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农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究
分子植物育种，2006年，第4卷，第2期，第228-232页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.2,228-232
研究报告
ResearchReport
农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究
袁鹰1
李启云1
郝文媛1
谭化1
孔祥梅1
张光弟2
刘德璞1*
1吉林省农业科学院生物技术研究中心,公主岭,136100;2吉林省梨树县农业技术推广站,四平,136500
*通讯作者,liudp@
摘 要 以东北春玉米自交系7922、340、78599、921及美国杂交种H99等幼胚愈伤组织为受体，利用农杆
菌介导法转化Bt（CryIA.）基因，研究菌液预处理、愈伤组织状态、侵染培养基、侵染时间及共培养条件等因素
对转化频率的影响。
根据转化愈伤组织的除草剂（Basta）抗性筛选结果评估转化率，表明继代培养3~5d的愈
伤组织适于转化，其中以继代5d的7922愈伤组织转化率最高，为46.6%；不同基因型对农杆菌转化率存在
差异，H99的抗性愈伤组织率为34.57%，7922为26.27%、340为21.36%、78599和921抗性愈伤组织率仅为
8.02%和6.78%。
基因型间差异显著；浸染培养基中加入（AS100~200mg/L）抗性愈伤转化率明显提高；菌液浓
度OD6000.5~0.6、侵染时间5~10min、共培养时间3d最佳。
关键词 农杆菌介导法,转化频率,影响因素,抗性愈伤组织
StudiesonInfluencingFactorsofAgrobacteriumtumefaciensMediated
MaizeTransformation
YuanYing1
LiQiyun1
HaoWenyuan1
TanHua1
KongXiangmei1
ZhangGuangdi2
LiuDepu1*
1JilinAcademyofAgriculturalSciences,Gongzhuling,136100;2AgricultureGeneralizeStationofLishuCounty,Siping,136500
*Correspondingauthor,liudp@
AbstractMaizeinbredlinesinNortheast（7922、340、78599etc.）immatureembryoscalliweretransformedby
Agrobacteriumtumefaciens（CryIABt.）inthisreport.Factorsinfluencingtransformationefficiencywerestudied,
includingpre-treatment,callusstate,infectionmedium,infectiontimeandco-cultivationetal..Resultsshowed
thatcallussubculturefor3~5dayswassuitablefortransformationandthattransformationefficiencyof7922callus
reachedthehighestof46.6%after5dayssubculture.Dominantdifferenceexistedamongdifferentmaizegenotype
oninfectionsensitivityandH99wasthemostsensitivegenotypewith34.57%resistantcallus.Transformationeffi-
ciencywasimprovedobviouslywithacetosyringone（AS）（100~200mg/L）appendedinmedium.Inaddition,bac-
teriumconcentration（OD6000.5~0.6）,5~10minutesinfectiontimeandco-culture3daysweretheoptimalcondi-
tionsforAgrobacteriumtumefaciensmediatedmaizetransformation.
KeywordsAgrobacteriumtumefaciensmediatedtransformation,Transformationefficiency,Influencingfactors,
Resistantcalli
玉米是重要的粮食、饲料，又是制药、淀粉、糖
浆、油料、酒精工业的主要原料。
中国是世界上第二
大玉米生产国，玉米在我国经济生产中占有非常重
要的地位。
在玉米生产上，虫害是导致玉米减产的重
要危害之一。
玉米螟是我国大部分主产区的主要玉
米害虫，因而我国玉米害虫的综合防治研究基本上
是围绕玉米螟展开的。
玉米螟的防治应以农业防治
为基础，协调生物防治，化学防治，物理防治等不同
方法。
物理防治主要是消灭越冬虫源、改进耕作制
度、种植抗虫品种；化学防治主要根据不同生育期喷
洒化学杀虫剂；生物防治主要是在玉米螟产卵盛期
释放赤眼蜂可达到较好的效果。
而化学防治和生物
防治一个污染环境一个成本高，在玉米害虫的综合
治理中，抗虫品种的利用是一项长期而有效的措施，
培育抗虫品种已经成为育种家的重要目标。
以杂交技术为基础的传统作物品种选育方法由
Page2
于抗源缺乏难以实现目的，引入外来基因存在周期
长、效率低、杂交不育等问题。
现代生物技术育种打
破了植物种属甚至物种之间难以杂交的天然屏障，
可以实现远缘抗虫基因的转移，使作物迅速地、定向
地获得抗虫性，同时又能保留原有的良好农艺性状
（袁鹰等,2005）。
用基因工程技术改良玉米，培育具有
高产、优质和抗逆性强的新品种，表现出很强的潜力
（王关林和方宏筠,1998）。
目前玉米的遗传转化方法主要有基因枪法和农
杆菌转化法。
而农杆菌转化方法以其廉价，简单可以
转移大片段的DNA，且以低拷贝整合到植物染色体
等诸多优点越来越受到人们的青睐（Chengetal.,
2001）。
迄今为止农杆菌介导法的遗传转化已在20
多种单子叶植物中取得成功，其中包括重要的禾谷
类作物（刘明志,1996）。
尤其是近几年，农杆菌转化法
在重要的农作物水稻、玉米、小麦上取得了突破性进
展（Hieietal.,1994;Gouldetal.,1991;Chengetal.,
1997）。
Ishida等（1996）用含超双元载体的农杆菌转化
玉米幼胚A188获得成功，成为农杆菌转化玉米的一
个里程碑。
1999年，先锋种子公司Zhao等获得了农
杆菌转化玉米骨干自交系的专利。
我国黄璐、张荣等
（黄璐和卫志明,1999;张荣等,2001）采用农杆菌转化
玉米单交种胚性愈伤组织成功并再生植株。
本研究用农杆菌介导法向东北春玉米自交系
7922、78599、340、921及美国杂交种H99幼胚诱导
出来的II型愈伤组织，转移苏云金芽孢杆菌（Bacillus
thuringiensis）杀虫蛋白基因（CryIA）结果获得了抗性
愈伤组织，并分化出植株。
并对影响转化效率的因素
进行了探讨，根据抗性愈伤组织产生频率对农杆菌
转化玉米的条件进行了优化，提高了农杆菌介导法
转化东北春玉米自交系的转化频率，为今后培育抗
虫转基因品种打下坚实的基础。
利用建起的该转化系统，在几年多批转化实践
中已得到预期的效果，对获得的转基因后代连续3
年进行分子检测和田间接虫鉴定筛选出一批稳定的
抗虫自交系。
1材料与方法
1.1材料与试剂
玉米自交系7922、78599、340、921由吉林省农业
科学院玉米研究中心提供，H99由美国IUS大学王侃
惠赠。
携有GFMCryIABt.载体的苏云金芽孢杆菌杀
虫蛋白基因由郭三堆先生所提供（图1）。
所用的载体为pBI121包含Bt杀虫蛋白基因和
新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因，筛选标记Bar基因，
启动子为35S，终止子Nos3'序列，目的基因序列全
长1824bp，编码608个氨基酸。
愈伤组织诱导培养基：
MS大量，MS微量，MS
维生素，100mg/L肌醇，水解酪蛋白500mg/L，L-脯
氨酸500mg/L，L-天门冬酰胺200mg/L，泛酸钙
0.5mg/L，生物素0.05mg/L，2,4-D1.5mg/L，蔗糖
4%（w/v）。
继代培养基：
MS大量，MS微量，MS维生素，
100mg/L肌醇，水解酪蛋白500mg/L，2,4-D2.0mg/L，
蔗糖3%（w/v）。
菌液悬浮培养基：
1/2MS大量，1/2MS微量，1/2
MS维生素，100mg/L肌醇，水解酪蛋白500mg/L，
2,4-D1.5mg/LAS100mg/L+3.6%蔗糖+6.8%葡萄糖，
pH5.2。
共培养培养基：
1/2MS大量，1/2MS微量，1/2
MS维生素，2,4-D1.5mg/LAS100mg/LAgNO3
850mg/L+半光氨酸100mg/L+3%蔗糖。
恢复培养基：
1/2MS大量，1/2MS微量，1/2MS
维生素，2,4-D1.5mg/L+MES0.5g+AS100mg/L+Cef
500mg/L+3%蔗糖。
筛选培养基：
D1：
1/2MSZ+2,4-D1.5mg/L+
MES0.5g+Cef500mg/L+Basta1.5+3%蔗糖；D2：
N6+
2,4-D1.5mg/L+MES0.5gAS100mg/L+AgNO3850
mg/L+Cef500mg/L+Basta1.5mg/L+3%蔗糖。
1.2玉米幼胚愈伤组织的诱导
取授粉10~13d的、大小在1~2mm的未成熟幼
胚，盾片向上，接种在诱导培养基上进行诱导，每15d
用新鲜培养基继代一次。
45d后形成稳定的II型愈伤
组织。
1.3农杆菌培养
取保存在-80℃甘油管菌种涂抹在固体YEP培
养基上（含km50mg/L），27℃培养。
挑取长好的单菌落
置于添加km50mg/L的YEP液体培养基上，于27℃
180r/min震荡培养至对数期，5000r/min离心10min
收集农杆菌，并用重悬液悬浮至OD600为0.3~1.0待用。
图1质粒T-DNA区
Figure1TheT-DNAregionofplasmid
农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究
StudiesonInfluencingFactorsofAgrobacteriumtumefaciensMediatedMaizeTransformation
229
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
1.4农杆菌侵染和共培养
将继代2~12d的愈伤组织分别集中于一个小三角
瓶中，用制备好的农杆菌液（OD600为0.5）浸泡10
min，弃菌液，置于带滤纸的培养皿中，吸去多余的菌
液，然后将愈伤组织放在垫滤纸的共培养基上，27℃
共培养1~6d。
1.5不同浓度的农杆菌侵染
将继代5d的愈伤组织集中于一个小三角瓶中，
分别用OD值为0.3、0.5、0.6、0.8、1.0的菌液浸泡10
min，其余步骤同1.4。
1.6酚类物质乙酰丁香酮（AS）的处理
将继代5d的愈伤组织分别集中于一个小三角
瓶中，分别浸于含AS0、100mg/L、200mg/L农杆菌菌
液和共培养基上。
其余步骤同1.4。
1.7抗性愈伤组织的的筛选
将共培养3d后的愈伤组织置恢复培养基上，
10d后置于筛选培养基上进行筛选。
每10d更换一
次新鲜培养基，每次都挑选长势旺盛的愈伤组织进
行继代。
1.8调查项目及统计方法
调查记录每一个基因型经过3次筛选之后的抗
性愈伤数，以抗性愈伤/愈伤总数伊100%计算转化频
率，以百分率经反正弦进行方差分析和显著性测验。
2结果与分析
2.1不同基因型玉米对农杆菌的敏感性
玉米不同基因型对农杆菌的反应以及农杆菌对
玉米的侵染能力直接影响到玉米的遗传转化效率。
本研究将5个玉米自交系幼胚诱导出来的愈伤组织
各400块用农杆菌侵染，共培养3d后，在培养基中
加Basta3mg/L做3次筛选，未转化的愈伤逐渐褐化
死亡，而获得转化的抗性愈伤正常生长。
根据抗性愈
伤组织的产生频率作统计分析（表1和表2）。
结果表明，重复间没有达到显著水平，而不同基
因型间存在显著差异，说明不同基因型的玉米对根
癌农杆菌侵染的敏感性不同。
H99对农杆菌最敏感，
抗性愈伤组织率为34.57%，其次是7922，为
26.27%，340为21.36%而78599、921抗性愈伤率仅
为8.02%和6.78%。
从不同基因型玉米的农艺性状角
度看，虽然H99愈伤组织易诱导，抗性愈伤组织率亦
较大，但它的熟期太早、秆矮、易感病，农艺性状不
好，所以一般不宜作育种材料直接利用，我们认为转
化效率最好的基因型是7922，与其它基因型间存在
显著差异。
表1玉米基因型对根癌农杆菌敏感性的方差分析
Table1Thevarianceanalysisofsensitityofgenotypesinmaize
tolinesofAgrobacterium
变异来源
Source
重复间
Repeat
基因型间
Genotypes
ofmaize
误差
Error
总计
Total
自由度
DF
3
4
12
19
平方和
SS
39.4147
2280.6826
104.9138
2425.0111
均方
MS
13.1382
570.1706
8.7428
F值
F-value
1.503
65.216
F0.05
0.2639
0
表2玉米基因型对根癌农杆菌敏感性的显著性测验
Table2Thesignificancetestofsensitivityofgenotypesinmaize
tolineofAgrobacterium
基因型
Genotypes
H99
7922
340
78599
921
抗性愈伤率（%）
Frequencyofresistcalls
34.57
26.27
21.36
8.02
6.78
显著性
Singnificance
F0.05
F0.01
a
A
b
B
c
B
d
C
d
C
2.2愈伤组织的生长状态对转化频率的影响
分别用继代2、3、5、6、7、10、12d的愈伤组织进行
侵染，通过3次抗性筛选后，抗性愈伤组织频率不同，
结果（表3），愈伤组织的生长状态直接影响转化的频
率。
其中7922以继代5d的愈伤组织转化率最高，达
到了46.6%，而继代2d和继代12d的愈伤组织侵染
后抗性愈伤组织频率较低分别为10%和21.2%。
2.3不同菌液浓度（OD600值）对玉米转化的效果
菌液浓度是影响遗传转化的关键因素之一。
本实
验用OD600值分别为0.3、0.5、0.6、0.8、1.0的菌液侵染
7922胚性愈伤组织10min，结果（图2）显示OD600值在
0.5~0.6为宜，抗性愈伤组织频率最高，可达60%左
右，低于0.3和高于0.8抗性愈伤频率低于20%。
2.4共培养时间对玉米转化效率的影响
230
Page4
农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究
StudiesonInfluencingFactorsofAgrobacteriumtumefaciensMediatedMaizeTransformation
继代5d的7922、78599的II型愈伤组织与
OD600值为0.6的农杆菌分别共培养1、2、3、4、5、6d
后，经连续3次筛选，结果前1~3d抗性愈伤数呈上
升趋势，而3d后抗性愈伤数反而呈下降趋势（图3），
共培养5~6d后的愈伤组织周围明显能看到农杆菌
的生长，愈伤组织生长受到抑制，在筛选过程中由于
菌没能抑制住最后淘汰。
2.5乙酰丁香酮对转化频率的影响
在重悬液、共培养基和恢复培养基中信号分子
（乙酰丁香酮）的使用，明显的提高抗性愈伤率，在
不加AS的情况下8%的水平基础上提高60%以
上，达到14%。
100mg/L和200mg/L没有明显差异，
基本一样。
3讨论
据国内外报道，玉米农杆菌介导转化，通常是直
接浸染发育10~20d的玉米幼胚，Ishida等（1996）用含
超双元载体对玉米的农杆菌成功转化受体是A188幼
胚，先锋种子公司Zhao等（1999）获得农杆菌转化玉米
骨干自交系的专利也是用A188幼胚。
国内张荣等
（2001）报道建立了对玉米的农杆菌转化体系同样也主
要是用幼胚。
但幼胚做侵染转化受取材时间限制，用
来自幼胚诱导的胚性愈伤组织做农杆菌介导转化的
受体更有优越性。
黄璐和卫志明（1999）采用农杆菌转
化胚性愈伤组织获得再生植株的材料为A188伊B73
的玉米单交种，权瑞党等（2003）以农杆菌LBA4404介
导将潮霉素磷酸转移酶（hygromycicphosphotrans-
ferase，HPT）和来自大肠杆菌的betA基因导入玉米骨
干自交系齐319、掖515、掖502等胚性愈伤组织，并
由筛选出的抗性愈伤组织再生出可育植株。
但他们使
用的自交系源自山东。
东北是我国玉米的重要主要生
产地，围绕东北的春玉米转基因是十分必要的。
本试验研究以东北骨干自交系的幼胚胚性愈伤
组织做农杆菌介导转化的受体，研究转化影响因素。
从上面对不同基因型之间的差异分析可以看出基因
型差异是玉米转化中不可忽视的问题，基因型间存
在着其内在的特殊性，这也是我们就东北春玉米自
交系的转化做影响因素研究的原因。
由于愈伤组织
来源于不同自交系，在愈伤状态、结构、对农杆菌的
敏感性等都有差异，因此转化所需的条件亦不同，致
使其转化率和再生率都有所不同。
张荣等（2001）在以幼胚为受体的转化的试验中，
研究了菌液浓度、共培养时间影响作用，认为共培养
在前3天GUS表达呈上升趋势，而3d后呈下降趋
势，这与本试验的结果相似；而浸染的菌液浓度
OD600为0.3左右为好，与本试验以愈伤组织为受体
转化愈
伤块数
No.of
receptor
100
125
103
152
125
113
100
100
135
125
102
135
抗性愈
伤块数
No.of
resistantcalli
10
27
48
59
41
24
11
22
47
43
31
26
表3不同继代天数对玉米转化频率的影响
Table3Effectofdifferentiationsubculturedaysonmaizetrans-
formation
品种
Varieties
7922
78599
继代天数（d）
Subculture
days
2
3
5
6
10
12
2
3
5
6
10
12
抗性愈伤频
率（%）
Frequencyof
resistantcalli
10.0
21.6
46.6
38.8
32.8
21.2
11.0
22.0
34.8
34.4
30.4
19.2
图2菌浓度对玉米7922愈伤组织转化的影响
Figure2Effectofbacterialconcerationontransformationof
maize7922calli
图3继代天数对玉米愈伤组织转化的影响
Figure3Effectofsuculturedaysontransformationofmaizecalli
231
Page5
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
的结果不同，在本试验的结果中OD600的值是
0.5~0.6，但与权瑞党等（2003），在以幼胚为转化受体
的试验结果相同。
看来不论以幼胚还是胚性愈伤组
织为受体，共培养时间以3d为好，而浸染时的菌液
浓度后者需加1倍时间，说明感受细胞表现不同，
幼胚相对更容易感染，细胞的感受态状况直接影响
着农杆菌的转化效率。
因此，合适的材料进行农杆
菌转化对转化成功至关重要。
Schlappi和Hohn
（1992）用农杆菌法研究3个玉米品系幼胚不同发育
阶段对农杆菌的感受性，结果表明授粉后14~16d
的幼胚感染频率最高。
本试验利用不同继代天数的
愈伤组织作为受体，抗性愈伤率也不一致。
继代初
期（1~2d）如果进行农杆菌侵染，由于愈伤组织生长
状态没恢复好，生长缓慢，侵染后易变褐；而大于
10d的愈伤组织细胞侵染后也易变褐，所以一般情
况下，胚性愈伤组织最好是继代5d左右用来侵染
效果较好。
但这也不是绝对的，要依不同的基因型、
不同愈伤组织生理状态而定。
单子叶植物难以被农杆菌转化，原因之一就是
单子叶植物中存在抑制根癌农杆菌生长和对植物细
胞吸附起抑制性的信号分子，它抑制根癌农杆菌Vir
基因的表达。
许耀等（1993）用复合酚处理农杆菌，与
水稻悬浮培养细胞共培养时，表明有许多细菌附着
于水稻细胞表面，以利于T-DNA的转移，在水稻的
转化试验中证实AS可以提高农杆菌的转化效率。
因
此在遗传转化过程中信号分子（乙酰丁香酮）的使用，
使Vir位点转录活化是很必要的。
加入AS，本研究
抗性愈伤率可高13.0%以上。
致谢
本研究由国家转基因植物中试及产业化基地（吉
林）专项（JY03-17-1）资助。
参考文献
ChengM.,FryJ.E.,PangS.,ZhouH.,HironakaC.M.,DuncanD.
R.,ConnerT.W.,andWanY.,1997,Genetictransf
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