
3.2 SI与抗氧化指标
3.2.1 SI与MDA、SOD、GSH-PX
MDA是脂质过氧化反应的终产物之一。
MDA能与细胞膜上酶和脂质交联形成变性高分子聚合物，导致细胞膜上酶和脂质变性，降低了细胞膜的流动性。
这些高分子化合物被溶酶体吞噬后，会逐渐蓄积成为脂褐质，沉淀在各种脏器内的细胞中，阻碍细胞的正常代谢和功能，破坏核内的DNA、RNA，使细胞萎缩死亡[9]。
MDA的含量常常可以反映机体脂质过氧化的速度和血管损伤程度以及氧化，细胞内氧自由基存在的水平。
机体内存在的抗氧化系统包括酶系统和非酶系统，而SOD是酶系统的重要组成部分，主要清除体内的超氧阴离子自由基，催化其发生歧化反应，阻断和防止一系列自由基连锁反应的加剧，抑制脂质过氧化反应[9]。
此酶活性与衰老、心脑血管疾病、肿瘤、炎症等有着密切的关系，是反映机体抗氧化能力的重要指标。
GSH-PX也是机体抗氧化系统的重要成分，存在于人体各组织器官中，参与各种组织中糖酵解的中间代谢。
它催化还原型谷胱甘肽（GSH）成为氧化（GSSH），使有毒的过氧化物自由基还原为无害的羟基化物，使过氧化物分解，从而保护细胞、组织免受过氧化物的损伤[9]。
因此，MDA、SOD、GSH-PX成为最基本的抗氧化指标。
本研究结果显示：
SI各剂量组的血清MDA含量均显著低于模型组，差异有显著性（P<0.01），MDA含量高剂量组、中剂量组、低剂量组之间差别有统计学意义；而SOD活性和GSH-PX活力均显著高于模型组，差异有显著性（P<0.01），GSH-PX活力高剂量组与中、低剂量组之间差别有统计学意义，SOD活力高级量组、中剂量组、低剂量组之间差别有统计学意义；说明SI可降低MDA含量，提高SOD、GSH-PX活性，在一定程度上抑制了氧化作用的损伤，但低剂量组GSH-PX活力与模型组比较差异没有显著性意义，说明低剂量的SI抗氧化作用不明显。
3.2.2 SI与LDH、NO
LDH存在于人体各组时器官中。
LDH是机体能量代谢中的一种重要酶，LDH的质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢，当机体各组织器官病变时，其组织器官本身的要发生改变，并且可引起血液中LDH改变。
血清中LDH活性的变化可在一定程度上反应组织受损情况[10]。
当机体各组织器官病变时，可引起血液中LDH改变。
它的改变，直接影响到机体的能量代谢，从而成为细胞损害的指标之一。
本实验结果显示，SI中、高剂量组LDH活性与模型组相比均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。
高剂量组与中剂量组、低剂量组相比差异有统计学意义。
而低剂量组与中剂量组、模型组相比均无差别，说明SI在一定程度上可降低LDH活性。
NO是内皮细胞中L-精氨酸在一氧化氮合酶（NOS）作用下氧化生成的一种重要的生物活性物质，是心血管系统重要的调节因子，LDL和NO之间相互作用与心脑血管疾病的发生发展密切相关[11]。
在心脑血管疾病的发生过程中涉及血液和血管壁的众多细胞及其分泌的细胞因子，NO是这些细胞分泌的信息传递物质之一。
作为细胞间信息传递分子，NO具有减少体内血小板的聚集，抑制血小板粘附以及内皮细胞损伤所引起的血小板粘附、聚集及血栓形成的作用[12]。
血管内皮是心血管系统重要的保护屏障，同时也是一个重要的内分泌器官，其分泌的多种活性物质对于维护正常的血管紧张度至关重要，其中包括NO。
血管内皮细胞产生的NO，通过细胞膜迅速传递至血管平滑肌细胞，使平滑肌松弛，血管扩张，从而调节血压和血流分布。
内源性NO调节血管内皮生长，触发血管活性物质，促进血管生长与再生。
血管内皮细胞产生的NO在生理、病理情况下均有保持血管内皮细胞完整性的作用[13]。
NO在缺血性脑损害所起的作用一直是研究的重点。
近年来研究的结果有分歧，例如应用NOS抑制剂治疗脑梗塞，有报道用后可减少梗塞灶体积；但也有报道用后对梗塞灶体积无影响或反增大。
本实验结果表明，模型组血清NO浓度明显低于其它各组（P<0.01）。
SI低、中、高剂量组NO活性与模型组相比均降低，差异有统计学意义（P<0.01）。
高剂量组与中剂量组、低剂量组相比差异有统计学意义。
而低剂量组与中剂量组相比均无差别，说明SI在一定程度上可增高NO含量。
综上所述，SI改善了脑缺
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