不同浓度铝胁迫对小麦成熟胚再生植株及生理特性的影响精.docx

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不同浓度铝胁迫对小麦成熟胚再生植株及生理特性的影响精

不同浓度铝胁迫对小麦成熟胚再生植株及生理特性的影响

肖驰平,何光源

3

（华中科技大学植物基因工程研究所,湖北武汉430074

摘要:

研究了酸性条件下铝胁迫对小麦的铝抗性品系Atlas66和铝敏感品系EM12的诱导、分化、根和叶细胞的某些生理特性的影响。

结果表明,抗性品系小麦Atlas66受铝毒害较小,诱导率、分化率无明显变化,而铝敏感品系小麦EM12随铝浓度增大诱导率、分化率分别降至23.42%、11.87%;在不同浓度铝作用下,铝敏感品系EM12叶片中的脯氨酸含量显著升高,而铝抗性品系Atlas66叶片中的脯氨酸含量变化不大,但其根细胞壁的蛋白及己糖和糖醛酸的含量均升高,表明铝促进根细胞壁成分的合成,提高了抗铝性。

关键词:

小麦;铝胁迫;成熟胚;再生植株;生理特性

中图分类号:

Q813.1+2　　文献标识码:

A　　文章编号:

1004-311X（200504-0028-03

EffectofDifferentConsistenceRegenerationfromMatureEmbryoofCharacter

XIAO-（PlantGenetic,&Technology,Wuhan430074,China

Abstract:

Theeffectofdifferent-enerationfrommatureembryoofAtlas66&EM12andphysiologicalcharacterwasstudied.ItfrequencyandthedifferentiationfrequencyofEM12mature-embryowereaffectedobviouslyrelativetoorethecontentofprolineintheleavesofEM12andthecontentofpro-tein,hexoseanduronicacidintherootcell-wallofAtlas66obviouslyundertheAluminiumpressure.Theresultsindicatedthatthesynthesisofsomecomponentinro2otcellwallcausedtheAluminiumtoleranceofresistantAlwheat.

Keywords:

wheat;Aluminiumpressure;matureembryo;plantregeration;physiologicalcharacter收稿日期:

2005-04-01;修回日期:

2005-04-22重点项目:

国家重点基础研究发展计划“973”计划（2002-CB111301作者简介:

肖驰平（1977-,男,湖北省人,硕士研究生,专业方向:

植物基因工程;3通讯联系人:

何光源（1958-,男,博士,特聘教授,博士生导师,研究方向:

植物基因工程,发表论文50余篇,E-mail:

hegy@mail.hust.edu.cn。

　　国内有做小麦铝胁迫方面的研究报道,但通过组织培养进行此项研究尚属首例,其目的一方面揭示小麦铝毒害及耐铝性机制,另一方面为后面的荧光蛋白基因与柠檬酸合成酶

基因共转化铝敏感小麦,并揭示小麦铝毒害及铝离子运输奠

定理论基础和依据。

铝是地壳中含量最高的金属元素,在酸性条件下,固定态

的矿物铝极易被活化而成为可溶态铝。

近年来,随着环境酸

化的日益严重,特别是酸雨导致土壤酸化,引起土壤中有毒金

属离子的溶出。

当环境pH值小于6.0时,铝将从结合态释放

出来,以游离的形式存在,在一定浓度下即可在器官、组织和

分子水平上影响植物的生命过程[1]

成为抑制植物生长的最

重要因素之一。

研究植物对铝胁迫的生理生化反应以及植物

的抗铝机制,筛选出抗性强的植物,对森林和农业生态系统的

保护以及受损环境的生物修复都具有重要意义。

本文通过研究在铝胁迫下,小麦的铝抗性品系Atlas66和

铝敏感品系EM12的诱导、分化、根和叶细胞的某些生理特性

变化,揭示了酸性条件下铝对不同耐受性小麦的毒性差异,阐

明了铝对植物再生的影响及植物对铝的抗性机制。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验材料

供试材料小麦铝抗性品系Atlas66和铝敏感品系EM12,由

本实验室提供,铝浓度为0、50、100、200、300μmolΠl。

每个品种

各五个铝处理,每个处理80个胚,共10组试验。

1.1.2　试剂

Tween80、HgCl2、picloram、2,4-D、琼脂、Glucose、Trisbase、phenolred、TritonX-100、X-Gluc、plurnicF68、Timentin、甲酸

（NAA、吲哚乙酸（IAA、甘露醇、维生素H、卡那霉素。

1.1.3　仪器SW-CJ-2A水平流净化工作台、YX-400B不锈钢双层

立式蒸汽压力消毒器、CS101-2EB电热鼓风干燥箱、蔡式过滤

器、BCD268冰箱、pHS-3C型精密pH剂、SZX超净工作台,HQ45B恒温摇床,TGL-16G冷冻离心机。

1.1.4　培养基诱导培养基以MSSAAΠ2为基本培养基,其主要成分为:

MS培养基的大量元素,L培养基的微量元素,MS培养基的铁盐及维生素,100mgΠl肌醇,20mlΠl3AA（谷氨基酸、脯氨酸和天冬酸胺,30gΠl蔗糖,8gΠl琼脂,pH5.7,添加生长调节物质

Picloram,及不同浓度的铝盐。

分化培养基为R培养基,另外添加5mgΠl和0.01mgΠl2,4-D,并研究加入分化培养基中不同浓度铝对植株再生的影响。

1.2　方法取颜色、大小一致的小麦成熟种子,置于适量清水中,加数滴Tween80,搅拌3～5min,无菌水洗涤1次,再加0.01%HgCl2消毒20min左右,以无菌水洗涤3～5次。

放置在无菌、铺有吸水海绵的平皿中,吸涨处理,露白后,在无菌条件下将不同材料成熟胚盾片接种于不同铝浓度的诱导培养基上。

诱导培养一个月后,得到不同材料、不同铝浓度下的诱导率,然后进行分化培养获得再生植株。

由成熟胚诱导而来的愈伤组织主要有两种,一种来源于胚轴,另一种来源于胚根[2]。

前一种愈伤组织多呈淡黄致密状,有较强的再生植株的能力;后一种愈伤组织多为白至灰色水浸状,基本没有分化能力。

每次均挑取色鲜致密部分传代于相同的培养基上,在25℃下暗培养25～35d后,统计愈伤组织数,计算愈伤组织诱导频率;继而转入分化培养基中,25℃、光周期16h光Π8h暗下培养30d后,统计生根愈伤组织数、出芽愈伤组织数及再生植株数。

再生植株继代培养5d后,收获小麦的根和叶,立即用液氮进行速冻,真空冷冻干燥后,在-30℃以下保存备用[3]。

叶片中脯氨酸含量的测定按张殿忠（1990方法[4]进行。

按SmithBG,etal.（1998方法[5]分离小麦根细胞的细胞壁后,分别测定细胞壁蛋白质、己糖、糖醛酸的含量[6]

。

2　结果与讨论

2.1　不同铝浓度对小麦成熟胚愈伤组织诱导与分化的影响

据观察,以小麦成熟胚盾片为外植体接种5～7d后,开始形成愈伤组织,形态多为乳白色,水浸状,随后愈伤组织继续长大,颗粒状明显,颜色加深为乳黄色,形成团不很大,转分化后5d左右就有绿点出现。

由表1可见,不同浓度铝处理下At2las66成熟胚的诱导频率为88.56%～90.16%,分化频率为28.3%～32.16%,即其诱导与分化频率无明显变化。

而不同浓度铝处理下EM12成熟胚的诱导频率为23.42%～92.5%,

第15卷第4期:

282005年8月　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术BIOTECHNOLOGY　　　　　　　　　　　　　　　　　

Vol115,No14:

28

Aug12005

分化频率为11.87%～33.5%,其诱导频率和分化频率受铝胁迫影响比较大。

表1　不同浓度铝胁迫对小麦成熟胚诱导与分化的影响Table1　EffectofdifferentconsistenceAluminiumpressuretoplant

inducementanddiferentiationfromMatureEmbryoofwheatseeds

试验编号铝浓度（μmolΠL试验材料诱导频率（%分化频率（%

10Atlas6690.1631Z.4250Atlas6693.1432.163100Atlas6689.829.154200Atlas6688.5630.195300Atlas6689.428.360EM1292.533.5750EM1286.629.768100EM1277.3821.849200EM1242.162410

300

EM12

87

2.2　从图1可知,

的叶片中游。

而在铝胁迫下,EM12的叶片中脯氨酸含量明显增加。

已有的研究表明,在环境胁迫下多种植物能在体内积累大量的脯氨酸,并且证明了脯氨酸的积累与活性氧的产生有关,起着植物内源活性氧清除剂的作用[7]。

在不同浓度铝胁迫下,Atlas66叶片中的脯氨酸含量没有变化,而EM12叶片中的游离脯氨酸含量明显增加,这说明营养液中铝离子的存在诱导了EM12叶片中活性氧的产生,从而使其体内脯氨酸积累。

这一实验结果同时也说明了抗性品系小麦的根部有一定的防御机制,能使其叶片细胞所受的损伤达到最小。

图1　不同浓度铝对小麦叶片中游离脯氨酸含量的影响

Fig.1　EffectsofAlonthecontentoffreeprolineinleavesofwheat

2.3　铝对小麦根细胞壁成分的影响

（1铝对细胞壁蛋白质含量的影响Atlas66和EM12小麦细胞壁的蛋白质含量如图2所示。

在没有铝胁迫条件下,2个品系小麦的细胞壁蛋白含量无差异,而随着铝浓度的增大,At2las66的蛋白含量与EM12的蛋白含量差异越来越大,Atlas66的蛋白含量呈明显增大的趋势,而EM12的蛋白含量变化趋势不大。

（2铝对细胞壁糖含量的影响

铝胁迫下2个品系小麦细胞壁内己糖和糖醛酸的含量见图3和图4。

铝胁迫下小麦细胞壁的己糖和糖醛酸的变化规律相同,2个品系小麦细胞壁己糖和糖醛酸的含量均升高。

在没有铝胁迫时,EM12己糖含量高于Atlas66,但当铝浓度为50μmolΠL时,二者己糖含量相当,当铝浓度持续增大时,Atlas66细胞壁中己糖含量逐渐高出EM12。

这说明,

与EM12相比At2las66细胞壁中己糖含量升高更为显著。

在没有铝胁迫时,

EM12糖醛酸含量也高于Atlas66,但当铝浓度为50μmolΠl时,

Atlas66糖醛酸含量略高于EM12

当铝浓度持续增大时,Atlas66细胞壁中糖醛酸含量与EM12细胞壁中糖醛酸含量差异越来越大。

这说明,与EM12相比Atlas66细胞壁中糖醛酸含量升高更为显著。

图2　量的影响

Fig.

2EffectsAlonofincellwallofrootsofwheat

图3　不同浓度铝对小麦根细胞壁中己糖含量的影响

Fig.3　EffectsofAlonthecontentofhexoseincellwallofrootsofwheat

图4　不同浓度铝对小麦根细胞壁中糖醛酸含量的影响

Fig.4　EffectsofAlonthecontentofuronicacidincellwallofrootsofwheat

细胞壁是环境因子对植物细胞产生影响的第一个作用点,它直接与环境接触,保护细胞内部的细胞结构。

因此,在铝胁迫下植物细胞壁的化学成分和机械特性均会发生改变。

植物细胞壁具有很强的积累阳离子的能力,有研究认为铝主要与细胞壁的成分相结合,影响植物正常的代谢活动[8]。

铝可以与细胞壁多糖、蛋白质等成分相结合,降低细胞壁弹性及导水性,进而影响植物的生长。

本文研究表明,铝胁迫对EM12成熟胚的诱导与分化影响很大,对Atlas66影响较小。

此外,通过对再生植株根和叶的某些生理特性的检测,发现Atlas66根细胞壁的蛋白质含量及己糖和糖醛酸含量升高相对EM12十分显著,而游离脯氨酸含量无明显变化。

这说明根细胞壁中的蛋白质及己糖和糖醛酸能与环境中铝结合而阻止铝进入细胞内,降低铝的毒性及铝进入细胞内部的量,构成了植物对铝的抗性特征,有效地保护着植物细胞内部正常生理生化过程。

参考文献:

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212-220.

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nusmassonianatocombinedeffectsofAl,CaandlowpH[J].Chemosphere,2000,40（3:

311-

318.

[4]张殿忠,汪沛洪,赵会贤.测定小麦叶片游离脯氨酸含量的方法[J].植物生理学通讯,2002,4:

62-65.

[5]SmithBG,HarrisPJ,MeltonLD,etal.Crystallinecelluloseinhydratedpri2

9

22005年8月　　　　　　　　　　　不同浓度铝胁迫对小麦成熟胚再生植株及生理特性的影响　　　　　　　　　　　　　

marycellwallsofthreemonocotyledonsandonedicotyledon[J].PlantCellPhysiol,1998,39（7:

711-720.[6]DuboisM,GillesKA,HamiltonJK,etal.Colorimetericmethodfordetermi2nationofsugarsandrelatedsubstances[J].Anal.Chem,1996,28:

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[8]ZhangGC,SlaskiJJ,AlchambaultDJ,etal.Alternationofplasmamembranelipidsinaluminum-resistantandaluminumsensitivewheatgenotypesinre2sponsetoaluminumstress[J].PhysiolPlant,2003,99（2:

302-308.

蜀葵紫红色素及其理化性质研究

孙健1

彭子模

2

（1.中国科学院华南植物园,广东广州510650;2.新疆师范大学生命与环境科学学院,新疆乌鲁木齐830054摘要:

研究了蜀葵（AlthaearoseaL.Cavan.紫红色素的提取纯化工艺、理化性质。

采用溶剂浸提法、硅胶柱层析法对色素进行提取纯化,效果较好。

:

该色素属于花色苷类色素;色素耐光性好;耐氧化性、耐还原性较差;对热有一定的耐受性;;但Fe3+、Fe2+、Cu2+、Pb2+、Sn2+对色素具有不利影响。

关键词:

蜀葵;色素;提取;性质;花色苷

中图分类号:

Q946・83+6;TS264・4　　文献标识码:

A（-03

ResearchonAlthaearoseaL.Cavan.

Properties

SUNJian1

PENGZi-mo

2

（SChinaofBotany,TheChineseAcademyofSciences,Guangzhou510650,P.R.China;2.LifeandEnvironmentScienceInstitute,XinjiangNormalUniversity,Urumuqi830054,P.R.China

Abstract:

Inthispaper,theextraction,purification,properties,crudecomponentsharmtaceelementsandedible-safetyofpurple-redpigmentsofAlthaearoseaL.Cavan.wereresearched.Thepigmentsweresuccessfulextractedfrompurple-redpetalsusingsolventandpurifiedusingcol2umnchromatography.Whenidentifyingthepropertiesofthispigmentbythevisiblespectra,theresultsindicatedthispigmentwasatypeofancho2cyanin.Itwasstronginresistinglightbutpoorinresistingoxideandreduant.Tosomeextent,itwasresistanttothetemperature.Itwasalsofoundintheexperimentsthatconservativeandsomemetalionsdidnotexertnegativeeffectsonthestabilityofthepigment.Whileothermetal

ions,suchasFe3+,Fe2+,Cu2+,Pb2+andSn2+

hadpresentednegativeeffects.Keywords:

AlthaearoseaL.Cavan;pigment;extraction;properties;anchocyanin收稿日期:

2004-10-30;修回日期:

2005-05-26

作者简介:

孙健（1978-,男,博士研究生,从事植物生理、园艺作物采

后生物学研究,发表论文6篇。

　　蜀葵（AlthaearoseaL.Cavan.为锦葵科蜀葵属一年生草本植物。

原产我国,现世界各地均有栽培。

蜀葵一般供观赏用,其茎皮纤维可代麻用,种子可榨油。

此外花和根皮能入药,《别录》载蜀葵“主理心气不足。

”;《本草拾遗》载其能“治小儿风疹。

花有五色,白者疗痢疾、去邪气、阴干未食之。

”;《纲目》记载蜀葵“治带下,目中溜火,和血润燥,通窍、利大小肠。

”[1]

。

蜀葵亦为维吾尔族、白族、蒙古族、纳西族等少数民族常见民特中草药[2,3]

具有镇静安神、止咳平喘、发汗透疹、调经、利尿等功效,是一种开发潜力极大的“功能型色素”资源。

新疆日照长、光照强,在此条件下,蜀葵生长迅速、花期较长、花多而艳丽、色素含量较高。

文中笔者对该色素的提取纯化工艺及稳定性进行了比较系统的研究,以期开拓出新的天然色素产品。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验材料:

锦葵科植物蜀葵（AlthaearoseaL.Cavan.的

紫红色花瓣,采自新疆哈密,花序艳丽时采摘,自然阴干。

1.1.2　主要仪器:

722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器

厂;PHS—3C数字酸度计（杭州万达仪器仪表厂;800型离心

机（上海市手术器械厂;DK-S24电热恒温水浴锅（上海森信

实验仪器厂;ZK-82A电热真空干燥箱（上海市实验仪器

厂;RE—52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂;SHB—Ⅲ型

循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司。

1.2　方法1.2.1　蜀葵花紫红色素的最佳提取条件及提取工艺流程采用正交法设计实验组合,按正交表L16（44[4]

对提取温度（25℃、45℃、65℃、85℃、提取时间（1h、2h、3h、4h和物料配

比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25等三个因子,每个因子四个水平进行试验,最终确定蜀葵花紫红色素的最佳提取条件。

提取工艺流程:

蜀葵紫色干花→除杂→称量→粉碎→按最佳提取条件以60%的酸化乙醇水溶液浸提三次→过滤→滤液合并→真空浓缩→干燥→色素粗品。

1.2.2　色素的分离与纯化硅胶柱层析法是目前比较广泛使用的一种分离与纯化色素的方法,效果较好。

本实验所用层析硅胶为青岛海洋化工厂产品。

采用湿法装柱,将浓缩的色素粗品均匀上柱,采用石油醚—氯仿—乙酸乙酯—丙酮—乙醇—乙醇:

甲醇（1∶9—甲醇—甲醇ν水（9∶1极性递增的梯度洗脱方式进行洗脱。

根据

色泽选择理想的洗脱液样品。

通过薄层层析判断样品纯度,

浓缩干燥得到纯化的色素样品。

1.2.3　色素的鉴定1.2.3.1　色素的溶解性试验:

取蒸馏水、甲醇、氯仿、丙酮、苯、冰乙酸、石油醚、乙酸乙酯、不同浓度的乙醇等溶剂各5ml分别加入适当浓度的色素样品,观察其溶解状况。

1.2.3.2　色素吸收光谱的测定:

用蒸馏水将色素样品稀释后,

在200～750nm范围内扫描,观察其色素水溶液的吸收光谱特性。

1.2.3.3　盐酸—镁粉反应:

取稀释10倍的色素液5ml,加入少许镁粉,振荡后再加几滴浓盐酸,观察颜色变化。

1.2.3.4　中性醋酸铅沉淀反应:

取稀释10倍的色素液5ml,逐滴加入新配制的饱和中性醋酸铅溶液,观察颜色变化。

1.2.3.5　三氯化铁显色反应:

取稀释10倍的色素液5ml,逐滴加入1%FeCl3溶液,振荡后观察颜色变化。

1.2.4　色素的稳定性[5-9]配制pH3.35的色素水溶液,分别测定光照、温度、pH值的不同引起最大吸收波长处的吸光度值的改变情况;另外测定不同浓度的氧化剂、还原剂、防腐剂、金属离子加入色素液

中导致的最大吸光度值的变化。

以此来判断各种因素对色素

稳定性