链霉菌实验操作.docx
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链霉菌实验操作
链霉菌菌种保藏
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2009-8-2814:
22:
18来源：
食品科技网
链霉菌菌种（非bld菌株）都是采用低温甘油保藏，即从长满链霉菌孢子的固体平板上用无菌棉签刮下孢子，直接悬浮于装有一定量体积20%甘油的菌种管中并剧烈振荡分散后，于-20℃保存。
bld菌株将液体培养基YEME（含10.3%或34%蔗糖）摇36-48小时后的菌丝体，离心，10.3%的蔗糖洗涤3次后，直接-20℃保存。
检测链霉菌淀粉酶的活性
将在MS培养基上生长2天后的菌苔用tip头尾部打上眼，然后接种到淀粉酶检测培养基上。
生长5天。
用碘液显色。
非常简单。
培养基：
水1升，可溶性淀粉20克，青岛琼脂20克，蛋白胨5克，NaCl5克，吹干
碘液：
碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300ml，先将KI溶于少量水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，加热助溶，加蒸馏水定容。
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链霉菌实验操作1
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2009-8-2816:
09:
31来源：
食品科技网
一、培养基、抗生素、生长因子
常用抗生素及其使用浓度
抗生素
英文名称及缩写
抗性基因
贮藏液浓度（mg/ml）
使用终浓度（μg/ml）
链霉菌
大肠杆菌
MM
2CM
YEME
LA或LB
氨苄青霉素
氯霉素
潮霉素
卡那霉素
壮观霉素
链霉素
硫链丝菌素
红霉素
阿泊拉霉素
Ampicillin,Amp Chloramphenicol,Cml
Hygromycin,Hyg
Kanamycin,Km
Spectinomycin,Spc
Streptomycin,Str
Thiostrepton,Thio
Erythomycin,Ery
Apramycin,Am
bla
cat
hyg
aac或aph
aadA
str
tsr
ermE
aac（3）IV
100
25（无水乙醇配）
50
25
50
50
25（DMSO配）
100
50
R
10
10
2?
50
10
5
100
10
R
－
25
50
50
25
10
－
50
R
－
－
－
50
－
2.5
－
50
50-100
25
50
50
50
25
不敏感
20
30-50
*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制
*此表仅供参考！
！
！
*R表示不敏感
*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,Vio
LB（Luria-Bertani）培养基
胰蛋白胨10g，
酵母抽提物5g，
NaCl5g，葡萄糖1g，
蒸馏水加至1000ml，
pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）
LA
LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉（不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%）。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：
L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO4 0.5g,
MgSO4·7H2O 0.2g,
FeSO4·7H2O 0.01g,
蒸馏水至1000ml
将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有labagar、Iceagar（IA）
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用
蔗糖 103g
K2SO4 0.25g
MgCl2·6H2O 10.12g
葡萄糖 10g
Difco酪蛋白氨基酸 0.1g
微量元素溶液 2ml
Oxoid酵母提取物 5g
TES 5.73g
加蒸馏水至 1000ml
称取5.5gDifco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。
使用时，将培养基融化，每瓶中加入：
KH2PO4（0.5%） 2.5ml
CaCl2·2H2O（5M） 1ml
L-脯氨酸（20%） 3.75ml
NaOH（1M）调pH至7.3
对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）
YEME（酵母膏-麦芽膏培养基）1L（液体培养链霉菌）
Oxoid酵母提取物 3g
Oxoid蛋白胨Tryptone 5g
麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630） 3g
葡萄糖 10g
蔗糖＊ 340g
蒸馏水 至1000ml
高压灭菌后加入：
（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。
）
MgCl2·6H2O（2.5M） 2ml/L
制备原生质体时，还要加入：
甘氨酸（20%） ＊ 25ml/L
＊ 蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊ 甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
TSBY（1L）（液体培养链霉菌）
Oxoid胰胨豆汤粉（TSB） 30g
蔗糖＊ 340g
Oxoid酵母抽提物 5g
蒸馏水 至1000ml
*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
MS培养基
将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g琼脂，5g甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）
可溶性淀粉 10g
胰蛋白胨 2g
NaCl 1g
（NH4）2SO4 2g
K2HPO4 1g
CaCO3 2g
无机盐溶液* 1ml
琼脂 20g
蒸镏水 1000ml
PH7.2
无机盐溶液（每升）
FeSO4.7H2O 1g
MgCl.6H2O 1g
ZnSO4.7H2O 1g
YMS培养基（阿维，井岗产孢）
酵母抽提物 4g
可溶性淀粉 4g
麦芽糖 10g
CoCl..6H2O 5mg
琼脂 20g
蒸镏水 1000ml
PH7.2
YD培养基
酵母抽提物 4g
麦芽糖 10g
葡萄糖 4g
MgCl 2g
CaCl 1.5g
琼脂 15g
蒸镏水 1000ml
PH7.2
生长因子补充物的使用浓度
天蓝色链霉菌1258、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表
生长因子补充物的使用浓度表
化合物
储存液（mg/ml）1
终作用浓度（μg/ml）
组氨酸（Histidine）
10
50
其它氨基酸2
7.5
37
腺嘌呤，鸟嘌呤，
胸腺嘧啶，尿嘧啶
1.5
7.5
维生素
0.1
0.5
1. 储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4oC保存。
2. 对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。
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大肠杆菌质粒的抽提
苯酚/氯仿溶液抽提法
1. 接种5mlLB，37℃摇床过夜培养（12小时）
2. 离心，3000rpm，5min去上清
3. 振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I（50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl（PH8.0）, 10mmol/LEDTA（PH8.0）在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4. 加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH,1%SDS,用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5. 加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。
6. 用120ul氯仿重复操作5。
7. 加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8. 沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
氯化锂抽提法
1. 前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用SolutionIIIIII处理）
2. 加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。
去上清，尽量去干净。
3. 用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4. 12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。
5. 将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
酶连反应
一般采用10μl反应体系：
T4连接酶1μl，连接酶缓冲液1μl，外源片段与载体按DNA摩尔含量3:
1加入即可。
如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA摩尔含量为3:
1或外源更多。
DNA片段凝胶回收
1试剂盒回收（离心法）（详见说明书）
（1） 在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积（如1oomg=1ooul）
（2） 根据凝胶的浓度,加DE-A液
凝胶浓度 DE-A溶液体积
≤1.0% 3个凝胶体积
≤1.5% 4个凝胶体积
≤2.0% 5个凝胶体积
混匀后于75oC加热,（低熔点琼脂糖凝胶于45oC加热）,间断混合,直到凝胶熔化（6-8分钟）.
（3） 加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀（是否需调整PH值,见注意事项1）;当分离的DNA片段小与400bp时,加入异丙醇至终浓度为20%;
（4） 吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;
（5） 将制备管置回离心管,加0.5mlW1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;
（6） 将制备管置回离心管,加0.7mlW2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次;（W2中含有酒精，应保证瓶子密封。
）
（7） 将制备管置回离心管,最高速度离心1分钟;
（8） 将制备管置洁净的1.5ml离心管中,在DNA制备膜正中央加25ul水或洗脱液,室温静置1分钟.最高速度离心1分钟洗脱DNA.
注意事项;
1. 此法适合从TAE或TBE琼脂糖凝胶中回收DNA,用其他缓冲液时,加DE-B溶液后,溶液的PH要调整到6.5以下.
2. 勿将DNA长时间暴露在高温下,线型DNA于高温条件下易水解.勿将凝胶长时间暴露在紫外灯,减少紫外灯对DNA的损伤.
3. 2步骤中的凝胶必须完全熔化,否则将严重影响DNA的回收效率.
4. 步骤4中吸回滤液到DNA制备管中再吸附一次,可提高回收效率.将洗脱液或水加热到60゜C,可提高回收效率。
（重要）
5. DNA分子呈酸性,建议在洗脱液中保存。
（试剂盒中提供的洗脱液好像对PCR有某种抑制作用。
）
2 silica回收
1在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量;
2. 加入2-3倍体积的6MKI或NaI（避光4度保存）;
1. 65oC温浴,间断混合,直到凝胶熔化;
2. 加适量的振匀的silica悬液（10ul）充分混匀,冰上放置15分钟（或更长）,间断混合;
3. 5000rpm离心3分钟,弃上清;
4. 加1ml预冷的NEWbuffer（先用100ul打散沉淀，再用900ul混匀），冰上洗盐2分钟，间断混合;
5. 12000rpm离心10s,弃上清;
6. 重复6,7步骤1次;
7. 于50oC烘箱烘干;
8. 加10ul的去离子水用枪头打匀,65oC水浴15分钟,间断混匀;
9. 12000rpm离心10s，把上清转移到另外洁净的离心管中;
10. 跑胶检测回收效率.
注意事项
＊4----8步均在冰上操作，防止解吸附，silica只在低温下对DNA有吸附作用。
＊NEWBuffer：
（100ml）
1ml5MNacl,1ml1MpH7.5This-HCl,0.5ml0.5MEDTA,50ml100%ETOH,去离子水加至100ml。
（-20度保存）
＊Silica配法见：
TIGJanuary1995Vol.11No.1.AninexpensivealternativetoglassmilkforDNApurifyication.
DNA纯化
用苯酚:
氯仿抽提
1. 把样品至置于离心管中,加入等体积的苯酚:
氯仿,
2. 混匀,使之成为乳浊状;
3. 12000rpm离心,5分钟:
4. 用枪头把水相移到另一离心管中.
5. 加入等体积氯仿并重复2—4
6. 用2/3体积的异丙醇（或2倍无水乙醇）,1/10体积的3M醋酸钠,沉淀10分钟（-20度长时间沉淀可提高产量）
7. 12000rpm离心5分钟,弃液体
8. 70%的乙醇洗盐10分钟，去上清，
9. 重复8一次，再12000rpm离心弃液体.
10. 50度烘干.
11. 去离子水溶解。
LiCl抽提
1把样品至置于离心管中,加4/5体积10MLiCl
2室温下静置1分钟
312000rpm离心5分钟
4把液体转移到另一离心管中
5.加2/3体积的异丙醇沉淀10分钟
往下的步骤同于上面的8-12
E.coil总DNA的提取
1 将过夜培养的大肠杆菌离心去上清。
2 加500μl水重悬浮，加入500μl2%SDS,混合振荡约1min，55℃温育15min，直到溶液的粘度显著下降。
3 加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠（自然pH）。
4 加入150μl中性苯酚，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止，
6 加入1倍体积的异丙醇（或2倍体积的无水乙醇），上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团，用吸头挑出DNA沉淀团。
7 用70%乙醇洗涤DNA沉淀团两次。
8 烘干，溶解DNA沉淀。
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进）
1 将适量的菌体悬浮于500μl溶菌酶溶液（2％）中，37℃温育1hr左右至完全溶菌，
2 加入500μl碱性SDS溶液（0.3mol/LNaOH,2%SDS），立即振荡混合完全，
3 打开管盖，在70℃放置15min（对大于20kb的质粒则最好放在55℃,30min），然后于水浴中冷却至室温，
4 加入100μl酸性苯酚/氯仿溶液，用混合器振荡至液体彻底混合均匀，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。
5 用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见（或非常少）中间层为止。
6 在上清液中加入1/10体积的3MNaAc溶液和1倍体积的异丙醇沉淀5分钟（或2.2倍体积的无水乙醇沉淀1h），12000rpm离心8min，
7用70%乙醇洗涤沉淀两次,
8干燥后加一定量的TE（d2H2O）缓冲液溶解。
另：
可使用抽提总DNA的试剂盒，将总DNA与质粒DNA一起抽提。
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明）
注：
CIAP一般为原酶，酶量过大会失去粘性末端，因此应适当减小酶的用量，一般0.5ul即可。
也可减少温浴时间，如37℃,10~20min即可。
AT克隆（详见说明书）
所用的载体:
pGEM-T,pGEM-TEasyVetorSystem
1.酶连
（1） 体系 10ul
standardReation Positivecontrol Backgroundcontrol
2XRapidLigationBuffer,T4DNALigation 5ul 5ul 5ul
pGEM-T,pGEM-TEasyVetor（50ng） 1ul 1ul 1ul
PCRproduct Xul --- ---
ControlinsertDNA --- 2ul ---
T4DNALigase（3weissuntis/ul） 1ul
Deionizedwatertoafinalvolumeof 10ul 10ul 10ul
（2）.反应 4oC过夜
注 :
PCR产物和载体的摩尔比为:
（ngofvectorxkbsizeofinsert）/（kbsizeofvector）*（insert:
vectorration）=ngofinsert
一般外源和载体的摩尔比例为3:
1
T载体大小为3bkb 50ng
2. 转化
（1） 取大肠杆菌感受态细胞100ul,连接产物2-5ul加入1.5ml的离心管中,混匀.冰上放置20分钟.
（2） 42oC热激90秒.（不要摇动）
（3） 立即置冰上3-5分钟.
（4） 加1mlSOC培养基（室温）
（5） 37oC培养1.5小时（约150rpm摇动）.
（6） 离心,去上清,余下的混匀涂皿（LB/抗生素/IPTG/X-Gal）.
（7） 37oC培养16—24小时,挑白斑.
＊所用的培养基:
SOC培养基
胰蛋白胨 2g
酵母抽提物 0.5g
1M NaCl 1ml
1M KCl 0.25ml
2MMg2+储液 1ml
2M葡萄糖 1ml
*Mg2+储液
MgCl.6H2O 20.33g
MgSO4.7H2O 24.65g
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