仙鹤草鞣质成分的抗肿瘤作用研究.docx

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仙鹤草鞣质成分的抗肿瘤作用研究

黑龙江医药HeilongjiangMedicineJournalVol124No11

2011・29・

仙鹤草鞣质成分的抗肿瘤作用研究

宛春雷,金哲雄

哈尔滨商业大学药学院（哈尔滨　150076

摘　要　目的:

研究仙鹤草提取物中鞣质成分抗肿瘤作用,为临床应用提供基础。

方法:

用70%丙酮提取过滤浓缩仙鹤草粉末,再对提取液进行正丁醇,乙酸乙酯进行多次萃取,得到溶于乙酸乙酯层的鞣质和溶于正丁醇层的鞣质,并用AB-8型大孔树脂纯化精致得其鞣质成分。

HepG2肿瘤细胞和BEL-7402肿瘤细胞进行MTT于BEL-7402细胞72h后,细胞的生长增殖作用被抑制,,但在250μg/mL和300μg/mL时抑制率无明显的增加,各剂量组OD,（P<0105,其IC50为891277μg/mL。

h,并随着药物浓度的增大而增强,作用明显,但在μ,各剂量组OD值与空白性组相比,均具有显著性差异（P为μ。

关键词:

中图分类号:

　　　　文献标识码:

A　　　　文章编号:

1006-2882（201101-029-03

StudyonAntitumorActionofTanninCompositioninAgrimonia

YuanChunlei,etal

PharmacyCollegeofHarbinCommerceUniversity

Abstract:

Objective:

TostudythetannincompositionofextractionofAgrimoniaantitumoractionandprovideexperimen2talbassisforclinicalapplicatiom1Methods:

extractandfilterAgrimoniapowderwith70%acetone,thenextractAgrimoniaex2tractwiththeEtOAcandn-BuOHorgan-solutionmanytimes1ObtaintannincompositiondissolveEtOAcanddissolven-BuOH,thenpurificationanddepuratetwoorgan-solutionwithAB-8macroporousresin1Atlast,ChooseextractionsofEtOAc’s

313供试品溶液的制备项下方法制备供试品溶液,按上述色

谱条件测定并计算回收率,结果见表1。

表1　加样回收率试验（n=6（序号00301

取样量

（g013075013112013097013191013179013150

4　讨论

本文供试品溶液的制备参考了《中国药典》2005年版I

样品中加入量

含量（mg（mg

212451212721212611213297213210212998

212102*********212102121021210

实测值

（mg414404149041471415304152141510

回收率

（%9812199196971109814798102100115

平均回收率（%RSD（%

9816511199

3110　供试品含量测定取复方颈康丸按照313供试品溶液

的制备项下方法制备供试品溶液,按上述色谱条件测定。

结果见表2。

表2　青藤碱含量测定结果

样品序号

00301

0030200303

部青风藤项下青藤碱含量测定中供试品溶液的制备方法。

曾比较了用甲醇提取和用70%乙醇提取对青藤碱含量的影响,二种方法青藤碱含量相同,且都能分离完全,为了减少甲醇的毒性影响,采用了用70%乙醇提取的方法。

在流动相的选择中曾用乙腈-磷酸盐缓冲液系统进行分离,分离效果和峰型都不如本文的乙腈-水-二乙胺系统。

本文在超声提取中,比较了20、25、30min三种提取时间,结果表明,超声处理25min,青藤碱可以提取完全,所以采用25min作为超声提取的时间。

黄芪的薄层色谱鉴别中采用101大孔吸附树脂层析,有效减低了薄层色谱的背景干扰。

参考文献

[1]　国家药典委员会1中国药典,I部[S]1北京:

化学工业出版

青藤碱mg/g

713017142071115RSD（%115111261173

社,2005:

1541[2]　张钰泉,反相高效液相色谱法测定青风藤中青藤碱的含量[J]

1黑龙江医药,2002,15（41[3]　陈发奎1常用中草药有效成分含量测定[M]1北京:

人民卫

生出版社,199713741

收稿日期:

2010-11-01

・30・黑龙江医药HeilongjiangMedicineJournalVol1

24No112011

depuratedtannincompositiontomakeMTTpharmacoexperimentonHepG2tumorcellsandBEL-7402tumorcellstostudytheantitumoractionofthetannincompositioninAgrimonia1Results:

AftertheextractionofEtOAcofthedefferentconcentra2tioneffectiononBEL-7402tumorcells72hours,theincreaseactionoftumorcellsisinhibited,withtheincreasementoftheconcentration,actionisobvious,butconcentrationin250μg/mLand300μg/mL,theinhibitionratiodoesnotincreaseobvi2ously1everydosegroup’sODvaluecomparewithblankgroup,Allofthemhaveobviousdifference1（P<0105,theIC50is891277μg/mL。

AftertheextractionofEtOAcofthedefferentconcentrationeffectiononHepG2tumorcells72hours,thein2creaseactionoftumorcellsisinhibited,withtheincreasementoftheconcentration,actionisobvious,butconcentrationin250μg/mLand300μg/mL,theinhibitionratiodoesnotincreaseobviously1everydosegroup’sODvaluecomparewithblankgroup,Allofthemhaveobviousdifference1（P<0105,theIC50is127185μg/mL。

Keywords:

Agrimonia;antitumorMTT

　　鞣质又称单宁[1]（Tannin,是一类比较复杂的多酚类化合物。

鞣质是可再生的天然有机化合物,广泛分布于植物的叶、皮、木、果、根皮内,并且影响着这些植物性物料的性质和应用。

除在苔藓植物中很少存在外,广泛存在于植物界,约70%以上的中草药中含有鞣质类化合物。

多含于木本植物内,,学工业属于树木提取物育更新,永续不断、、贯众、地榆、柯子、仙鹤草、。

鞣质在过去常作为杂质除去,但目前的研究证明鞣质有一系列的生理活性,引起了国内外广泛关注。

医药、农业、林业、食品、化工、环境等学科领域均有学者从不同角度开展了鞣质的基础和应用研究,尤其是医药领域,鞣质具有很强的抗肿瘤活性[2]。

其抗癌机理或是与抑制致癌因素有关,或是直接作用于肿瘤细胞,或是发挥综合的作用,鞣质具有活泼的化学性质,选择性高、活性强、毒副作用小且使用面广,其潜在的用途十分广阔,是一种很有潜力的抗癌天然药物,有赖于今后的研究和开发。

仙鹤草[3]（AgrimoniapilosaLedeb1为蔷薇科多年生草本植物龙牙草的全草,异名脱力草、马鞭草、龙牙草、石打穿等,始载于《滇南草本》。

主要成分含有仙鹤草素、仙鹤草内酯、鞣质、甾醇、有机酸、酚性成分、皂苷、仙鹤草酚（A、B、C、D、VC、VK等。

现代药理研究证实,仙鹤草具有收敛止血、截疽、止痢、解毒,主要用于咳血、吐血、崩漏下血、疟疾、血痢、脱力劳伤、痈肿疮毒、阴痒带下等。

仙鹤草资源丰富,临床应用广泛。

为充分利用仙鹤草药用资源提供理论依据,我们对仙鹤草的化学成分进行了系统研究,发现1个新化合物,并对仙鹤草3种提取物进行了抗菌活性试验[4]。

1　材料111　实验对象

人肝癌细胞株BEL-7402细胞购自ShanghaiCellBank,China。

人肝癌细胞株HepG2细胞是由哈尔滨商业大学药学院惠赠。

均培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中,置于CO2培养箱（温度37℃,体积分数为0105的CO2,相对湿度为95%培养。

2、3d传代一次,取对数生长期细胞进行实验。

112　药物及试剂

DMEM（InvitrogenCorporation;注射用盐酸多柔比星（ADM,浙江海正药业股份有限公司;胎牛血清（BILLAB;胰酶、RnaseA、DMSO、HEPES、TritionX-100（SCIENTIFIC

RESEARCHSPECIAL;FLUO-3/AM（联科生物;DCFH-DA（碧云天。

1（,70%丙酮,用组织破碎,抽滤,合并滤液,浓缩,再用乙酸乙酯和饱和正丁醇萃取,浓缩,干燥,即得丙酮提取物乙酸乙酯和正丁醇萃取层粉末。

（2乙酸乙酯层和正丁醇层精制品的制备

①大孔吸附树脂柱的安装及处理取AB-8型大孔高分子吸附树脂250g,添加乙醇浸泡,超声处理30min滤去乙醇液,添加蒸馏水浸泡,超声处理30min,滤去水液,反复处理3次后,以水浸液装入玻柱（Φ30mm,H500mm内,以水洗涤后备用。

②精制品的制备称取乙酸乙酯层3g,加水20mL溶解后,添加95%乙醇60mL,搅匀,置冰箱（2～8℃放置过夜,次日,离心（4000rpm,5min,滤过,滤液置于薄膜蒸发仪上减压加热回收乙醇,浓缩,均得约115g粉末,添加水30mL,溶解,将水溶液通过已处理的备用AB-8型大孔吸附树脂柱（Φ30mm,H500mm,以流速20mL/min动态吸附。

吸附完毕后,树脂柱以水（约1500mL淋洗树脂柱。

淋洗后,以60%乙醇脱洗树脂柱（脱洗流速20mL/min,收集乙醇洗脱液约500mL,减压加热回收乙醇,干燥,即得精制后的乙酸乙酯层粉末1117g,正丁醇层粉末1105g。

2　方法及结果211　MTT法检测对肿瘤细胞增殖的影响21111　试验方法

将对数生长期的肿瘤细胞接种于96孔板中,细胞浓度

5

为1×10个/mL,每孔加100μL培养液,24h后加入不同浓度的乙酸乙酯和正丁醇层,使其终浓度分别为50、100、150、200、250和300μg/mL;阳性对照组加阿霉素,终浓度为10μg/mL;空白对照组加相同体积的培养液。

置于37℃,5%CO2培养箱中。

72h后,倒去培基和药液后,分别加入100μL、015mg/mL的MTT溶液,继续培养4h,然后吸去上清液,每孔加入二甲基亚砜150μL,轻轻振荡以使溴代噻唑蓝完全溶解,约5min后在620nm波长处用酶标仪测其吸光度（OD值。

用如下公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率,并按中效方程计算IC50。

细胞生长抑制率（%=1-×100%

黑龙江医药HeilongjiangMedicineJournalVol124No11

2011・31・

双黄连注射液无菌检查的方法验证

赵亚丽,吴　英

黑龙江农业经济职业学院（牡丹江　157041

摘　要　目的:

主要是建立一种适合于双黄连注射液进行无菌检查的方法。

方法:

薄膜过滤法与直接接种法。

结果:

可照薄膜过滤检查法的检查条件进行双黄连注射液的无菌检查。

关键词:

双黄连注射液;无菌检查;方法验证中图分类号:

R92711　　　　文献标识码:

A　　　　文章编号:

-2882--03

VerificationofMethodofIAsepsisTest

etal

HeiofAgriculturalEconomy（Mudanjiang,157041

Abstract:

OestablisharightmethodofShuanghuanglianinjectionasepsistest1Methods:

percolatedthroughmembranceandinoculateddirectly1Results:

Shuanghuanglianinjectionasepsistestcanbeconductedaccordingtothemethodofpercolatingthoughmembrance1

Keywords:

Shuanghuanglianinjection;asepsistest;methodVerification

1　前言

抗呼吸道病毒和流感病毒的作用,为全国中医医院急诊治疗必备的药品之一,也是目前人们用于治疗感冒的常用药。

为保证药品的检验质量,我国药典明确规定对所用的无菌表7-2　乙酸乙酯层对HepG2细胞生长的抑制作用（x±s

组别空白组阿霉素乙酸乙酯层乙酸乙酯层乙酸乙酯层乙酸乙酯层乙酸乙酯层乙酸乙酯层

剂量（μg/mL孔数

-1050100150200250300

1212666666

OD值±010*******

双黄连注射液是以金银花、黄芩、连翘提取物制成的纯中药静脉水针剂,有清热解毒、清宣风热的功效,有较强的

21112　乙酸乙酯层对BEL-7402细胞增殖的影响

由表7-1可见,不同浓度的乙酸乙酯层作用于BEL-7402细胞72h后,细胞的生长增殖作用被抑制,并随着药物

浓度的增大而增强,作用较明显,但在250μg/mL和300μg/mL时抑制率无明显的增加,各剂量组OD值与空白组相比,均具有显著性差异（P<0105,其IC50为891277μg/mL。

21113　乙酸乙酯层对HepG2细胞增殖的影响

如表7-2所示,不同浓度的乙酸乙酯层作用于HepG2细胞72h后,细胞的生长增殖作用被抑制,并随着药物浓度的增大而增强,作用明显,但在250μg/mL和300μg/mL时抑制率无增加不明显,各剂量组OD值与空白性组相比,均具有显著性差异（P<0105,其IC50为127185μg/mL。

表7-1　乙酸乙酯层对BEL-7402细胞生长的抑制作用x±s

组别剂量（μg/mL孔数空白组-12阿霉素1012乙酸乙酯层506乙酸乙酯层1006乙酸乙酯层1506乙酸乙酯层2006乙酸乙酯层2506乙酸乙酯层3006

OD值±010*******

抑制率（%

-71134131133914060130731137815180130

　　注:

3与空白组比较P<0105。

参考文献

[1]　金在久1仙鹤草的化学成分及临床研究进展[J]1华西药学

抑制率（%

-72141241755918769157791608716387179

杂志,2006,21（5:

468-4711

[2]　冯卫生1鞣质类化合物的生物活性研究进展[J]1中国医药

情报,2006,2（4:

2201

[3]　谢沛珊,李爱媛,周芳,等1中草药抗肿瘤筛选的实验研究

[J]1时珍国药研究,2006,7（1:

191

[4]　马丽萍,赵培荣,王留兴,等1仙鹤草水提液对食管癌Eca109

细胞生长的抑制作用[J]1郑州大学学报（医学版,2007,42

（1:

149-1511

　　注:

3与空白组比较P<0105。

收稿日期:

2010-09-27