微生物制药 复习要点.docx

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微生物制药复习要点

第三章

●药物（Medicine）

用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：

预防药、治疗药、诊断药和康复保健药。

●药品（drug）

直接用于临床的药物产品，是特殊商品。

药品应规定有适应症、用法与用量和疗程，说明毒副反应。

还要有使用有效期，过期药品不准使用。

传统中医理论

●人体的正常生命活动是阴阳两方面保持动态平衡的结果,疾病发生的原因是阴阳失去平衡、出现偏差而造成的。

为了说明人体的复杂关系,传统的中医理论还引进了“五行学说”,认为肝属木、心属火、脾属土、肺属金、肾属水。

用五行学说的相生相克关系来说明人体的生理及病理变化,并将其用于指导临床的诊断和治疗。

西医理论

●西医以物质的存在为基础，包括宏观世界和微观世界，神经、血管、生物电流、射线等都是客观存在的，能够反复验证。

新药包括：

中药、化学药品、生物制品（选择或判断）

一类新药、二类新药、三类新药、四类新药、五类新药

新药的申报与审批（考小题）

1、新药的申报：

完成Ⅲ期临床试验后经国家药品监督管理局批准，即发给“新药证书”；持有“药品生产企业许可证”，并符合GMP要求的企业或车间可同时发给批准文号，取得批准文号的单位方可生产新药。

2、加快程序审评：

一类新药。

3、新药生产：

第一类化学药品及第一、二类中药批准后一律为试生产，试生产期为2年。

其他各类新药一般批准为正式生产。

4、新药的补充申请：

增加规格、改进生产工艺、改变包装等。

5、新药保护：

一类新药12年，二、三类为8年，四、五类为6年。

GMP是《药品生产质量管理规范》英文名GoodManufacturingpractices的缩写。

它是指从负责指导药品生产质量控制的人员和生产操作者的素质到生产厂房、设施、建筑、设备、仓储、生产过程、质量管理、工艺卫生、包装材料与标签，直至成品的贮存与销售的一整套保证药品质量的管理体系。

•GMP的基本点是为了保证药品质量，防止生产中药品的混批、混杂污染和交叉污染。

其他药品管理规范

GLPGoodLaboratoryPractice药品非临床研究质量管理规范

GCPGoodClinicPractice药品临床试验管理规范

GSPGoodSupplyPractice药品供应质量管理规范

GUPGoodUsePractice药品使用质量管理规范

GDPGoodDiposePractice药品调剂质量管理规范

GIPGoodImportPractice药品进口质量管理规范

第四章

微生物药物：

A.微生物在其生命活动过程中产生的生理活性物质及其衍生物

B.以微生物合成的天然母核，通过生物或化学改造获得药物

Waksman首先定义抗生素：

抗生素是微生物在其代谢过程中所产生的、具有抑制它种微生物生长及活动甚至杀灭它种微生物性能的化学物质。

稀有放线菌（rareactinomycetes）：

除链霉菌属外的其它属的放线菌。

是产生微生物新药的重要源泉。

●根据抗生素的生物来源分类：

（1）放线菌产生：

链霉素

（2）真菌产生：

青霉素

（3）细菌产生：

放线菌素

（4）植物及动物产生：

蒜素、黄连素

●根据抗生素的化学结构分类：

（1）β-内酰胺类抗生素

青霉素、头孢菌素、硫霉素、亚胺培南

（2）氨基糖苷类抗生素

链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素

（3）大环内酯类抗生素

红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素

（4）四环类抗生素

四环素、金霉素、土霉素

抗生素的生产途径：

第一条途径：

微生物发酵

目前大多数抗生素采用该工艺，其特点是成本低，周期长。

第二条途径：

全化学生产工艺

结构相对简单的抗生素可采用此工艺。

第三条途径：

半合成生产工艺

利用化学法修饰改良生物合成的抗生素，扩大抗菌谱、提高疗效、降低副作用等。

抗生素一般制备过程

初步纯化方法：

沉淀、吸附、萃取、超滤

精制方法：

层析、电泳、结晶

1、

β-内酰胺类抗生素

β–内酰胺环的特点：

●使化学性质不稳定

●易发生开环导致失活

●发挥生物活性的必需基团β-内酰胺环开环与细菌发生酰化作用，抑制细菌的生长。

●经典β–内酰胺的分类包括：

–青霉素（西林）类（Penicillins）

–头孢菌素类（Cephalosporins）

●非经典β–内酰胺的分类包括：

-碳青霉烯（Carbapenem）

-青霉烯（Penem）

-氧青霉烷（Oxypenam）

-单环的β-内酰胺（Monobactam）

制备工艺

1、菌种

最早的原始菌种是点青霉菌（Penicilliumnotatum）；现用产黄青霉菌（Pen.chrysogenum）

按菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。

国内青霉素生产厂大都采用绿色丝状菌。

3、发酵工艺要点（重要）

•种子：

砂土孢子接入斜面上，25℃培养6～7天，制成悬液，接入大米茄子瓶内，经25℃培养6～7天，制成大米孢子，真空干燥。

•生产时按接种量移入种子罐，25℃培养40～45小时，菌丝浓度达40%以上，移入繁殖罐内。

•经25℃培养13～15小时，菌丝体积40%以上，残糖在1.0%左右，无菌检查合格便可作为种子，按30%接种量移入发酵罐。

培养基（了解）

•碳源：

提供能量

如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。

乳糖能被产生菌缓慢利用而维持青霉素分泌的有利条件，故为最佳碳源，但价格高，普遍使用有困难。

天然油脂如玉米油、豆油也能被缓慢利用作为有效的碳源，但不可能大规模使用。

目前生产上用的碳源是葡萄糖母液和工业用葡萄糖。

•氮源：

提供蛋白合成原料玉米浆。

现因国内玉米浆产量少，经调整配方以花生饼粉代替，生产水平也可达到技术指标。

目前生产上用的氮源是花生饼粉、麸质、粉

玉米胚芽粉及尿素等。

•前体

作为苄青霉素生物合成的前体有苯乙酸、苯乙酰胺等。

它们一部分能直接结合到青霉素分子中。

这些前体对青霉菌都有一定的毒性，加入量不能大于0.1%。

加入硫代硫酸钠能减少它们的毒性。

无机盐

•①硫和磷:

硫浓度降低时青霉素产量减少3倍，磷浓度降低时青霉素产量减少1倍。

•②钙、镁和钾：

青霉素的生物合成中合适的阳离子比例以钾30%、钙20%、镁41%为宜。

如镁离子少，钾离子多时，菌丝细胞将培养基中氮源转化成各种氨基酸的能力强。

钙离子影响细胞的生长和培养基的pH。

•③铁离子：

铁易渗入菌丝内，它对青霉素发酵有毒害作用。

发酵液中铁含量6微克/毫升时无影响；60微克/毫升时降低产量30%；300微克/毫升时降低产量90%。

3、培养条件控制（理解）

产黄青霉菌分三个不同代谢时期。

①菌丝生长繁殖期:

②青霉素分泌期:

菌丝生长趋势减弱，间隙添加葡萄糖作碳源和间隙加入花生饼粉、尿素作氮源，并间隙加入前体，此期间球状菌pH要求6.6～6.9，丝状菌pH要求6.2～6.4，青霉素分泌旺盛。

③菌丝自溶期:

控制要点：

（了解）

1）加糖控制：

一般残糖降至0.6%左右、pH上升后可开始加糖。

2）补料及添加前体：

丝状菌发酵于接种后8～12小时，发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05～0.08%。

3）pH控制：

主要通过加葡萄糖控制pH

4）温度控制：

青霉菌生长最适温度高于青霉素分泌的最适温度。

种子罐培养丝状菌要求25℃，发酵罐培养丝状菌要求26℃-24℃-23℃-22℃，前期罐温高于后期。

5）通气与搅拌深层培养需通入一定量空气，并不停地搅拌以保证溶氧的浓度。

试验证明，中、后期减慢转速对球状菌的生理生化代谢有利，它能提高发酵单位，并能节约能源。

6）泡沫与消沫用化学合成消沫剂——“泡敌”等

维生素C的生产工艺

1、莱氏法化学合成工艺

􀂄双酮糖法

􀂄D-葡萄糖为原料，经过催化氢化生成D-山梨醇，然后生物氧化转变为L-山梨糖，酸性液中丙酮化，对α,β-二仲醇进行保护。

􀂄高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮-L-古洛糖酸，除去丙酮，内酯化和烯醇化，得L-抗坏血酸。

􀂄整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。

2、两步发酵工艺

􀂄1975年由我国科技人员发明，属我国独创。

􀂄20世纪70年代后期投产，国内企业普遍采用，成为国内维生素C生产的主要方法。

两条工艺的比较

􀂄以生物氧化取代化学氧化，工艺简洁。

􀂄省去了丙酮化反应和氧化反应维生素C工艺路线。

􀂄节约丙酮、硫酸、高锰酸钾、氢氧化钠等原料试剂，防爆设备。

􀂄三废和污染小，提高了生产能力。

两步发酵生产工艺过程

1、D-山梨醇的化学合成

􀂄策略：

山梨醇和葡萄糖都是6碳糖类化合物，二者差别在于C1基团。

D-葡萄糖C1上醛基还原成醇基，即D-山梨醇。

􀂄原理与方法：

催化氢化D-葡萄糖，控制压力，在氢作还原剂、镍作催化剂的条件下，将醛基还原成醇羟基，从而制备D-山梨醇。

工艺——催化氢化

􀂄配料：

70－75℃；搅拌，50％葡萄糖溶液；加入活性炭，过滤，石灰乳调节pH8.4

􀂄压入氢化反应器，加入Raney镍催化剂，

􀂄通入氢气，3.43×106Pa,104℃

􀂄不吸收氢气为反应终点

􀂄提取：

静止沉降，除去催化剂，离子交换、脱色，减压浓缩。

60－70％黏稠液体。

􀂄质控：

比旋度，控制副反应甘露醇含量。

􀂄葡萄糖差向异构化形成甘露糖，被还原成甘露醇。

2、第一步发酵

􀂄原料：

D-山梨醇；产物：

L-山梨糖

􀂄策略：

C-2位羟基氧化为羰基，其他基团不变，微生物转化

黑醋酸杆菌。

G_，生长30－36℃，最适30－33℃。

斜面保存，0～5℃冰箱。

种子培养，30～33℃振荡48h。

菌形正常，无杂菌，方可生产

发酵工艺

􀂄种子扩大培养，接入发酵罐，种子和发酵培养基主要包括山梨醇、玉米浆、泡敌、酵母膏、碳酸钙等成份，pH5.0－5.2。

􀂄山梨醇浓度控制在24～27%温度29－30℃通气27%，2930℃，比为1：

1～0.7VVM。

􀂄测定发酵液中山梨糖，当浓度不再增加时，结束发酵，约10h。

􀂄D-山梨醇转化L-山梨糖的生物转化率达98%以上。

􀂄发酵液经低温60℃灭菌20min，冷却至30℃，作为第二步发酵的原料。

3、第二步发酵

􀂄策略：

L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。

􀂄许多微生物能使L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。

菌种特点

􀂄活力最强：

醋酸杆菌、葡萄糖酸杆菌和芽孢杆菌。

􀂄工业生产中，采用氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）和巨大芽孢杆菌（俗称大菌）搭配使用两种混合菌培养，产物收率达最高水平。

􀂄单独使用一种菌，一般产量很低。

􀂄葡萄糖酸杆菌：

革兰氏阴性，生鞭毛或不具鞭毛，pH4.5时生长。

最适生长温度30～35℃（弱氧化葡糖酸杆菌）或18～21℃（氧化葡糖酸杆菌）。

发酵工艺

􀂄种子和发酵培养基的成份类似,主要有L-山梨糖、玉米浆、尿素、碳酸钙、磷酸二氢钾等，pH值为7.0。

􀂄大、小菌经二级种子扩大培养，接入含有第一步发酵液的发酵罐中，29－30℃下通入无菌空气。

􀂄发酵后期菌体活力下降，生产能力减慢，根据产酸浓度和残糖及时结束发酵。

􀂄培养72h左右，温度略高（31－33℃）、pH在7.2左右、残糖量0.5-0.8%以下，即为发酵终点。

􀂄由L-山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸转化率达70－85%

维生素C的精制

􀂄脱色：

粗维生素C溶解后，加入活性炭（粗维生素C﹕活性炭=1﹕0.05，重量比），搅拌。

􀂄结晶：

保温压滤至结晶罐内，冷却至45～50℃，加入晶种，缓慢冷却至－2℃

􀂄过滤离心：

冰乙醇洗涤

􀂄干燥：

低温或真空干燥

􀂄成品：

过筛包装，得精品维生素C

􀂄收率90％。

第五章

基因工程菌药物的特点

􀁺用于注射用的治疗蛋白要求高度纯化，病人可能产生的强的免疫反应或副作用是灾难性的。

􀁺有的蛋白转译后还要进行修饰，如糖基化、磷酸化后才有活性。

􀁺治疗蛋白最主要的是保证产品的质量和安全，这些产品大多用量很小，价格高，附加值高。

基因工程菌生产的特点

三、基因工程菌中基因的不稳定性

􀁺基因工程菌带有外源基因，外源基因可能在质粒上也可能整合到染色体上，这些基因可能不稳定。

丢失外源基因的菌往往比未丢失的菌生长快得多，这样就会大大降低产物的表达。

为了抑制基因丢失的菌的生长，一般在培养中加入选择压力，如抗生素。

􀁺基因工程菌的培养一般分两段。

前期是菌体生长，生长到某一阶段，加入诱导因子，诱发产物表达。

四、基因不稳定性

生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致基因的不稳定性。

基因的不稳定性原因：

􀁺分离丢失、

􀁺质粒结构不稳定性

􀁺宿主细胞调节突变

重组大肠杆菌的高密度培养策略

关键点：

高密度、高表达

菌密度的测定：

光密度（OD值或A值）在波长600～660

菌生长的障碍：

􀁺重组菌携带外源基因，加重代谢负担，生长缓慢

􀁺重组蛋白不能分泌到胞外，外源蛋白在菌体内合成后就会造成积累。

高表达的外源蛋白尤其是高度疏水性蛋白对菌体有害，对细胞生长有抑制作用，甚至会导致细胞中毒或死亡,因此工程菌的比生长速率往往远小于宿主菌。

高表达的障碍是：

外源基因的不稳定，造成表达的下降。

低生长速率与高表达之间的矛盾

乙酸的产生

蛋白的降解

高密度培养的措施

分批补料培养以分批培养为基础，吸取了连续培养的优点，可消除高浓度底物对细胞生长的抑制作用，还可弥补低浓度底物限制细胞生长的缺陷，从而有效地控制了菌体的生长过程。

因此，要实现重组大肠杆菌的高密度培养，最常用和最有效的方法就是分批补料流加培养法。

现在常用的是反馈补料培养。

有几种反馈控制：

控制基质浓度流加、恒pH流加、恒溶氧流加、控制比生长速率的葡萄糖流加

1、控制基质浓度流加

用专门的电极维持基质浓度（如葡萄糖、乙酸、氨等）。

以葡萄糖为例，用葡萄糖电极检测发酵液中的葡萄糖含量，葡萄糖电极通过反馈系统与补糖单元相连。

当葡萄糖浓度在设定值之上，糖阀关闭；当葡萄糖浓度由于菌体消耗低于设定值时，糖阀开启，葡萄糖以一定速率加入。

这样，发酵液中的葡萄糖浓度始终保持恒定，可避免葡萄糖的抑制效应，达到很高的细胞浓度。

2、恒pH流加

大肠杆菌在LB培养基上生长，pH会上升。

这是由于菌体分解LB培养基中的胰蛋白胨，造成氨积累的原因。

因此用葡萄糖代替酸液进行恒pH流加。

这种方法的缺点是葡萄糖浓度往往不易控制，容易产生乙酸，对某些工程菌不适宜。

3、恒溶氧流加

用复膜氧电极来控制补糖。

当培养液的氧饱和百分数高于控制点，糖阀开启，以一定速率补

糖。

加入的糖被菌利用则需要更多的氧，从而减少氧饱和百分数，引起读数下降。

当读数下降到控制点以下，糖阀关闭，需氧就会随之减少，氧的饱和百分数逐渐上升，从而达到供需平衡。

Konstantinov等进一步发展了这种方法，用DO-state法间歇流加葡萄糖，通过控制溶氧、搅拌转速及糖流加速率，使乙酸维持在低浓度，从而获得高密度和高表达

4、控制比生长速率的葡萄糖流加

菌体的比生长速率与代谢产物的表达密切相关。

比生长速率太大，超过某一值，易产生乙酸，这一比生长速率值称为菌体的乙酸产生临界比生长速率。

通过考察得出最优比生长速率，控制溶氧、转速、补糖来控制比生长速率。

第八章

动物细胞培养方式

贴壁培养、悬浮培养、微载体培养、其他方式（微囊化培养、包埋培养）

原代培养

􀁺用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养。

􀁺这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经酶消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。

原代培养是建立各种细胞系的第一步。

传代培养

􀁺离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。

􀁺传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：

2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。

􀁺贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。

植物培养细胞的生理特性

植物细胞重量的增加主要在对数期

次级代谢产物的累积主要在稳定期

植物细胞培养实例

西洋参属于五加科人参属植物，为名贵中药材之一，具有降血脂、镇静、造血及健胃作用，其所含的主要有效成分为皂苷，目前尚不能人工合成，但可通过细胞培养技术来制备。

工艺流程

西洋参根→无菌根→愈伤组织→悬浮细胞培养物→发酵液→细胞→西洋参细胞干粉成品

（1）西洋参细胞种质选择与处理：

取人工栽培的西洋参根，用小刷子于流动的自来水下充分洗净，然后将其切成50-100mm厚的片段，浸入70%乙醇中30秒，取出浸于5%安替福民（含有效氯5.25%的氯化钠溶液）、10%漂白粉或0.1%升汞溶液中10-20分，取出后用无菌水充分洗去消毒剂，备用。

（2）愈伤组织的诱导：

诱导西洋参愈伤组织的MS

培养基（MS培养基含有近30种营养成分）。

50mL三角瓶装量为20mL，琼脂浓度为0.8%，灭菌后备用。

然后取已消毒的西洋参根的片段，切成1mm厚，4-5见方的立方小块组织，再向每个培养瓶中接1g左右的小组织块，于25-26度培养20天后即长成愈伤组织。

采用同样培养基进行移植继代培养，移植过程每瓶均用同一块愈伤组织切割分散和接种培养。

如此往复循环，进行20-30次移植继代培养，即可获得多个西洋参愈伤组织无性系。

（3）西洋参细胞悬浮培养：

培养基为添加1.25mg/L2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、0.4mg/LKT（激动素）及0.7g/L酪蛋白水解物的MS培养基。

500毫升三角瓶装量为100毫升，酸度为5.8，在0.1MPa压力下灭菌15-20分，冷却至室温备用。

然后，在无菌操作条件下用50毫升培养基将每瓶西洋参愈伤组织无性系洗下并通过筛网流入无菌量筒中，沉淀10-15分，倾去上清液，下层细胞倾入含100毫升培养基的500毫升培养瓶中，接种量为1-2克/升细胞干重然后至摇床中，1于27-29度，以120转/分速度振荡，振幅为2.5厘米，培养20-25天后即得西洋参细胞悬浮培养物。

（4）西洋参大量培养：

培养基与细胞悬浮培养相同，反应器为10升通气搅拌罐，培养基充满系数为0.7-0.8，将上述悬浮细胞培养物直接接种至搅拌罐反应器中，细胞接种量为1-2克/升干重，在2729度下，以5070转/分搅拌27-50-速度及0.6-0.8立方米/立方米*分通气速度培养18-20天，即得西洋参细胞培养物。

（5）细胞收获与干燥：

细胞大量培养结束后，用过滤或离心方法收集细胞，用去离子水洗涤3-5次，每次抽干，然后于50度以下真空干燥或冻干，即得培养的西洋参细胞干粉，收率为3-5克升干重。

微藻营养模式

光能自养、混合营养、异养、光自养培养、异养培养、异养-光自养串联培养、混合营养培养