制药分离工程实验指导讲义.docx

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制药分离工程实验指导讲义

四川理工学院

制药分离工程实验指导

第一版

制药工程系编

二○一二年

实验一细胞SOD的提取和分离

一、实验目的

1．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。

2．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。

二、实验原理

超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。

它可催化超氧负离子（O2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。

大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。

由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。

同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。

三、试剂与仪器

1.试剂与材料

新鲜蒜瓣、0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）、氯仿-乙醇混合液：

氯仿:

无水乙醇=3:

5、丙酮：

用前需预冷至4-10℃、0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.2）、0.1mol/LEDTA溶液、2mmol/L肾上腺素溶液

2.仪器

恒温水浴锅、冷冻高速离心机、可见分光光度计、研钵、玻棒、烧杯、量筒

四、实验步骤

1.组织细胞破碎：

称取5g大蒜蒜瓣，置于研钵中研磨。

2.SOD的提取：

破碎后的组织中加入2-3倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8），继续研磨20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后在5000rpm下离心15min，取上清液。

3.除杂蛋白：

上清液加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，5000rpm离心15min，得到的上清液为粗酶液。

4.SOD的沉淀分离：

粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，5000rpm离心15min，得SOD沉淀。

将SOD沉淀溶于0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）中，于55-60℃热处理15min，得到SOD酶液。

5.SOD活力测定

将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样，测定各自的SOD活力。

试剂

空白管

对照管

样品管

碳酸缓冲液

5.0

5.0

5.0

EDTA溶液

0.5

肾上腺素溶液

肾上腺素溶液

蒸馏水

0.5

0.5

-

样品液

-

-

0.5

混合均匀，在30℃水浴中预热5min

肾上腺素溶液

0.5

0.5

加入肾上腺素后，继续保温2min，然后立即在480nm处测定光密度。

对照管和样品管的光密度值分别为A和B。

在上述条件下，SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。

即：

酶活力（单位）=2（A-B）N/A

式中，N——样品稀释倍数；2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。

五、实验结果

根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积，计算纯化提取率。

六、注意事项

1.酶液提取时，为了尽可能保持酶的活性，尽可能在冰浴中研磨，在低温中离心。

2.肾上腺素容易被氧化，故操作时要尽量快。

以对单糖混合液进行分离。

以纤维素作为支持物，把它均匀地涂布在玻璃板上成一薄层，然后在此薄层上进行层析即为纤维素薄层层析。

纤维素是一种惰性支持物，它与水有较强的亲和力而与有机溶剂亲和力较弱。

层析时吸着在纤维素上的水是固定相，而展层溶剂是流动相。

当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系

七、思考题

1.计算出每500g大蒜蒜瓣所制备出的SOD酶的克数。

2.讨论有机溶剂沉淀法与盐析法相比的优缺点。

实验二大枣中多糖的提取分离

一、实验目的

1、学习多糖的提取分离方法及工艺

2、熟悉萃取、离心、蒸发、干燥等单元操作

3、掌握苯酚硫酸法鉴定多糖的方法。

二、实验原理

多糖化合物作为一种免疫调节剂，能激活免疫细胞．提高机体的免疫功能，对正常的细胞没有毒副作用，在临床上用来治疗恶性肿瘤、肝炎等疾病。

大分子植物多糖如淀粉、纤维素等多不溶于水，且在医药制剂中仅用作辅料成分，无特异的生物活性。

而目前所研究的多糖，因其分子量较小，多可溶于水，因其极性基团较多，故难溶于有机溶剂。

多糖的提取方法通常有以下三种。

（1）直接溶剂浸提法：

这也是传统的方法，在我国已有几千年历史，如中药的煎煮、中草药有效成分的提取。

该方法具有设备简单、操作方便、适用面广等优点。

但具有操作时间长、对不同成分的浸提速率分辨率不高、能耗较高等缺点。

（2）索氏提取法：

在有效成分提取方面曾经有过较为广泛的应用，其提取原理：

在索氏提取中，基质总是浸泡在相对比较纯的溶剂中，目标成分在基质内、外的浓度梯度比较大；在回流提取中．溶液处于沸腾状态，溶液与基质间的扰动加强，减少了基质表面流体膜的扩散阻力，根据费克扩散定律，由于固体颗粒内外浓度相差比较大，扩散速率较高，达到相同浓度所需时间较短，且由于每次提取液为新鲜溶剂，能提供较大的溶解能力，所以提取率较高。

但索氏提取法溶剂每循环一次所需时间较长，不适合于高沸点溶剂。

（3）新型提取方法：

随着科学技术的发展，近年出现了一些新的提取方法和新的设备，如超声波提取、微波提取以及与膜分离集成技术，极大地丰富了中草药药用成分提取理论。

此外还有透析法、柱色谱法、分子筛分离法及中空纤维超滤法等。

可根据原料及多糖的特点，设计不同的提取工艺。

本实验采用直接溶剂浸提法提取大枣多糖。

三、试剂与仪器

试剂：

大枣，无水乙醇，浓硫酸，苯酚（常压蒸馏，收集182℃馏分），蒸馏水。

仪器：

电热恒温水浴锅，磁力搅拌器，电子天平，真空干燥箱，低速离心机，旋转蒸发仪，家用多功能粉碎机；锥形瓶，量筒，容量瓶，试管，移液管，玻璃棒，烧杯、蒸馏头。

四、实验步骤

（1）大枣多糖的提取

①将大枣烘干，粉碎，称取枣粉15g，装入250mL的锥形瓶中，并加入200mL的蒸馏水。

②开动磁力搅拌器搅拌，在80℃恒温水浴提取1h。

③将大枣提取液离心，得到上清液，并定容于200mL容量瓶中，从中移取10mL于10mL试管中，以备鉴定。

④剩余上清液45℃在旋转蒸发仪减压浓缩至原提取溶液体积的1/2，浓缩液中加220mL无水乙醇，使溶液乙醇含量达到70%，静置2h后离心分离，收集多糖沉淀，加入多糖沉淀1倍体积的无水乙醇洗涤，离心分离后将沉淀物放入45℃真空干燥箱，干燥至恒重得大枣粗多糖。

⑤提取率计算

提取率=（干燥大枣粗多糖/原枣粉重量）×100%

（2）多糖的鉴定

①5%苯酚溶液的配制：

取苯酚100g，加铝片0.1g和NaHCO30.05g，蒸馏收集182℃馏分，称取此馏分25g，加水475g，置于棕色瓶放入冰箱备用。

②移取大枣多糖提取液三份各2.5mL，标为1#，2#，3#样，分别定容于50mL、100mL、200mL容量瓶中。

③分别移取1#，2#，3#多糖溶液1mL于10mL试管中，然后依次加入1.6mL的5%苯酚溶液，7mL浓硫酸，振荡摇匀后室温冷却，观察溶液颜色变化。

五、实验结果与讨论

①记录试验条件、过程、各试剂用量及产品的重量，并计算大枣多糖的提取率，填写下表。

②产品为暗红色固体。

③观察大枣多糖鉴定过程中的溶液颜色变化，记录试验现象。

填写下表1。

表1大枣中多糖的提取率及鉴定结果

组别

多糖重量

提取率

溶液颜色变化

1#

2#

3#

六、思考题

1．与不同小组的实验结果进行比较，讨论影响多糖提取实验结果的因素都有哪些？

2．结合糖的性质，分析采用苯酚一硫酸法鉴定大枣多糖的原理，并讨论溶液颜色与多糖含量的关系

实验三有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶

一、实验目的

1．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。

2．掌握大豆脲提取分离的一般步骤。

3.熟悉重结晶操作的方法。

二、实验原理

脲酶（EC3.5.6.5）广泛存在于微生物和动、植物组织中，1926年，SumnerJ曾用32％的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并得到了结晶。

该酶相对分子质量为483000，由6个亚基组成，等电点4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳定，纯酶不太稳定，结晶酶在低温下可稳定1年以上。

本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点结合法制备该酶。

三、仪器与试剂

仪器：

家用磨粉机、冰浴设备、离心机、5mL、10mL、50mL离心管、1.5mL塑料离心管及其他常规仪器；

试剂：

新鲜大豆或大豆粉；人造移石（专用于吸附氨Permutin颗粒状人造沸石）;2％醋酸：

冰醋酸2mL用蒸馏水稀释至l00mL;64％和32％丙酮（丙酮原液按体积百分比用蒸馏水配制）。

四、实验步骤

1.提取

（1）称取5g人造沸石，置小烧杯中，用2％乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水反复洗涤至中性，沥干备用。

（2）称取10g新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加50mL32％丙酮溶液，在冰浴中持续摇动4min～5min,4层纱布过滤，收集滤液。

（3）将滤渣重新置于锥形瓶中，另加10mL32％丙酮，再提取一次。

4层纱布过滤，滤液在4℃，3500r·min-l条件下离心8min～10min，小心倾出上清液，计量体积。

取lmL酶液保存，供测酶活力和蛋白质用。

2.沉淀

脲酶在32％的丙酮中可以缓慢聚集而沉淀，但当酶液在等电点附近时，沉淀生成更快。

故：

（1）将提取的酶液置冰浴中，在缓慢搅拌下，用点滴管逐滴滴加2％醋酸，并不断用精密pH试纸检测pH变化，观察产生浑浊的现象，直至pH4.9左右。

置4℃低温下过夜，可析出沉淀。

（2）将沉淀物仔细转入预冷的离心管，3500r·min-l条件下离心10min～12min。

上清液回收丙酮；沉淀即为脲酶粗品。

风干后，称重，计算酶的收得率。

3.重结晶

（1）将所得粗酶溶于少许蒸馏水中，吸取0.2mL～0.4mL用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。

（2）酶溶液在冰浴中冷至2℃～4℃，搅拌下缓慢滴入等体积64％的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其缓慢析出结晶，需要较长的时间，可得到较好的正方形晶体。

如果将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。

结晶干燥后低温保存。

五、结果计算

酶收得率（%）=（酶干重＋酶干重×测酶活留取液体体积／酶液总体积）÷样品重×100%

酶的比活力［U·mg-1，（pr.）]＝总活力／总蛋白质

报告试验结果及观察到的有关现象记载。

酶制备记录表如下：

步骤

总体积

（mL）

酶活力

蛋白质

比活力

U·mg-1（pr.）

收得率（%）

U·mL-1

总活力（U）

mg·mL-1

总蛋白质（mg）

（l）提取液

（2）粗酶

（3）结晶酶

六、思考题

1、脲酶提取过程中为什么要用人造沸石？

2、脲酶提取过程中有二次需要离心，每次离心的目的是什么？

离心操作要注意些什么问题？

3、

实验四柱层析法对色素的提取与分离

一、实验目的

1、通过绿色植物色素的提取和分离，了解天然物质分离提纯方法；

2、了解柱层析和薄层色谱分离的基本原理，掌握柱层析和薄层色谱分离的操作技术。

3、通过柱色谱和薄层色谱分离操作，加深了解微量有机物色谱分离鉴定的原理。

二、实验原理

石油醚是一种脂溶性很强的有机溶剂。

叶绿体中的四种色素在石油醚中的溶解度是不同的：

溶解度高的随层析液在滤纸上扩散得快；溶解度低的随层析液在滤纸上扩散得慢。

溶解度最高的是胡萝卜素，它随石油醚在滤纸上扩散得最快，叶黄素和叶绿素a的溶解度次之；

叶绿素b的溶解度最低，扩散得最慢。

这样，四种色素就在扩散过程中分离开来。

同样，提取液可用色层分析的原理加以分离。

因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。

本实验是用活性氧化铝作吸附剂，分离菠菜中胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a和叶绿素b。

三、仪器与试剂

仪器：

研钵、布氏漏斗、圆底烧瓶（150ML的2个）、色谱柱、抽滤瓶、铁架台、脱脂棉，723分光光度计，烧杯（500ml各3个），分液漏斗（250ml，1个）

试剂：

硅胶G，碱性三氧化二铝，石英砂，甲醇（500ml），石油醚（60-90℃，500ml），丙酮（500ml），乙酸乙酯（500ml），菠菜叶。

四、实验步骤

1、菠菜色素的提取

取2g新鲜菠菜叶，与10mL甲醇拌匀研磨5分钟，弃去滤液。

残渣用10mL的石油醚-甲醇（3:

2）混合液进行提取，共提取两次。

合并液用水洗后弃去甲醇层，石油醚层进行干燥、浓缩。

2、薄层层析

将上述的浓缩液点在硅胶G的预制板上，分别用石油醚-丙酮（8:

2）和石油醚-乙酸乙酯（6:

4）两种溶剂系统展开，经过显色后，进行观察并计算比移值。

3、柱层析

取3g中性氧化铝进行湿法装柱。

填料装好后，从柱顶加入上述浓缩液，用石油醚-丙酮（9:

1）、石油醚-丙酮（7:

3）和正丁醇-乙醇-水（3:

1:

1）进行洗脱，依次接收个色素带，即得胡萝卜素（橙黄色溶液）、叶黄素（黄色溶液）、叶绿素a（蓝绿色溶液）以及叶绿素b（黄绿色溶液）。

称取12g碱性三氧化二铝加入30mL石油醚搅拌，浸泡10min。

在层析柱内加入一团棉花（棉花要尽量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。

用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。

样品的分离层析

将浓缩液小心地从柱顶部加入。

加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醚冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前，在柱顶小心加入约1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脱剂，层析即开始进行。

先用石油醚-丙酮（9:

1）洗涤（配置约50ml的混合液即可），当黄色色带洗出后，改用石油醚-丙酮（7:

3）（配置约50ml的混合液即可），继续洗涤。

当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的烧杯收集，得黄色溶液，即胡萝卜素。

将洗脱剂换成1：

7的石油醚-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素a和叶黄素。

五、思考题

1.提取和分离叶绿体中色素的关键是什么？

2.叶绿体中有哪几种色素？

滤纸条上的色素带，从上到下是怎样排列的？

3.叶绿体中的色素含量最多和扩散速度最快的是哪一种？

实验五质粒的提取及电泳分离

一、实验目的

1.掌握提取质粒的方法

2.掌握凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。

二、实验原理

采用溶菌酶或EDTA可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）或TritonX-100处理后，细菌染色体DNA回缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线性染色体DNA片段难以复性，而是与变形的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

二、仪器与试剂

1.仪器：

冷冻高速离心机、恒温震荡摇床、蒸汽灭菌锅、恒温水浴、微量移液器。

2.试剂：

溶液I：

50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/LTris.CL，10 mmol/LEDTA（Ph8.0）

溶液II:

0.2mol/L氢氧化钠，1%SDS

溶液III：

5mol/LKAc60mL,冰醋酸11.5mL,去离子水28.5mL，

TE缓冲液：

10 mmol/LTris.CL，1mmol/LEDTA（Ph8.0）

饱和酚、氯仿、异戊醇、琼脂糖凝胶

四、实验步骤

1. 细菌培养

  挑单菌落接种到5mL含有氨苄青霉素的培养基中37℃振荡至对数生长后期。

2. 细菌收集

  取1.5mL培养液，4000rpm离心5分钟后倒掉上清液。

3. 质粒提取

1）加100μL预冷的溶液I，涡旋悬浮后，在冰上放置5分钟。

2）加200μL溶液II，轻轻混匀后，冰上放置5分钟。

3）加150μL溶液III，充分混合后，冰上放置5分钟。

4）4℃，10000rpm离心15分钟，把上清液移至新管。

4. 抽提

  加等体积的氯仿/异戊醇（24:

1），混匀，放置片刻。

4℃，10000rpm离心10分钟，把上清液移至新管。

5. 质粒沉淀

  加入2倍体积的冰乙醇，放置20分钟。

4℃，10000rpm离心15分钟，倒弃上清。

6. 洗涤沉淀

  加入500μL，70%的乙醇，洗涤沉淀。

7. 溶解质粒

     4℃,7000rpm离心5分钟，倒弃上清，真空干燥，加入适量（20μL）的TE和0.5μLRNA酶溶液。

8.制备凝胶

    称1g琼脂糖，放入250mL三角瓶内，加入100mL1×TAE电泳缓冲液，加热煮沸等其凉到60℃左右，倒入封好的电泳板上。

9.上样

1）吸取2μL质粒，加入1μL上样缓冲液（Loadingbuffer），混匀。

2）将质粒样品点入到琼脂糖凝胶的上样孔中

10.电泳   

  连接好电泳槽和电泳仪，以5V/cm恒压电泳。

11.染色及脱色

    电泳1.5-2h后，关上电泳仪。

取出凝胶，放入染色槽内，加入1滴溴化乙锭（EB）轻轻摇荡15分钟。

将染色液倒入储存桶内，在染色槽内加入自来水，轻轻摇荡10分钟。

12.结果观察   

  将凝胶放到紫外灯下观测。

记录观察到的电泳条带。

五、思考题

1.说明碱裂法提取质粒的原理?

2.电泳结果出现几个条带?

各是什么?

实验六　八角茴香油的提取与检识

一、实验目的：

1．掌握用水蒸汽蒸馏法提取挥发油的原理和方法。

2．学习挥发油的一般检识及挥发油中固体成分的分离方法。

3．掌握挥发油中化学成分的薄层点滴定性检识。

4．了解挥发油单向二次薄层层析法。

二、实验原理：

八角茴香为木兰科植物八角茴香的干燥成熟果实。

内含挥发油约5%。

主要成分是茴香脑，约为总挥发油的80-90%。

此外，尚有少量甲基胡椒酚、茴香醛、茴香酸等。

其主要化合物的结构式如下：

茴香脑　　　甲基胡椒酚　　　　茴香醛　　　　茴香酸

本实验是根据挥发油具有所属挥发性，能随水蒸汽一同蒸出的性质，选用水蒸汽蒸馏法进行提取。

挥发油的组成成分比较复杂，常含有烷烃、烯烃、醇、醛、酮、酸、醚等。

由于各类化合物都具有其牲官能团，因此，可以用一些检出试剂在薄层板上进行点滴试验，从而了解挥发油各组分化合物的类型。

挥发油各组分的极性各不相同，一般结构中不含氧的烃类和萜类化合物极性较小，在薄层层析时可以被石油醚较好的展开；而含氧的烃类和萜类化合物极性较大，不易被石油醚展开，但可被石油醚：

乙酸乙酯的混合溶剂较好的展开。

为了使挥发油中各组分能在一块薄层板上进行分离，可采用单向二次层析展开法。

所谓单向二次展开，是先用极性稍大的展开剂进行第一次展开，当展开剂展至薄层板中部时，取出，立即挥去展开剂。

此时，挥发油中极性小的成分被推至展开剂前沿，极性较大的成分已被展开分离。

将原来的薄层板改换极性小的展开剂再作第二次展开，直至展开剂展开至薄层板的顶端，此时可使极性小的成分在较小极性的展开剂中得到很好的分离，从而达到在一块薄层板上完成极性大小不同的多种成分分离的目的。

所谓双向展开，其方法是用一块方形薄层板进行层析，第一次展开和第二次展开的方向互为90℃，即用第一种展开剂先展开后，挥尽展开剂，将薄层板转换90℃角，用第二种展开剂再展开一次，可使挥发油中的各组分得到分离。

三、试剂与仪器

仪器：

圆底烧瓶，长颈圆底烧瓶，直形冷凝管，接液管，量筒，分液漏斗，锥形瓶，布氏漏斗，滤纸，抽滤瓶，电热套等，挥发油测定器，10×10cm硅胶CMC－Na薄层板，毛细管。

药品：

八角茴香，乙醇，石油醚（30－60℃沸程），乙酸乙酯，香草醛，硫酸。

四、实验步骤

1．八角茴香油的水蒸汽蒸馏法：

取八角茴香50g，捣碎，置烧瓶中，加适量水浸泡湿润，按一般水蒸汽蒸馏法进行蒸馏。

也可将捣碎的八角茴香置于挥发油测定器的烧瓶中，加蒸馏水500mL与玻璃珠数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管。

自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并使溢流入烧瓶时为止。

缓缓加热至沸，至测定器中油量不再增加，停止加热，放冷，分取油层。

2．分离固体成分：

将所得的八角茴香油置冰箱中冷却1小时，即有白色结晶析出，趁冷过滤，压干。

结晶主要为茴香脑，滤液为析出茴香脑后的八角茴香油。

3．八角茴香油的检识：

油斑试验：

将八角茴香油1滴，滴于滤纸片上，加热烘烤，观察油斑是否消失。

薄层点滴反应：

取硅胶CMC-Na薄层板1块，用铅笔在其上划线打格，形成如图所示的方格，进行类似磁点滴板的试验。

先将挥发油样品用5-10倍量乙醇稀释后，以毛细管分别滴加于每个格内再将各种试剂用滴管分别滴于各挥发油样品的斑点上，观察颜色变化。

所用挥发油除本次实验所提取的八角茴香油外，可同时用桂皮油、丁香油、薄荷油、桉叶油，松节油、樟脑油等进行观察。

挥发油的薄层检识：

单向二次展开：

取1块长约15cm的硅胶CMC－Na薄层板，在距底边1.5cm及8cm处分别用铅笔画一起始线和中线。

将八角茴香油溶于丙酮，用毛细管点于起始线上，用石油醚（30－60℃沸程）：

乙酸乙酯＝85：

15的混合液为展开剂，展开至薄层板的中线处，取出，挥去展开剂后，再放入石油醚（30－60℃沸程）中展开，至接近薄层板顶端时取出，挥去溶剂后立即显色。

显色剂：

分别用下列显色剂喷雾显色。

显色剂

与挥发油显色情况

1%香草醛－60%硫酸溶液

紫色、红色等多种颜色

荧光素－溴试剂

黄色斑点示有不饱和化合物

2,4二硝基苯肼试剂

黄色斑点示有醛、酮化合物

0．05%溴甲酚氯乙醇试剂

黄色斑点示有本性化合物

双向展开：

取10×10cm硅胶CMC－Na薄层板一块，沿起始线的右侧1.5cm处点样（只点1个原点）。

先在石油醚中做第一方向展开，待展开至接近薄层板的终点，取出薄层板，挥去溶剂。

再将薄层板调转90℃，置于石油醚（30－60℃）：

乙酸乙酯（85：

15）展开剂中做第二方向展开至接近薄层板终端，取出薄层板，挥去展开剂，同上法显色。

根据结果分析挥发油组成情况。

五、注意事项

1．采用挥发油含量测定装置撮挥发油，可以初步了解该药材中挥发油的含量，但所用的药材量应使蒸出的挥发油量不少于0.5mL为宜。

2．挥发油测定装置一般分为两种，一种为适用于相对密度小于1.0的挥发油。

另一种用于测定相对密度大于1.0的挥发油。

《中华人民共和国药典》95版规定，测定相对密度大于1.0的挥发油，也在相对密度小于1.0的测定器中进行，可在加热前，预先加入1mL二甲苯于测定器中，然后进行水蒸汽蒸馏，使蒸出的相对密度大于1.0的挥发油溶于二甲苯中。

由于二甲苯的相对密度为0.8969，一般能使挥发油与二甲苯的混合溶液浮于水面。

在计算挥发油的含量，扣除加入二甲苯的体积即可。

3．提取完毕，须待油水完全分层后，再将油放出，注意尽量