浅论JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响.docx

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浅论JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响

浅论JNK在惊厥持续状态幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响

【摘要】目的：

研究（JNK）在惊厥持续状态（SC）幼年大鼠海马中的表达及依达拉奉对其的影响。

方法：

雄性SD幼年大鼠120只分为正常对照组（NC组）、惊厥持续状态组（SC组）、依达拉奉组（EDA组）三大组;各大组均随机分为5组，分别于惊厥后4、12、24、48和72h处死。

采用氯化锂-匹鲁卡品法制作惊厥持续状态模型。

EDA组在大鼠造模前三天予EDA腹腔注射，每天注射一次，连续3d。

TUNEL法检测观察大鼠海马细胞凋亡情况;免疫组化法检测海马p-JNK蛋白表达动态变化;RT-PCR技术检测海马JNK1mRNA表达的动态变化。

结果：

SC组在惊厥12h后的各时间点海马CA1区TUNEL阳性细胞数均显着高于NC组（），而ED组TUNEL阳性细胞数均较SC组显着下降（P或P）。

幼年大鼠海马CA1区p-JNK蛋白在SC组表达显着增强，与NC组比较差异有显着性（P），在EDA组表达较SC组明显下降（P）。

SC组海马JNK1mRNA表达明显高于NC组（P），而在EDA组JNK1mRNA的表达较SC组显着降低（P）。

结论：

SC可诱导JNK的表达，促进SC后海马神经元凋亡;EDA预处理可以影响JNK的表达，减轻惊厥后海马神经元凋亡程度。

【关键词】惊厥;脑损伤;幼年大鼠;JNK;依达拉奉

　　Abstract:

Objective:

ToobservethechangeofJNKinthehippocampusofstatusconvulsiveratandtheregulationeffectofEDAonit.Methods:

OnehundredandtwentymaleJuvenileSprague-Dawley（SD）ratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup（NC），statusconvulsivusgroup（SC），andedaravonegroup（EDA）;andeverygroupwererandomlydividedintofivegroups，whichwouldbeexecutedat4h，12h，24h，48hand72hafterconvulsiondiscontinued.Statusconvulsivus（SC）wasinducedbyinjectingLithiumChlorideandPilocarpine.GroupEDAwereinjectedEDAbeforeconvulsion，andrepeatedlyeverydayfor3days.TheexpressionofapoptosiscellswereobservedwithTdT-mediateddUTPnickendlabeling（TUNEL），thechangesofp-JNKproteininthehippocampusCA1domainsweredetectedwithimmunohistochemistry（IHC），theexpressionofJNK1mRNAweredetectedwithRT-PCR.Results:

TheTUNELpositivecellsinhippocampusCA1ofSCgroupweremorethanthatofNCgroupat12haftertheSC（P）.Aftertheinterventionofedaravone，TUNELpositivecellsshowedasignificantdrop（P　orP）.Theexpressionofp-JNKproteininthehippocampusCA1domainsincreasedmarkedlyinSCgroup.ThedifferencewasstatisticalysignificancecomparedwithNCgroup（P），andEDAgroupwasmuchlowerthanSCgroup（P）.TheexpressionofJNK1mRNAinthehippocampusinSCGroupwasmuchhigherthanNCGroup（P），andEDAgroupwassignificantlylowerthanSCgroup（P）.Conclusion:

SCmaybeincreasetheexpressionofJNK，JNKmaybemediatedtocellapoptosis.EDAcaneffecttheexpressionofJNK，andlessenthepothologyofhippocampus.

　　Keywords:

convulsion;braininjury;juvenilerat;JNK;edaravone

　　惊厥是小儿时期较常见的急症。

当惊厥反复发作而未能很好控制时，可导致进行性脑损伤，并可造成认知损害[1]。

多种因素导致神经元坏死和细胞凋亡是惊厥性脑损伤的基本原因。

JNK（C-JunN端激酶）是凋亡途径中重要的信号分子，已有部分学者对其参与神经元凋亡的情况做了研究。

然而在惊厥持续状态（statusconvulsive，SC）后的表达情况目前尚未见相关报道。

依达拉奉（edaravone，EDA）对低氧缺血性脑病的神经元保护作用已得到证实，但其对于SC后JNK的表达及神经元凋亡的影响情况，国内外尚未见报道。

本实验通过建立氯化锂-匹鲁卡品SC大鼠模型，观察幼年大鼠海马p-JNK蛋白及JNK1mRNA表达的变化，及依达拉奉对SC后海马JNK表达及神经元凋亡情况的影响，初步探讨JNK与惊厥性脑损伤的关系及依达拉奉在SC幼鼠中可能的神经元保护机制。

　　1材料和方法

　　实验动物和试剂清洁级健康幼年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自中国科学院上海分院试验动物中心）120只，体重50～70g。

氯化锂、匹罗卡品购自美国Fluka公司，细胞凋亡检测试剂盒购自美国罗氏公司。

鼠抗p-JNK单克隆抗体购自美国Stancru公司。

M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，依达拉奉由南京先声东元制药有限公司资助。

　　实验分组和SC动物模型的建立随机将SD大鼠分为正常对照组（NC组）、惊厥持续状态组（SC组）、依达拉奉组（EDA组）三大组，每组40只大鼠;各大组再随机分为5小组，分别于惊厥后4、12、24、48和72h处死。

若因模型不成功、死亡造成各亚组样本量不足8只的，按随机原则补足。

采用氯化锂-匹鲁卡品法制作SC模型。

SC模型制作参照胡越等方法。

惊厥按Racine分级标准分为V级，惊厥发作达到IV-V级，持续时间至少30min，惊厥解除后状态良好的大鼠为合格SC大鼠模型。

NC组：

不作任何处理。

EDA组：

造模前3d予EDA3mg/kg腹腔注射，每天注射一次，连续3d，其余用药同SC组。

　　动物标本的制备大鼠分别于惊厥后各时间点处死。

经10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔麻醉后，断头剥离颅骨，完整取出脑组织置于冰盘上，分离右侧海马脑组织，放入去RNA酶的EP管中，迅速置于液氮中保存。

左侧大脑在垂直视交叉处离断，并冠状位向后切取约5mm，放入预冷的4%多聚甲醛固定12h，入70%乙醇，送病理科进行石蜡包埋;石蜡包埋后制片，切片厚度为5μm。

　　实验方法

　　TUNEL检测凋亡细胞：

具体操作步骤参照试剂盒说明书。

二氨基联苯胺（DAB）显色，中性树脂封片。

结果判定：

细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞;光镜下每组各选阳性细胞最集中的5个高倍视野，计算出每个高倍视野的阳性细胞数，取其平均值。

　　免疫组织化学检测p-JNK蛋白表达：

石蜡切片融蜡水化后，用EDTA进行抗原修复，滴加50μL鼠抗p-JNK抗体（1:

100）4℃过夜后滴加二抗，DAB显色，中性树脂封片。

显微镜下观察，阳性细胞为胞核中出现棕黄色。

每张切片随机选择5个镜下视野（×200），应用image-proplus图像分析软件测定阳性部位的平均光密度（opticaldensity，OD），以代表阳性部位的蛋白表达水平。

　　RT-PCR技术检测JNK1mRNA表达：

①引物设计和合成。

检索GenBank数据库中ratJNK1、GAPDH的mRNA序列，利用primerpremier软件设计引物，然后经过Blast匹对，由上海生工生物工程有限公司合成，用前法稀释成10pmol/μL，引物序列及预期PCR产物长度如下（见表1）。

②总RNA的提取。

采用Trizol一步法抽提海马总RNA提取，一切操作步骤均按Trizol试剂盒说明书进行。

③cDNA的合成。

应用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，一切步骤均按说明书进行。

④PCR。

采用单基因扩增法，配制20μLPCR反应体系，然后经PCR扩增，PCR扩增条件：

94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，34个循环，最后经72℃延长8min。

以GAPDH为内参照。

⑤图像分析。

产物在%琼脂糖凝胶电泳后，用FR-980生物电泳图像分析系统获取凝胶图像，观察分析JNK1mRNA的转录情况，测定PCR产物电泳条带扫描灰度值。

以GAPDH作为内参照进行半定量分析比较，以其比值进行统计学分析。

　　统计学处理方法多组比较采用单因素方差分析，均数的两两比较采用LSD-t检验，两变量的相关采用直线相关分析法分析。

　　2结果

　　各组大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞表达结果（见图1）TUNEL结果显示，TUNEL阳性细胞主要在神经元及神经胶质细胞，胞核中出现棕黄色颗粒，形成典型的“指环状”或“半月状”的细胞凋亡特征。

SC组海马CA1区TUNEL阳性细胞于惊厥后4h已有少量表达，48h达高峰，之后有下降趋势;其24、48、72h三个时间点均明显高于NC组（P）。

EDA组24、48和72h时间点TUNEL阳性细胞表达水平较SC组均明显降低（P）;但仍高于NC组（P）（见表2）。

　　大鼠海马p-JNK蛋白免疫组化结果（见图2）免疫组化结果显示，NC组p-JNK蛋白在神经元和神经胶质细胞的胞核少量表达。

SC后4h海马CA1区p-JNK蛋白表达即开始增加，48h达高峰，72h下降。

而EDA组惊厥后各时间点海马p-JNK蛋白表达水平较SC组降低，以24和48h时间点为着（P）（见表3）。

　　各组大鼠海马JNK1mRNA的表达（见图3）RT-PCR方法检测到NC组大鼠海马JNK1mRNA少量表达。

SC组JNK1mRNA的表达于惊厥后4h开始增加，48h达高峰，72h下降。

而EDA组惊厥后24和48h时间点海马JNK1mRNA表达水平较SC组均明显降低（P）（见表4）。

　　相关性分析大鼠海马CA1区TUNEL阳性细胞与CA1区p-JNK蛋白表达呈正相关（γ=，n=80，）。

海马CA1区TUNEL阳性细胞与JNK1mRNA表达正相关（γ=，n=80，）。

　　3讨论

　　在人类颞叶癫痫患者以及电点燃或化学点燃、局部或系统给予致痫剂等各种癫痫模型