实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程.docx

实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程.docx

《实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实时荧光定量PCR 检测病毒核酸方法学性能验证程.docx（8页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

实时荧光定量PCR检测病毒核酸方法学性能验证程

实时荧光定量PCR检测病毒核酸方法学性能验证程序的探讨

蒋玲丽　王雪亮　王华梁　肖艳群★

[摘　要]　目的　探讨实时荧光定量聚合酶链反应（PCR检测病毒核酸的方法学性能验证程序。

　方法　参考美国国家临床实验室标准化协会（CLSI颁布的相关文件对实验室开展PCR检测病毒核酸进行方法学性能验证;通过稀释标本直至低于检测下限进行定量检出限验证实验。

　结果　乙型肝炎病毒核酸（HBV-DNA检测的批内精密度（CV批内分别为4.28%和2.08%;总精密度（CV总为4.14%和2.69%;与比对方法回归方程为y=1.1082x-0.5225;线性相关系数为0.9976,回归方程为y=0.9771x-0.0062,线性范围为1.08E3~1.05E8;定量检出限为500IU/mL。

丙型肝炎病毒核酸（HCV-RNA检测的CV批内分别为4.11%和2.63%;CV总为5.15%和3.41%;与比对方法回归方程为y=1.0075x-0.0662;线性相关系数为0.9974,回归方程为y=1.0479x-0.2594,线性范围为1.50E3~2.53E7;定量检出限为1000IU/mL。

　结论　实验室开展PCR检测项目前有必要进行方法学验证,根据实际情况选择实验方案和统计方法可减少人力和财力。

[关键词]　精密度;正确度;性能验证

Discussionoftheperformanceverificationproceduresofthereal-timequantitativepolymerasechainreactionfordeterminationofvirusnucleicacid

JIANGLingli,WANGXueliang,WANGHualiang,XIAOYanqun★（ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China

[ABSTRACT]　Objective　Todiscussthereasonableperformanceverificationproceduresofreal-timequantitativefluorescentpolymerasechainreactionfordeterminationofvirusnucleicacid.　Methods　TheperformanceverificationprocedureswereappliedaccordingtotherelateddocumentspublishedbyClinicalandLaboratoryStandardsInstitute（CLSI.Thelimitsofquantificationwereverifiedbydilutingthesamplestowhichcannotbetested.　Results　Thewithin-runcoefficientofvariation（CVofHBV-DNAwere4.28%and2.08%,thetotalCVwere4.14%and2.69%andtheregressionequationwasy=1.1082x-0.5225;thecorrelationoflinearitywas0.9976,theregressionequationwasy=0.9771x-0.0062,thelinearityrangewas1.05E3~1.05E8andthelimitofquantitationwas500IU/mL.Thewithin-runCVofHCV-RNAwere4.11%and2.63%,thetotal

CVwere5.15%and3.41%,theregressionequationwasy=1.0075x-0.0662;thecorrelationoflinearitywas0.9974,theregressionequationwasy=1.0479x-0.2594,thelinearityrangewas1.50E3~2.53E7andthelimitofquantitationwas1000IU/mL.　Conclusion　Itisnecessarytoruntheperformanceverificationproceduresbeforeusingnewtestsinclinicallaboratory.TheperformanceverificationproceduresofquantitativePCRfortestingnucleicvirusandthestatisticsmethodsareselectedonthebasisofpracticalsituations.

[KEYWORDS]　Precision;Correctness;Performanceverification

作者单位:

上海市临床检验中心,上海200126★

通讯作者:

肖艳群,E-mail:

xiaoyanqun@

检测系统或方法学的分析性能评价是临床检验质量管理的重要内容。

根据美国《临床实验室改进法案修正案》（ClinicalLaboratoryImprovement

Amendment88,CLIA'88规定,美国病理家学会（CollegeofAmericanPathologists,CAP认可的实验室在开展某一检测项目前需提供并保留相关的方法

•论著•

学验证实验数据[1]。

《医学实验室质量和能力认可准则》（ISO15189∶2007指出实验室应评估工作所选用的方法和程序[2]。

ISO15189是国际医学界普遍承认并遵照执行的关于医学实验室质量和能力方面要求的国际标准,其技术要素5.3.2中指出应确定设备（在安装时及常规使用中能够达到所要求的性能标准。

毕波等[3]指出不同的检测项目和检测系统需选择不同的方法学验证程序。

PCR定量检测病毒核酸实验程序繁琐,涉及手工操作步骤多,并且由于其检测成本高及某些特殊项目的阳性标本稀缺,其方法学验证程序和统计方法常困扰检验人员。

笔者于本实验室对定量PCR检测HBV-DNA和HCV-RNA的方法学验证过程进行探讨。

1　材料与方法1.1　材料1.1.1　标本来源

HBV-DNA标本来自上海东方医院,HCV-RNA标本来自上海仁济医院东院。

所有标本在分离血清后当天收集并于-20℃保存备用。

1.1.2　仪器

RocheLightcyclerII荧光定量检测仪、HB-100型恒温金属浴、Biofuge-FrescO高速冷冻离心机。

1.1.3　试剂

HBV-DNA、HCV-RNA均为上海科华生物工程股份有限公司生产,批号分别为20111212和20111210。

2　方法

2.1　精密度评价

参照EP15-A文件[4]。

每天分析1个批次,2个浓度样本,每个样本重复测定4次,连续检测5天。

HBV-DNA样本为高低两个浓度质控品;HCV-RNA低浓度样本为质控品,高浓度样本为临床收集标本。

质控品均为本中心产品,批号为1101。

参照文献[5]

计算批内精密度（CV批内和总精密度（CV总2.2　正确度评价

采用EP9-A2文件[6]。

从已通过临床基因扩增检验实验室技术验收的实验室中收集临床标本各40例,标本浓度尽量涵盖线性范围。

收集后的标本在一周内集中检测,每个标本重复检测2次。

取均值与医院检测系统结果进行比对。

计算两者线性相关系数

（R,并进一步计算两个项目各自的回归曲线。

根据Westgard[7]提出的计算方法,

分别计算当检测值log10=3、4、5、6、7时的允许总误差（totalerror,TE。

计算TE=偏倚（Bias+3CV（这里的CV采用精密度性能评估中两个浓度的精密度均值,与目标TE比较（目标TE为厂商允许的总误差10%,TE<10%表示可接受。

2.3　线性范围验证

参照EP6-A文件[8]。

取临床高浓度标本,用HBV-DNA和HCV-RNA为阴性的标本进行系列梯度稀释（1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000、1∶1000000至100IU/mL（比厂方声明的线性范围低一个数量级,每个浓度标本检测3次,计算线性相关系数和线性范围。

2.4　定量检测下限验证

取临床标本,进行系列梯度稀释,稀释至低于试剂说明书声明的检测下限。

每个稀释标本重复检测10次。

2.5　质控

每次实验均做室内质控。

当质控结果在控时,实验数据才能采用;否则,应重新进行检测。

2.6　统计方法

所有统计均将初始浓度值QDNA进行对数转化为LGQ后计算[9]。

使用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。

一致性检验采用配对t检验。

3　结果

3.1　精密度性能验证结果见表1。

HBV-DNA1HBV-DNA2HCV-RNA1HCV-RNA2

x

4.816.804.69

5.93S批内

0.210.140.190.16CV批内（%

4.282.084.112.63S总

0.200.180.240.20CV总（%

4.142.69

5.153.41

厂商声明CV总（%

1010

表1　HBV-DNA和HCV-RNA精密度评估结果

Table1　TheevaluatingimprecisionresultsofHBV-DNAandHCV-RNA

3.2　正确度性能评价结果

3.2.1　HBV-DNA和HCV-RNA检测结果与比较系统相关性结果分析见表2。

计算相关系数R值,两个项目的相关系数均小于厂商允许的0.97。

进一步做一致性t检验,P均>0.05,表明两个项目与比较系统的检测结果无显著性差异。

3.2.2　计算HBV-DNA和HCV-RNA两个项目与比较系统的回归曲线,结果见图1。

3.2.3　并计算理论值在3、4、5、6、7时的TE与目标TE比较。

计算TE的结果见表3。

3.3　线性范围验证结果见图2。

3.4　定量检出限验证结果见表4。

HBV-DNAHCV-RNAR值

0.96850.9564厂商声明（与标准品

0.970.97一致性检验

P=0.3104

P=0.6379

表2　与比较系统相关性评价结果

Table2　Thecorrelationresultsbetweentestingmethodsand

comparativemethods理论值（log10=

计算TE=Bias+3CV

计算TE=Bias+3CV

313.44%10.02%49.08%9.46%56.47%9.13%64.73%8.91%7

3.48%

8.76%

表3　TE的计算结果

Table3　TheresultsofcalculatingTE

与目标TE（10%比较,<10%为可接受。

n=10HBV-DNA

（500IU/mLHBV-DNA（50IU/mL

HCV-RNA（1000IU/mLHCV-RNA（500IU/mL

x2.653.47S批内0.115个未检出0.387个未检出CV批内（%4.00%

11%

厂商声明500IU/mL500IU/mL结论

500IU/mL

1000IU/mL

表4　定量检出限结果

Table4　Theresultsofthelimitsofquantitation

图1　HBV-DNA和HCV-RNA的回归方程

Figure1　TheregressionequationofHBV-DNAandHCV-RNA

（a

（b

a图为HBV-DNA的线性评价结果,y=0.9771x-0.0062,R=0.9975,线性范围为1.08E3-1.05E8;

b图为HCV-RNA的线性评价结果,y=1.0479x-0.2594,R=0.9974,线性范围为1.50E3-2.53E7。

图2　HBV-DNA和HCV-RNA的线性结果

Figure2　ThelinearityresultsofHBV-DNAandHCV-RNA

（a

（b

4　讨论

PCR方法在临床分子诊断中展现出巨大的应用价值,但临床实验室必须充分了解其方法性能及采取相应质控措施,才能确保实验结果的准确。

临床基因扩增检验是我国临床检验技术中目前唯一一个需要审核准入的技术。

ISO15189和CAP认可要求中规定在开展某一检测项目前需进行方法学验证。

由此可见,方法学性能验证是临床实验室开展PCR项目前必须进行的工作。

许多学者对检测系统的性能评价做过研究,大多集中在精密度、准确度、灵敏度、特异度和多系统比较等性能参数[10~12]。

PCR检测项目不同于其它专业的检测项目,其试剂成本高、检测过程繁琐、涉及大量的手工操作、某些特殊项目的阳性标本稀缺,对临床检测实验室来说方法学验证需要花费更大的人力财力。

因此,本文通过对大多数实验室都开展的HBV-DNA和HCV-RNA检测的方法学性能验证程序和统计方法的探讨,为PCR检测项目的方法学验证提供设计方案,使其既能满足实验室检测质量的要求,又能减少人力和财力。

首先,在应用实验数据进行统计时,应明确要将初始浓度值QDNA对数转化为LGQ后进行统计。

我们同时用原始浓度值和由原始浓度值QDNA对数转化得来的LGQ后进行精密度和正确度计算,两者计算值不同,这也与文献[9]报道一致。

本实验参照EP-15A2[4]。

采用两个浓度水平样品,对HBV-DNA和HCV-RNA两个项目进行厂家精密度验证。

根据文献[5]计算得出,HBV-DNA的CV

批内

分别为4.28%和2.08%,CV总为4.14%和2.69%;HCV-RNA的CV批内分别为4.11%和2.63%,CV总为5.15%和3.41%。

低于厂家声明的允许总误差10%,其精密度性能可接受。

正确度性能是检测系统或方法重要的分析性能之一。

定量PCR检测项目是新近快速发展的分子生物学检测项目,在CLIA'88要求中没有相应的TE规定,缺少通用的国际标准。

同时,由于目前病毒核酸定量检测没有标准方法和参考方法,对临床实验室来说,如何选择比对系统就成为难题。

本实验结果与通过PCR技术审核的实验室的结果进行比较。

由于医院提供的为患者标本,只有一次检测结果,因此实验方法也只检测一次,同时我们未按EP-15A2的评估方案要求收集20例标本,而是扩大收集的标本数为40例。

从表2可以看出,两个项目得出的R值均小于厂方声明的0.97,进一步做配对t检验统计,其P值均>0.05,实验方法与比对方法之间的检测结果没有统计学差异。

根据Westgard[7]提出的方法进一步通过回归曲线计算,同时将理论值为3~7的值代入后计算总误差。

从表3可以看出,除了理论值为3时两个项目的允许总误差超过了厂方声明的10%的指标外,其余均在10%以内。

因为厂方声明的允许总误差给出的是一个平均值,并未告知具体的浓度水平,且低浓度标本的允许误差本身就大于高浓度水平,所以,当理论浓度为3时两个项目的允许误差分别为13.44%和10.02%,仍被认为可以接受。

用于线性范围验证的样本应覆盖检测系统的整个范围。

从图2可以看出,两个检测项目的线性符合厂家声明。

但也有文献指出,对于多点校准的检测项目,一般不需要进行分析测量范围来评价实验[13]。

对于新开展的检测系统含有多点校准时是否需要线性范围的方法学验证仍有待探讨。

定量检出限是指能可靠检出分析物的最低实际浓度,其验证对于PCR检测项目非常重要。

EP-17A文件指出,验证厂家声明的定量检出限至少需25个重复测量,每个样品的重复检测结果与该样品的参考值和误差目标进行比较,超过该误差目标的结果数是该水平方法是否合适的度量。

由于许多PCR检测项目缺乏相应的参考物质,即使有,价格也非常昂贵,在实际工作中,这个验证方案难以实施。

我们在进行定量检出限验证时采用临床标本,在基于精密度、正确度和线性范围验证实验接受的情况下,对4~5浓度的标本进行稀释至有低于检测下限的结果出现,以全部大于检出限且CV在或接近厂方允许的范围时的浓度为可接受的定量检出限。

在我们的实验中,HBV-DNA项目在500IU/mL时全部检出,并且CV为4%,因此认为其定量检出限和厂家声明一致;而HCV-RNA项目在500IU/mL时有7个低于检测下限,在1000IU/mL时则全部检出,并且CV为11%,故认为HCV-RNA的定量检出限与厂家声明的500IU/mL不一致,应为1000IU/mL。

综上所述,根据分子生物学专业的特点,在开展PCR检测项目前,需对精密度、正确度、线性范围、定量检出限等方法学性能进行验证,使用初始浓度值QDNA转化为对数LGQ进行统计,同时可根据检测项目的类别、是否有参考物质等实际情况选择验证方案

和统计方法,即能满足实验室检测质量的要求,又能减少人力和财力。

参考文献

[1]DepartmentofHealthandHumanService,Centersfor

Medicare&MedicaidServices.Clinicallaboratoryimprovementamendmentsof1988:

finalrule[S].FedRegister,2003:

3704.

[2]CNAS-CL02,医学实验室质量和能力认可准则（ISO15189

[S].2007:

22.

[3]毕波,吕元.定量检测方法学性能验证的系统设计[J].中华

检验医学杂志,2007,30（2:

9-11.

[4]Clinicalandlaboratorystandardsinstitute.Userverification

ofperformanceforprecisionandtrueness:

approvedguideline-secondedition[S].EP15-A2,CLSI,2005.

[5]王薇,王治国,李少男.临床实验室对厂家声明的精密

度和真实度的性能验证要求[J].检验医学,2010,25（12:

1001-1005.

[6]NCCLSEP9-A2.Methodcomparisonandbiasestimation

usingpatientsamples;approvedguideline-secondedition[S].

Wayne,PA:

NCCLS,2002.

[7]WestgardJO,BarryPL,QuamEF.Basicmethodvalidation

3rdeditionP:

traininginanalyticalqualitymanagementforhealthcarelaboratories[M].WestgardQualityCorporation.

1999:

131.

[8]NCCLS.Evaluationofthelinearityofquantitativemeasurement

procedures:

Astatisticalapproach.ApprovedguidelineNCCLSdocumentEP6-A[S].Wayne,Pa:

NCCLS,2003.

[9]余男,甘明,詹希美,等.乙型肝炎病毒核酸定量检测中不

确定度的研究[J].热带医学杂志,2007,7（4:

310-314.[10]ZacherBJ,MoriconiF,BowdenS,etal.Multicenter

evaluationoftheelecsyshepatitisBsurfaceantigenquantitativeassay[J].ClinVaccineImmunol,2011,18（11:

1943-1950.

[11]LouisirirotchanakulS,KhupulsupK,AkraekthalinS,etal.

ComparisonofthetechnicalandclinicalperformanceoftheElecsysHBsAgIIassaywiththeArchitect,AxSym,andAdviaCentaurHBsAgscreeningassays[J].Medvirol,2010,82（5:

755-762.

[12]PetersonLR,LiesenfeldO,WoodsCW.Multicenterevaluation

oftheLightCyclermethicillin-resistantStaphylococcusaureus（MRSAadvancedtestasarapidmethodfordetectionofMRSAinnasalsurveillanceswabs[J].JClinMicrobiol,2010,48（5:

1661-1666.

[13]杨有业,张秀明.临床检验方法学评价[M].北京:

人民卫

生出版社,2008:

168.