开题考核表宁波大学海洋学院.docx
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开题考核表宁波大学海洋学院
研究生学位论文开题考核表
学科专业：
海洋生物学
姓名：
马晓欣
学号：
0911071144
研究方向：
精子发生过程中相关功能基因的研究
导师姓名：
竺俊全
入学年月：
2009年9月
填表日期：
2010年9月30日
填表说明
一、本表需用Word文档电脑输入，并用A4纸打印。
本表需一式二份，一份交导师，一份交所在学院研究生办公室。
二、研究生应如实填写相关内容，对弄虚作假者，一经发现即取消其开题考核资格。
三、按照开题考核表中规定的撰写提纲撰写开题报告，附在开题考核表后。
四、根据学位点要求撰写文献综述，含主要参考文献、资料目录，附在开题考核表后。
一、课程学习（可按实际数量增删此表）
类别
课程编号
课程名称
学分
成绩
有无补考
学位课
07G02002A
科学社会主义理论与实践
2
82
无
07G02003A
自然辩证法概论
2
84
无
07G06010A
第一外国语（英语）1
2
免修
无
07G06020A
第一外国语（英语）2
2
免修
无
07G13101B
分子生物学
2
83
无
07G13102B
高级生物化学
2
75
无
07G13103B
海洋生物学
2
80
无
07G13104A
实验生态学
2
89
无
07G13105A
生物显微与亚显微技术
2
89
无
非学位课
07G00302A
高级学术交流英语1
1
90
无
07G00302B
高级学术交流英语2
1
79
无
07G13106A
重要仪器性能与分析
4
82
无
07G13304A
发育生物学
2
85
无
07G13307B
细胞生物学
2
86
无
07G13313A
生物信息学
3
81
无
07G13801A
开题报告
1
07G13802A
文献阅读（含专业英语）
2
07G13803A
学术交流活动（学术研讨与学术报告）
1
07G13804A
社会实践（含教学实践）
1
学院审核意见
1、是否完成个人培养计划规定的课程学习：
2、有无补考课程及门数：
3、学科综合考试通过情况（限博士生）：
研究生秘书签字：
年月日
二、个人总结及开题报告
个人总结（简述自入学以来的个人政治思想、学习、身心健康状态等情况）：
本人自进入宁波大学以来，在各方面都严格要求自己，积极努力，力争达到一名合格的研究生应有的标准。
在政治思想上，时刻严格要求自己并随时准备接受党组织的考验，紧跟时代步伐，了解党和国家的新政策和社会的动向，与时俱进。
在学习方面，我认真学习专业知识，课余时查阅与专业相关的中外文文献，全面提高自己的理论知识水平及英语能力，为以后就业或者继续深造奠定基础。
科研和实践能力方面，我十分注重自己动手能力的培养，并不断加强与相关实验室的交流，培养严谨的科学的态度和素养。
在学习之余，我经常体育活动，并经常与同届的同学、师兄师姐交流谈心，热爱生活，生活态度乐观积极。
在以后的学习中，我会一如既往地勤奋刻苦，认真钻研，争取成为一名优秀的专业人员。
学生本人签字：
年月日
开题报告题目
曼氏无针乌贼精巢kifc1和nup62基因的克隆及表达模式研究
开题报告字数
0.6万字
参考文献数
39篇
开题报告撰写提纲：
（一）论文选题的背景、意义和依据，有关研究的最新成果和动态
（二）课题研究的主要内容、拟采取的技术路线及实施方案、拟解决的关键技术和难点、预期达到的目标
（三）论文的工作量及具体进度安排
（注：
请将开题报告和文献综述附在开题考核表后）
导师意见：
导师签字：
年月日
三、考核过程和结果
考核
过程
结果
1、考核过程（可附页）：
记录人签字：
2、成绩评定：
同学的开题考核成绩为。
（注：
开题考核成绩分“合格，不合格”两个等级）
考核小组组长签字：
成员签字：
年月日
学院
审核
意见
主管领导签字：
（加盖公章）年月日
宁波大学
研究生学位论文开题报告表
论文题目：
曼氏无针乌贼精巢kifc1和nup62基因的克隆
及表达模式研究
学科、专业：
海洋生物学
研究方向：
精子发生过程中相关功能基因的研究
姓名：
马晓欣
学号：
0911071144
指导教师：
竺俊全杨万喜
入学年月：
2009年9月
一、论文选题的背景、意义和依据，有关研究的最新成果和动态
（一）、论文选题的背景、意义和依据
曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）为一年生、食性凶猛、生长迅速的海洋头足类（以下简称乌贼），属软体动物门（Mollusca）、头足纲（Cephalopoda）、十腕目（Decapoda）、乌贼科（Sepiidae）、无针乌贼属（Sepiella），俗称墨鱼。
乌贼分布于中国东南沿海，俄罗斯、日本、朝鲜以及东南亚沿海，舟山海区是最重要的分布区。
乌贼肉鲜味美，风味独特，营养价值高，深受消费者群体的喜爱。
由于近年来乌贼产量极少，市场销售主要以鱿鱼为主。
乌贼全身是宝，乌贼骨是传统中药海鳔蛸，其内脏粉是动物饲料的优良诱食剂，富含不饱和脂肪酸、脂溶性维生素和未知生长因子，是优良的饲料添加剂。
乌贼曾是我国的“四大海产”之一，浙江省历史上渔业捕捞最高产量6万吨，占全省海洋捕捞产量的9.3%。
20世纪70年代以来，由于春、夏汛时，多种渔具大量围捕未产卵的“进港乌贼”秋、冬汛时，包括渔轮拖网、张网作业的多种渔具大量捕捞幼乌贼和越冬乌贼，致使乌贼生长型和补充型群体数量减少，破坏了渔业资源的生态平衡，导致舟山渔场乌贼资源几近枯竭（常抗美等，2009）。
导致乌贼资源枯竭的主要原因包括：
1、乌贼的过度捕捞和生态恶化，导致乌贼资源缺乏；2、乌贼的自然繁殖率成功率以及成活率均低：
对于乌贼繁殖机制的无知，导致在乌贼产卵受精等关键步骤受到影响，从而对乌贼的产量有很重要的影响；乌贼的繁殖机制包括精卵发生机制的研究及受精过程的机制研究。
因此对乌贼繁殖机制进行研究，是未来大规模人工繁殖的需要，也是将来通过大量人工放流增加乌贼自然资源量的重要措施。
国内外对头足类精卵发生机制的研究从二十世纪六十年代初期开始，文献显示，到目前为止已有的研究物种包括Squid（Loligopealii）的精子发生（Austinetal.，1964），章鱼属的北太平洋巨型章鱼（Octopusdofleinimartini）的雄性生殖腺的精子发生（Mannetal.，1970），Octopusdofleinimartini精子的能动性研究（Brooksetal.，1971），Octopusdofleinimartini精子发生（Dottetal.，1970），Larmark（Eledonecirrhosa）精子发生（Maxwell，1974），vampyroteuthisinfernalisChun精子发生（Healy，1989），Rossiamacrosoma精子发生的超微结构研究（Hou&Maxwell，1992），twoEledonespecies精子结构的研究（Selmi，1996），Octopodids（Mollusca:
Cephalopoda）雄性生殖系统的组织学分析（Voight，2002），OctopusTankahkeei精子发生的超微结构分析（Zhuetal.，2005），Sepiaofficinalis精核形成的组织学研究（Martínez-Soleretal.，2007）。
关于乌贼的精子发生，吴常文等在2007年对乌贼雄性生殖系统进行了研究，而后在2008、2009年分别对乌贼精子发生和成熟精子的超微结构进行了报道。
在动物的精子发生中，有至少以下三大结构影响未来的受精：
顶体的形成、精核形态建成以及中段结构。
目前，上述三大结构的形成的分子机制是研究热点。
有研究显示：
有一种称为微管套的微管结构环绕在伸长的核尾端四周，在精核形态建成中起到了关键作用（Russelletal.，1991）。
微管套是由平行排列的，包围在细胞核周围，从核周延伸到细胞质中的一些微管形成的结构，它在精核形态开始变化时出现，在核形态建成过程中体积增大且明显，最后在成熟精子中消失。
由于微管套的变化是与细胞核形态建成同时发生的，因此它在圆形拉长到纺锤形的过程中起到了关键的作用。
在哺乳动物大鼠中，已经有研究发现微管套是与细胞核形态构建和顶体形成过程是相关的（Yangetal.，2003）。
精细胞核膜与微管套之间的连接被认为是细胞核形态变化的动力基础，这种结构特点也表明精细胞向精子的转化过程涉及到了与微管有关的运动机制。
微管与线粒体，内质网和高尔基体等细胞器的形成和分布有密切的联系，并参与了这些膜状结构之间的囊泡运输。
这些过程中至少有两类与微管相关的马达蛋白参与。
这些马达蛋白携带着不同的物质沿着各自唯一的轨道在微管上移动，为物质运输起关键的作用。
驱动蛋白Kinesin家族就是其中一种，呈异性四聚体结构，有两端，一端与微管结合固定在微管结构上随之移动，另一端携带不同的物质进行运输。
利用微管激活的ATP水解作用将物质沿着特定方向运输（Hirokawa，1996；Hirokawa，1998;Hirokawa&Takemura，2005；Hirokawaetal.，1998）。
驱动蛋白首先是在神经细胞中发现的，它与轴突中顺行的快速传导有关。
后来进行的驱动蛋白介导的运动行为的形成和破坏方面的研究，表明它在膜运输过程中起到了一定作用。
KIFC1作为在Kinesin家族中C端的一种驱动蛋白，可以在精巢中表达，已有文献显示：
KIFC1参与大鼠中精子顶体形成过程及膜泡的运输（Yangetal.，2003）,参与中华绒螯蟹精子顶体的形成（Yuetal.，2009;Wangetal.，2010）,参与嘉庚蛸精子形成过程中精核的建成（Wangetal.，2010）,以及在大鼠精子形成过程中与Nup62复合物结合参与精核的形态建成（Yangetal.，2006），说明kifc1在哺乳动物和嘉庚蛸精核形成过程中起了一定作用。
核孔复合体蛋白（nuclearporecomplex），它们结合于核膜，是一种参与核膜内外物质运输的蛋白。
因为精核形成最主要的就是核的延伸拉长形变，因此核形变过程中有核孔复合体蛋白的参与（Martínez-Soler，2007）。
Nup62就是核孔复合体蛋白的一员，有文献显示它可以与KIFC1结合在大鼠精子形成中核建成过程起关键作用（Yanget.al，2006）。
因此我们推测nup62在精核形成中起一定的作用。
乌贼的精子发生过程与嘉庚蛸类似，只是在不同阶段精子形态有所差异，如顶体形状，精核的形状，尾部中段形态等，但是整体过程是大致相似的；与哺乳动物相比，精子发生过程都是差不多的，染色质的浓缩，核形变以及尾部中段的形成，以及微管套在精核形变初期存在，成熟时期消失等都是类似的（叶素兰等，2008）；并且在嘉庚蛸的精子发生过程中已有文献显示kifc1基因在精核形变过程中参与了一定的作用（Wangetal.，2010）。
基于上述三点以及前面已有文献，我们假设认为：
在乌贼精子发生的过程中kifc1和nup62两个基因的表达产物发生相互作用，参与了精核形变的过程。
本课题的主要目的是验证这个假设。
我们拟克隆乌贼精巢中kifc1和nup62两个基因，并在基因表达水平上探明其表达特征，为后续的蛋白水平上研究KIFC1和Nup62的生理作用机制打下基础。
（二）、有关研究的最新成果和动态
1哺乳动物
从九十年代初期到现在，已经有很多关于微管对精子发生过程中很多形态上的变化至关重要（Morenoetal.，2000）。
在精子发生过程中，微管的形成和运动，顶体的形成及细胞核的浓缩与拉长是紧密相关的（Yangetal.，2003）。
有人提出微管套参与了精细胞核的浓缩和形态变化，且某些特定的分子马达蛋白在精子发育和成熟的过程中起到了重要的作用。
这一过程包括精细胞在上皮细胞内的运输，纺锤体和微丝的形成以及顶体的形成（Russelletal.，1991）。
驱动蛋白KIFC1最早在研究小鼠胚胎大脑中的马达蛋白、做RT-PCR时发现的，进一步的分子分析表明这一蛋白属于高度相关的C端马达蛋白家族的一员，它在精巢中也得到表达（Yangetal.，2003）。
从已有的研究中可以发现它广泛的存在于很多的组织中，如卵巢，脾，肺等，说明它作为驱动蛋白在物质运输过程中的重要作用（Halletal.，1992）；而且它可以与很多其他相关的功能蛋白结合，如核孔复合体nup62（Yangetal.，2006），及TLRR（富含亮氨酸的重复片段，含有蛋白磷酸化的位点，有助于蛋白的运输）（Wangetal.，2008），因此说明它在运输过程中起着重要的作用。
具体到KIFC1在精子发生中核建成中的作用，已有研究人员通过小鼠实验对其进行研究，发现KIFC1在精原细胞时时通过与核周的微管套结合而发生作用的，在精原细胞核开始发生变形拉长的过程中，随着微管套向尾部的移动，KIFC1随之一起作用，使细胞核发生形变，从而将圆形拉长为柱状（Gimíenez-Bonafíeetal.，2002）。
而KIFC1与微管套之间通过极性结合从而达到了物质运输的目的，KIFC1的运输方式是从微管的正极向负极移动。
在这种作用模型中，KIFC1分子一端与运输物质结合，一端与微管结合，因而随着微管的移动，达到了物质运输的目的（Healy，1990）。
2软体动物
软体动物精子发生过程中生精细胞核的变化具有种属特异性，核的变化主要体现在染色质的形态及核外部形态变化上（Healy，1993）。
头足类软体动物精细胞分化过程中核染色质经历了片层化，颗粒化，纤维化，其精细胞核形变化均有明显的延长过程，但是延长后的形状不尽相同，如顶体的形状，胞核的形状有的是长柱状有的则会有弯曲，根据不同的物种而呈现特异性，从而判知进化先后顺序,如八腕目的嘉庚蛸的精核为简单的柱状，而乌贼的精核为稍弯曲的长柱形纺锤形，Healy认为直的核起源于弯的核，是后者的进化类型（叶素兰等，2008）。
有学者认为头足类动物精核形态建成过程涉及染色质的凝集与核周微管的作用（Kubo&Ishikawa，1981）。
染色质的凝集是由于结合蛋白的作用（Katoetal.，2004），染色质的浓缩时DNA与蛋白质相互作用促使形态发生改变；核周微管则如哺乳动物中所发现的，微管套为核周施加压力，促使核的延伸和拉长（Kierszenbaum，2002）。
乌贼精子发生的过程中，核周微管在核开始变形拉长的时候出现，此时，核前端的前顶体形成，核在核周微管的作用下挤压，变形，拉长，延伸；此时，核内的染色质颗粒化，进而纤维化，片层化，最后形成纺锤状的精细胞，微管套消失不见（叶素兰等，2008）。
已有的研究发现嘉庚蛸（Zhuetal.，2005）和墨鱼（Sepiaofficinilis）的精核形态建成都是核周微管和浓缩的染色质通过核膜相互作用的结果（Martínez-Soler，2007）。
KIFC1在嘉庚蛸的精子顶体发生的许多阶段密切相关，在核周微管和浓缩的染色质之间相互作用的过程中，马达蛋白KIFC1也起到了关键作用（Wangetal.，2010），而在曼氏无针乌贼上的有关此项研究还没有报道。
二、课题研究的主要内容、拟采取的技术路线及实施方案、拟解决的关键技术和难点、预期达到的目标
（一）、课题研究的主要内容
1曼氏无针乌贼精子发生过程中各发育阶段生精细胞核的形态结构及核周微管结构的变化；
2曼氏无针乌贼精巢中kifc1及nup62基因的克隆；
3kifc1及nup62基因在曼氏无针乌贼精子形成过程中表达模式。
（二）、拟采取的的技术路线及实施方案：
1.曼氏无针乌贼精子发生过程中各发育阶段生精细胞核的形态结构及核周微管结构的变化利用透射电镜技术观察。
1.1取材：
组织块小于1mm3
1.2固定：
2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）固定2小时或更长时间；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分，三次；1%锇酸固定液固定1-2小时；用0.1M磷酸漂洗液漂洗15分，三次
1.3脱水：
50%乙醇15-20分；70%乙醇15-20分；90%乙醇15-20分；90%乙醇90%丙酮（1：
1）15-20分；90%丙酮15-20分；以上在4度冰箱内进行；100%丙酮室温15-20分，三次。
1.4包埋：
纯丙酮+包埋液（2：
1）室温1-2小时；纯丙酮+包埋液（1：
2）室温1-2小时；纯包埋液室温过夜
1.5固化：
37度烘箱内12小时；60度烘箱内48小时以上
1.6超薄切片机切片50-60nm
1.73%醋酸铀-枸橼酸铅双染色
1.8透射电镜观察。
拍片
2.曼氏无针乌贼精巢中kifc1及nup62基因的克隆
取不同时期的精巢组织，进行组织总RNA的抽提，利用反转录试剂盒对总RNA进行RT-PCR，得到cDNA。
利用在线设计网站进行兼并引物设计，再通过巢式PCR技术进行目标条带的扩增，选取目标的特异性条带进行回收，与PMD18-T载体链接，然后大肠杆菌转化，菌落PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，然后测序。
得到的结果即为目标基因的一段序列。
利用primer5软件进行特异性引物设计，进行3’-RACE和5’-RACE进行序列的3’端序列和5’端序列扩增，从而得到基因的全部序列。
其中引物设计是其中关键的步骤，兼并引物的设计是通过在线网站设计，选取与乌贼最接近的头足类进行引物设计，并根据兼并度，退火温度，CG含量等进行引物的选取，从而得到特异性更高的引物。
3kifc1及nup62基因在曼氏无针乌贼精子形成过程中表达模式研究
在原位杂交之前应进行特异性探针的设计，以及冰冻切片的制备。
3.1杂交前预处理
（1）冰冻切片经室温干燥10min后，在4％的多聚甲醛-PBS（pH7.4）固定l0min。
（2）活跃的DEPC-PBS（未高压的0.1％DEPC-1×PBS溶液）洗2次，每次5min。
（3）5×SSC中平衡15min。
3.2杂交
（1）在脱水后的玻片上滴加预杂交液（约100μl／玻片），置于放有湿盒液（50％甲酰胺v/v；0.3MNaCl；1mMEDTA；10mMTris-Cl，pH8.0）的湿盒中，55～58℃下的烘箱中预杂交2h。
（2）甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针（浓度1-2ng/μl）经70℃变性10分钟，置冰上1min，玻片上滴加预杂交液（约60μl/玻片），覆盖parafilm膜，放湿盒中在48～58℃下杂交18-30h。
3.3杂交后处理
（1）取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52℃预热的5×SSC洗30min。
（2）在无DNA的RNA酶A（20μg/ml）溶液中37℃下孵育30min。
（3）分别依次用52℃预热的2×SSC，1×SSC和0.1×SSC洗2次，每次30min。
3.4杂交信号检测
（1）在缓冲液A（0.1MTris-HC1pH7.5，0.15MNaC1）中平衡5min。
（2）在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（1：
500～1:
2000稀释于含0.5％阻断液的缓冲液A中），室温反应2h。
（3）用缓冲液A洗2次，每次15min。
（4）在缓冲液B（0.1MTris-HCl；0.1MNaCl；0.05MMgCl2，pH9.5）中平衡5min。
（5）硝基四氮唑蓝（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸盐（BCIP）溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5μ1NBT和3.5μ1BCIP。
在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。
（6）充分显色后，用EDTA（1mMEDTA，pH8.0）洗15min终止反应。
（7）在95％乙醇中洗lh以除去非特异的背景。
（8）用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体。
（9）脱水、透明，用中性树胶封片。
（10）充分干燥后在显微镜下观察、照相。
（三）、现有的实验条件
1.样品来源可以得到保证，活体材料采集方便。
2.实验条件和仪器设备保证。
浙江大学生科院和宁波大学生命学院具备完善的实验仪器，指导老师在此领域有着多年的研究经验，颇有造诣，可解决实验中遇到的技术问题。
3.宁波大学和浙江大学图书馆文献信息资源充足，为实验的顺利进行提供了便利资料资源。
（四）、拟解决的关建技术和难点：
1.乌贼精巢kifc1及nup62基因全长的克隆；
2．原位杂交技术中kifc1及nup62基因的探针设计。
（五）、预期达到的目标
1、克隆乌贼精巢kifc1及nup62基因全长；
2、探明kifc1及nup62基因在乌贼精子发生过程中的表达模式特征。
三、论文的工作量及具体进度安排
2010.9--2011.12查找相关资料、熟悉基本的实验操作，进行部分预实验；
2011.1—2011.4
①不同发育阶段精巢的取材固定；
②制备乌贼不同发育阶段精巢的RNA，并做反转录实验。
进行kifc1和nup62基因的克隆测序
2011.5—2011.7
①制备冰冻切片，用原位杂交技术研究不同阶段kifc1和nup62基因的分布与细胞核和微管的位置之间的关系；
②透射电镜观察精子发生不同时期核形的变化，核周微管的形态以及马达蛋白的分布。
2011.8—2011.9
综合分析kifc1和nup62基因在乌贼精子形成过程中的可能作用。
2011.9—2011.11
数据和材料整理、分析，论文写作。
四、主要参考文献
[1]吴常文等.曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）繁殖习性及其产卵场修复的研究[J].海洋与湖沼,2010,41
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[2]常抗美等.曼氏无针乌贼胚胎发育于人工育苗技术的研究[J].浙江海洋学院学报（自然科学版）,2009,28（3）:
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[3]竺俊全,杨万喜.双壳类软体动物精子发生及其在系统演化研究中的应用前景[J].海洋与湖沼通报,2002,4:
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[4]叶素兰等.曼氏无针乌贼雄性生殖系统的组织学研究[J].浙江海洋学院学报（自然科学版）,2007,26（4）:
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[5]叶素兰等.曼氏无针乌贼精子形成的超微结构[J].海洋与湖沼,2008,39（3）:
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[6]叶素兰等.曼氏无针乌贼精子的超微结构[J].中国水产科学,2009,16
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[7]YangW.X.&SperryA.O.TheC-terminalkinesinmotorKIFC1participatesinacrosomebiogenesisandvesicletransport[J].Biol.Reprod,2003,69:
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[8]YangW.X.etal.ThemolecularmotorKIFC1associateswithacomplexcontainingnucleopo
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