基因工程笔记总结.docx

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基因工程笔记总结

粘性末端连接效率高于平末端约100倍！

Enzymes第二章

化平末端为粘性末端解决方法：

DNA连接酶Ligase第四节

3.平末端连接---同聚物加尾法一、DNA连接酶的发现

（1）末端脱氧核苷酸转移酶.二连接条件

功能：

5'至3必须是两条双链DNA。

'单链聚合

作用特点：

单链；无模版P'端有一个磷酸基团（）。

'DNA3端有游离的-OH，5作用机理：

需要能量。

a:

用5三、连接反应的机理'-特异的核酸外切酶处理DNA分子，以便移去少数几个末端核苷酸,获得3。

、1ATP（NAD+）提供激活的AMP'-OH的单链延伸末端。

b:

加入dATP/dTTPTP2、A与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中，DNA分子的PPi。

3-OH末端将会出现单纯并释放出焦磷酸

由poly（dA）3、AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连。

和poly（dT）组成的DNA单链延伸。

c:

随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA获得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就会彼此连接起来。

4、AMP腺苷酸”复合物。

上，形成“一条链的5'端PDNA-缺点：

当poly（dA），Poly（dT）不严格等长时'、3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，,重组DNA分子会5有缺口。

。

AMP释放出需要用：

只连“LigaseDNA聚合酶I填补，然后用DNA，不连“Nick切口”Gap缺口”连接酶连接最后的缺口。

4.平末端连接连接酶.四两种DNA

1.E.ColiDNAligase---衔接物连接法与接头连接法

（1）平末端的衔接物连接法来源：

E.coli

衔接物的5适用：

粘性末端（PEG与高浓度一价阳离子存在可连'末端和待克隆的DNA片段的5'-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。

通过平末端）T4DNA连接2.T4ligase酶的作用使两者连接起来。

用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。

来源：

T4phage

及适用：

粘性末端平末端T4vs.E.coli

（2）平末端的接头连接法

将具有某种限制性酶（BamHI）粘性末端的典型DNA价格便宜，T4DNAligase制备容易，能进行各种类型接头分子与平末端的DNA连接反应，应用更广泛！

片段连接后，后者变成具有粘性末端的.Ligase五DNA分子。

的反应温度

七最佳温度：

.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为是热稳定的4-15DNA℃比较合适。

连接酶的应用：

寡核苷酸连接测定法（oligonucleotideligationassay,分子连接的四种形式DNA六.

OLA）

连接酶链式反应（ligationchainreaction,LCR4.平末端加尾；3.2.粘性末端；1.平末端；平末端）或接头（linker）加衔接物（adaptor）

（1）DigestionandLigation

寡核苷酸连接测定法的作用．粘性末端连接1

检测突变自我环化作用Problem:

（）寡核苷酸连接测定法的作用：

、双酶切（两种内切酶）解决方法：

a、去磷酸b检测突变。

寡核苷酸连接测定法1.平末端连接2.

（1）原理:

末端补平

末端标记及随机引物标记两条寡聚核苷酸探针分子，同一种与之互补变性的靶

cDNA第二链合成（见cDNA文库构建）DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在分子上的位置是彼此相邻的。

靶DNADNA测序

链是完全碱基配对时，便可以被连当他们同靶DNA三.T4DNA接酶连接起来。

聚合酶

1.T4DNA聚合酶特点结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两

活性：

个探针之间不能形成磷酸二脂键。

5'3'聚合低

5'DNAPolymerase第五节DNA聚合酶3'外切无

3'常用的DNA聚合酶：

5'外切高！

1、大肠杆菌聚合酶ＩDNA2.T4DNA聚合酶活性的条件Klenow、大肠杆菌2DNA聚合酶Ｉ的大片段酶模版、引物、原料dNTP

3.T4DNA聚合酶的“取代合成”T4DNA3、聚合酶法末端标记4聚合酶、T7DNA四.T7DNA5、反转录酶等。

聚合酶

1.T7DNA聚合酶特点

活性：

一、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ

5'3'聚合DNA聚合酶Ⅰ特点高！

低3'活性：

5'聚合

5'3'外切无

3'5有外切3'5''外切高

2.T7DNA外切聚合酶的应用低'3'5合成：

高活性，几kb，不受DNA二级结构的影响聚合酶Ⅰ的应用——放射性探针的标记DNA标记：

类似T4（取代合成）

末端补平：

类似T4聚合酶Ⅰ的两种特殊反应：

（1）DNA

第六节核酸修饰酶切口转移与链取代

一.修饰的T7DNA聚合酶DNA切口转移法制备放射性

（2）分子杂交探针

活性：

5'3'聚合更高（*3）！

Klenow二、片段5'3'外切片段Klenow聚合酶Ⅰ的、1DNA无3'5'外切无！

活性：

修饰的'3'5聚合T7DNA低聚合酶的应用：

合成能力：

外切'3'5更高、无！

更快、更强！

标记：

重在“掺”与5'3外切'低末端补平：

（phosphotase）磷酸酶（kinase）&激酶.二片段的应用Klenow2.

活性：

降解单链核酸（DNA或RNA）为单核苷酸；降解双链核酸的单链区T4多核苷酸激酶

（2）S1核酸酶的应用----RNA

（1）特点分子的定位基因编码；噬菌体pseT来源：

T42.Bal31核酸酶

Bal31核酸酶的三种活性：

活性：

5'-OH加磷酸；

（1）单链核酸内切

（2）T4kinase5'末端标记的机理

（2）双链核酸外切

（用酸性磷酸酶处理使其脱磷酸，使5‘OH基国暴露，3）双链切口对应链

Bal31分子中转移来的r-P基团键核酸酶主要用途：

同多核苷酸激酶从r-PATP

（1）诱发合，实现末端标记。

DNA发生缺失突变

（2）定位测定DNA（3）T4多核苷酸激酶的应用片断中限制性位点的分布'末端标记a:

5（3）研究超盘旋DNAb:

5'末端磷酸化分子的二级结构

3.其他核酸酶磷酸酶

外切核酸酶Ⅲ（ExonucleaseⅢ）

（1）特点：

3'至5'外切，BacterialAlkalinePhosphotase细菌碱性磷酸酶来源：

（RNABAP），E.coli；小牛肠碱性磷酸酶（酶Ⅰ（RNaseⅠ）：

切割DNA-RNA杂合链中的Calfintestinal

RNA，小牛肠。

AlkalinePhosphotase,CIAP）其他核酸酶:

外切核酸酶Ⅲ（'活性：

5-PExonucleaseⅢ）：

3'至5'外切去磷酸

磷酸酶作用机理

（2）

DNA酶ⅠPDNAP5催化核酸分子脱掉‘－，使分子5'－转（DNaseⅠ）：

随机切割ss&dsDNA－－－脱磷酸作用。

OH‘化成5－RNA酶Ⅰ（RNaseⅠ）：

切割DNA-RNA杂合链中的RNAT4这样产生的和[r-P]AOH5‘－末端，为随后在TP多核苷酸激酶的作用下，可以加上放射性的标记。

第三章（3）磷酸酶的应用Techniques基因工程技术末端标记前处理Outline防止分子自身环化DNA1比较与（4）BAPCIAP、电泳

2失活、分子杂交30min：

activeCIAPBAP℃）热稳定性（65：

3、转化与转染

4、核酸测序

5、核酸外切酶第七节DNA扩增---PCR

6、核酸-蛋白相互作用切酶Exonucleases（核酸外1.）

第一节定义:

电泳一类从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核

原理：

通过电场的作用使带电的大分子在电泳介质中苷酸的酶。

运动。

目的：

根据带电分子的分子量、电荷及构型分离不同分类：

单链的核酸外切酶

的分子（依据不同的凝胶体系）双链的核酸外切酶。

电泳的分类：

第八节核酸内切酶

琼脂糖凝胶电泳（agarosegelelectrophoresis核酸酶1.S1），特点：

（1）

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamidegelAgarose与PAGE的不同：

分辨率PAGEelectrophoresis，）

操作

应用：

RFLP,AFLP,DD-PCR,琼脂糖凝胶电泳（agarosegelelectrophoresis）sequencing,primer

extension,S1mapping,RNaseprotectionassay…ds-DNA的：

目

分离不同长度的DNA片段第二节分子杂交确定DNA片段的长度a.一.分子杂交概述确定b.DNA的有无与多少

（1）定义c.分析酶切产物

分子杂交（molecularhybridization:

凝胶电泳的原理略）：

不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非电泳步骤

共价键的结合。

根据这一原理发展起来的各种技术统第一步：

制胶

称为分子杂交技术。

第二步：

样品制备

（2）第三步：

点样用途

形成第四步：

跑电泳DNA／DNA（DNA／RNA）杂种分子，可以用来第五步：

紫外灯下检测，拍照a.检测特定生物体之间的亲缘关系。

第六步：

数据处理

b.揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

缓冲体系：

TAE,pH8.0,~50mM-Tris,Acetate,EDTAc.对目的基因进行相对定量。

d.对特定蛋白质进行定性及定量分析TBE,pH8.0,~50mM-Tris,Borate,EDTA（3）杂交的基本步骤

以核酸分子杂交为例：

影响迁移率的因素：

凝胶电泳分离的DNA/RNA凝胶的孔径

吸印,转膜（通过毛细管作用或电导作用电压）DNA片段长度及结构探针标记的影响EB

杂交

检测分辨率影响因素：

（4）.琼脂糖浓度种类

Southern:

DNA-DNA缓冲液或样品的盐离子浓度Northern:

DNA-RNA核酸上样量Western:

Pr-Pr电压

二（.Southernblottingpoly-acrylamidegel泳电胶胺烯聚丙酰凝1.SouthernBlotting）PAGEelectrophoresis，

（1）范围：

短片段目的：

检测特定DNA序列。

分辨率：

1bp

（2）类型：

原理：

电泳分离DNA，并将之转至尼龙膜上，以标记好的探针（变性胶（长度）、DNA）与之杂交。

非变性胶（长度、构型）（3）DNA、2、1变性胶：

含尿素；步骤Protocols样品经甲酰胺与热处理；

a.、电泳保持温度。

3基因组DNA制备

酶切消化b.DNA．

c.琼脂糖凝胶电泳分离DNA片断RPA有NorthernBlot无法比拟的优势：

过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应d.碱变性，中和

更加完全。

到固相支持物e.转移DNA（如，尼龙膜）

RPA比NorthernBlot灵敏15－150倍，适合检测各种表达水平之基因。

f.杂交反应

RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一放射自显影g.情况下的差异表达。

h.数据分析

2.OtherDNAanalyses一次RPA就能完