骨髓间充质干细胞的转染.docx

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骨髓间充质干细胞的转染

第一大肠杆菌感受态的制备

转化是将外源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段。

受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能容许外源DNA分子进入的感受态细胞。

一，实验材料：

1，LB液体培养基：

称取蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,溶于800ml去离子水中，用NaOH调节PH到7.5，加去离子水定容至1L,高压灭菌20min.

2，LB平板培养基：

LB液体培养基中按1.5%的浓度加入琼脂，加热溶解，进行高压灭菌。

取出后趁热在无菌条件下，倒入无菌的平皿中，每套平皿中加入12-15ml，凝固后倒置，4℃冰箱保存备用。

3，0.1mol/lCaCL2溶液：

称取1.1g五水CaCL2用双蒸水溶解，定容到100ml.高压灭菌20min.

二，实验步骤：

1，从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单个菌落，接种到3-5mlLB液体培养基中，37℃震荡培养12h左右，直至对数生长期，然后将该菌液以1：

100（1：

50）接种到100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养2-3h至OD600nm=0.5

2，培养液在冰上冷却10min,转入离心管中，4℃下，4000r/min离心10min.

3,弃去上清液，用预冷的0.1mol/lCaCL2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min.

4,4℃下，4000r/min离心10min.

5,弃去上清液，加入300μl预冷的0.1mol/lCaCL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即制成感受态细胞悬液。

6，以上制备好的细胞悬液可在冰上放置，24h内用于转化实验，或添加冷冻保护剂（15-20%）后超低温-70℃冷冻贮存。

第二，将带有目的基因的载体质粒转化到感受态大肠杆菌中。

1，取200μl感受态细胞悬液（若是冷冻保存液，冰浴中使其解冻，解冻后立即进行下面操作）加入载体质粒溶液（含量不超过50ng,体积不超过2μl）.

2，将含有混合液的离心管轻轻摇匀，冰上放置30min后，42℃水浴中热冲击2min,然后迅速置于冰上冷却3-5min.

3，向各管中加入100μlLB液体培养基，使总体积约为0.2ml,即制备成转化反应原液，混匀后37℃温浴15min以上，震荡培养。

此时细菌回复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。

第三，质粒菌落的准备

1，LB培养基的配制：

称取胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g.加入适量去离子水摇动容器至容器溶解，然后用5M（mol/l）氢氧化钠调节ph到7.0，然后用去离子水定容到1L,待上述溶液完全溶解后，向另一广口瓶中加入琼脂粉，每100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉。

进行高压灭菌后，将融化的LB固体培养基在55℃水浴中，待培养基温度将至55℃即授课触摸，加入抗生素，每100mlLB培养基中加入1ml100mg/ml的卡那霉素（1g/1000ml），充分摇匀。

2，LB培养板制作：

将加入抗生素的LB培养基充分摇匀后倒入90x25mm2皿中10-20mlLB,倒板后打开盖子半盖状态，在紫外灯下10-15min.最后封口，4℃保存。

3，划板接种菌：

用接种环取新鲜培养的菌落或甘油菌液，划板接种到卡那霉素（千分之一）的LB平板上，37℃温箱孵育16-18h（一般12h开始生长菌落，时间以菌落生长状态判断。

），将平板应该反放，注意不可让菌落长太大。

4，摇菌：

（1）首先将卡那霉素2ml,解冻，然后加于200ml高压灭菌后的LB液体培养基中，摇匀，然后用5ml移液枪分装两个10ml离心管，每管5ml含卡那霉素的LB培养基。

然后立即对LB液体培养基的容量瓶封口，并酒精擦拭火焰消毒。

在使用5ml移液器过程中，枪头不可碰到容量瓶或离心管壁。

（2）其次，用10微升或0.5-1微升的抢吸取培养板上的单个菌落，然后将枪头在10ml离心管中晃动数次，将枪头打入10ml离心管中。

（3）最后，对10ml离心管封口，用记号笔记下操作时间，操作质粒菌的名称，顺序。

（如：

2011，8，17a/bs3）

（4）将接种取完的菌板封闭放于4℃，将含有卡那霉素的LB培养基放于4℃，将10ml离心管管口封闭好，用报纸包扎放于塑料泡沫中，放入摇床，37摄氏度，200r,摇16-18h（目的是使细菌快速生长，并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

）

5，储备甘油菌：

制备10-15%甘油菌液，将高压灭菌好的甘油放于4℃保存，然后将摇过的菌取出，将甘油与菌液一同放入无菌操作台中，在灭菌条件下，用剪刀剪1ml枪头一个小斜口，然后吸取400微升甘油放于3ml菌液中，然后进行涡旋震荡，待甘油菌液混匀后，将甘油菌液封口，记下标记放于-20℃保存。

注意事项：

1，卡那霉素使用时，首先应分装到ep管中以100mg/ml,每管3ml浓度放入5ml管中，-20℃保存。

第四，质粒DNA分子的大量提取

1，准备材料：

已经制备好的600ml菌液，TIANGEN（endofreeplasmidkit,K9428无内毒素质粒大提取试剂盒），20个50ml离心管，

5ml枪头，200微升枪，枪头（用于吸取RnaseRNA）,计时器，吸水纸，五水酒精，异丙醇，废液钢。

2，操作步骤：

（1）取过夜培养的菌液加入50ml离心管中，配平（tem；21℃，prog:

0,speed:

8000rpm）,time:

3min。

收集菌液尽量吸除上清，由于菌液较多可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中，菌液量以能够充分裂解为佳，菌液过多会导致裂解不充分从而降低质粒的提取效率。

（2）尽量吸除上清，为了确保上清液全部吸除，可以用干净的吸水纸吸去瓶壁上的水滴。

（3）向溶液P1中，用200微升的枪吸取RnaseA加入其中，放置到圆周振荡器或移液枪吹打，混匀。

（4）向留有菌体沉淀的离心管中加入7ml溶液P1（已经加入RnaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀（使用5ml枪时，可以调3.5ml，即加两次即可，以节约中间调枪时间），一定要彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块会影响裂解效果，从而引起提取量和纯度低。

（5）向离心管中加入7ml溶液P2，立即温和的上下翻转6-8次，轻轻混匀，室温放置5min,不要剧烈震荡，以免污染基因组DNA，此时菌液变的清亮粘稠，若未变清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，以后应减少菌液量。

（6）向离心管中加入7ml溶液P4，立即温和上下翻转6-8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，然后室温放置10min左右，800rpm,离心5-10min,然后将溶液倒入过滤器CS中，在倒入过程中过滤口下面应放置50ml离心管，慢慢推动推柄过滤，然后将滤液收集到自带的干净50ml离心管中，如果菌体过多（多于100ml）,建议延长离心时间20-30min.

（7）柱平衡处理，在（6）离心过程中，向吸附柱CP5中（吸附柱放入50ml离心管中）加入25ml的平衡液BL，8000rpm,（8228g）离心2min，倒掉离心管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（对于平衡处理过的柱子最好立即使用）

（8）在（6）的滤液中加入0.3倍滤液体积的异丙醇（加入异丙醇过多易引起RNA污染），上下颠倒混匀后转移到平衡后的含有50ml收集管的吸附柱CP5中。

（吸附柱CP5的最大容积是15ml,可以分2次过柱，称量调平，室温8000rpm,8228g）,离心2Min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：

在进行分2次过柱，每次均按以上条件进行。

（9）向吸附柱中加入10ml漂洗液PW（使用前按照说明加入五水乙醇）8000rpm（8228g）离心2min,弃掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

（10）重复步骤（9）

（11）向吸附柱中加入3ml五水乙醇，目的除去杂质，室温8000rpm（8228g）离心2min,倒掉废液。

（12）将吸附柱CP5重新放回收集管中8000rpm（8228g）离心5min,目的是将吸附柱中残余漂洗液去除。

注意：

漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR等），为确保下游实验不受残留乙醇的影响，建议将吸附柱CP5开盖，置于室温放置数分钟，从而彻底晾干吸附柱材料中残留的漂洗液。

（13）将吸附柱CP5置于一个干净的50ml收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加1-2ml洗脱缓冲液TB，室温放置5min,然后室温8000rpm（8228g）离心2分钟，将50ml离心管中的洗脱液全部移入一个干净的1.5ml离心管中，-20摄氏度保存。

注意：

洗脱液用量大多少主要依据拷贝数以实验所需要的浓度来确定，洗脱缓冲液体积不少于1ml,体积过小会影响回收效率。

第五，大量质粒DNA的产物纯化

实验材料：

（1）TIANGEN大量DNA产物纯化试剂盒（规格50次）

（2）酶切反应体系：

灭菌蒸馏水55μl；x20管即1100μl

buffer（10x）10μl;x20管即200μl

质粒30μl,x20管即600μl

酶（15μl/管）3-5μl，x20管即100μl

总体积2000μl

1μg质粒需要至少5IU酶进行消化（1μgλDNA=5iu酶），质粒浓度0.3μg/μl（30μl即9μg）,30μl质粒即需要至少5IU酶，TAKARA的酶是1μl=10iu（150iu/瓶），酶切时酶的量为十倍量使用。

但是酶的用量不应大于反应体系的十分之一。

（3）冰浴盒，1ml枪头（枪），200μl枪（枪头），5ml离心管，1.5ml离心管（20个），0.5ml离心管20个，20μl枪（枪头），废液钢

（4）DNA线性化回收体系：

漂洗液PW（操作前先往15mlPW中加入60ml无水乙醇）

平衡液BL

结合液BL

洗脱缓冲液EB

吸附柱CB3

收集管（2ml）

调节水浴锅为37℃。

实验步骤：

1，酶切体系的配制:

将20管的酶切体系放于5ml离心管中，在冰浴上进行操作，吹打混匀，分装到20个管（100μl/管），短暂离心2-3s,取出置入到37℃水浴中，放置2h.

2，酶切DNA线性化处理

（1）柱的平衡：

向吸附柱CB3中加入500μl平衡液BL，12000rpm（13400g）,1min,倒掉收集管中废液，将吸附柱重新放回收集管中（当天使用）

（2）向每管酶切反应体液（100μl）中，加入5倍体积（500μl）的结合液PB,充分混匀。

（3）将

（2）中混匀溶液加入吸附柱中（20个），（吸附柱CB3的容积为800μl）,室温放置2min,12000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（4）向吸附柱CB3中加入600μl已事先加有五水乙醇的漂洗液PW，然后室温静置2min,12000rpm30-60s,倒掉收集管中废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

（5）向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW,12000rpm,离心30-60s,倒掉收集管中的废液。

（6）将离心吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（1340g）离心2min,尽量去除漂洗液，将吸附柱放入室温晾干。

（7）取出吸附柱CB3放入一个干净的离心管1.5ml中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液EB，室温放置2min,1200rpm,收集DNA液（加入洗脱液不少于50μl）.

（8）为了提高DNA回收量，可将离心得到的溶液重新加到离心吸附柱中，重复步骤。

3，DNA浓度及纯度检测：

OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA或40μg/ml单链DNA.

回收5-6μl放入ep管中，用于检测浓度防止反复冻融。

（1）首先用超纯水冲洗比色