第六章无菌动物悉生动物和无特定病原体动物的特点及应用.docx

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第六章无菌动物悉生动物和无特定病原体动物的特点及应用

第六章　无菌动物、悉生动物和无特定病原体动物的特点及应用

第一节　无菌动物

　　一、无菌动物的大体概念

　　所谓无菌动物，确实是指不能检出任何活的微生物和寄生虫的动物。

从微生物学的观点看，通常实验动物的体内和体外带有寄生虫，体内还常带有细菌和病毒，而且还都难于排除某些潜在的传染病。

另外，一般实验动物的血清中含有抗体。

因此用并存一般动物进行医学科学研究，将会存在各类各样的干扰，实验结果往往不确切。

利用无菌动物作实验就能够够克服一般实验所存在缺点，使实验结果正确靠得住。

　　无菌动物是在无菌屏障系统中，剖腹掏出胎儿，饲养繁育在无菌隔离器中，饲料、饮水通过消毒，按期查验，证明动物体内外均无一切微生物和寄生虫（包括大部份病毒）的动物。

无菌动物的“菌”主若是指细菌，而严格来讲，还包括真菌、立克次氏体、支原体和病毒等微生物及各类寄生虫。

而所谓“无”却不是绝对的，只是是依照现有的科学知识和检查方式在一按时期内不能检出已知的微生物和寄生虫罢了。

随着科学技术的进展，此刻以为是无菌的动物或许以后能够检出微生物和寄生虫而不是无菌动物，因为那个“无”是相对而言的。

到目前为至，尚未确立无菌动物的微生物检定法，因此，研究者的检定方式各式各样，其中病毒和立克氏体的检查尚有相当多的问题。

例如，在无菌动物中供实验室利用最多的无菌小鼠，用电子显微镜检查证明，胸腺细胞中仍有存在白血病病毒的例子，因此，此刻的所谓无菌动物，指动物体内外未能检出细菌、真菌、原虫、内外寄生虫的动物较妥当。

　　用大量抗菌素也能够使一般动物临时无菌，可是这种动物不是无菌动物。

因为这种无菌状态往往是一过性的，某些残余的细菌在适当的条件下又会在体内增殖；即便能把体内细菌全数杀死，它们给动物造成的阻碍却是无法排除的，例如：

特异性抗体的存在、网状内皮肤系统的活化、某些组织或器官的病理转变等。

因此，无菌动物必需是生来就无菌的动物。

　　按对微生物的操纵的程度，能够将实验动物分为四类：

即（１）无菌动物（GermFree,GF）；（２）悉生动物或已知菌动物（Gnotobiotics,GN）；（３）无特定病原体动物（SpecificPathogenFree,SPF）；（４）通常动物（Conventional,CV）。

无菌动物和悉生动物饲养于隔离器中（隔离系统），无特殊病原体动物饲养于屏障系统，通常动物饲养于开放系统。

　　通常动物是在开放系统条件下饲养的，都受到自然界微生物和寄生虫的侵袭，一样都带细菌、病毒和寄生虫。

有的动物外观看起来健康，其实都隐藏着某些疾病或有微生物与寄生虫的感染。

因此用通常动物进行实验灵敏性差、反映性不一致，实验结果缺乏再现性。

要提高动物实验的准确性，就必需对实验动物在遗传和微生物两个方面加以操纵，培育出标准的合格动物，才能使实验结果正确靠得住，达到反映均一性和重复性。

采纳兄妹间近亲交配殖繁20代以上所培育的近交系动物，遗传均一、个体不同小、实验结果比较准确。

可是只从遗传上加以操纵，如不进行微生物操纵，没有排除自然感染的微生物和寄生虫的阻碍，实验结果仍可能不准确。

因此，在精度要求高的实验中，无菌动物、悉生动物和无特殊病原体动物就成了理想的实验动物。

表6－1　按微生物操纵程度的实验动物分类原那么

种类

饲养方法

说明

附记

无菌动物

隔离系统

以封闭的无菌技术取得，用现有方法不能检出任何微生物和寄生虫的动物。

悉生动物

隔离系统

确知所带的微生物丛（植物的和动物的）经特殊饲养的动物。

确知所带有的微生物

SPF动物

屏障系统

没有指定的致病性微生物和寄生虫的动物。

确知不带有的微生物

通常动物

开放系统

不明确所带的微生物、寄生虫的动物，赤称普通动物，但不得带有人畜共患的传染病病原体。

对微生物带有情况不明确

二、无菌动物的进展

　　无菌动物的产生和进展，已有近百年的历史，许多学者曾对肖椎动物和脊椎动物的无菌状态进行过反复的研究。

无菌动物的研究，起源于19世纪后期，1885-1886年间，确立了在动物体内没有微生物也能生存的概念。

1885年，Dudeaux曾将豌豆在无菌条件下进行栽培，证明无菌植物不能利用供给的养分。

同年Pasteur以为，动物在没有肠道细菌参与条件下不能生存。

1886年Neucki提出相反的观点，以为细菌关于动物的生存不是必需的。

因此展开了一场争辩。

约10年后，1895年Kijanizin在无菌代谢实验笼内饲养兔，给予无菌空气、饲料和水，兔的体重慢慢下降，并因负氮平稳而死亡。

同年Nuttall和Thierfelder经剖腹产取得豚鼠，饲养于玻璃罩内，每小时人工哺以灭菌牛奶和纯动物性饲料一次，共计8天，动物外观健康，将此动物于第8天处死，其肠内容物没有检出细菌。

1914年Cohendy也曾饲养过无菌豚鼠，可是没有取得成功。

14年后Glimstedt继续开展无菌豚鼠的研究，于1932年，终于把无菌豚鼠养活两个月，取得了初步进展，至1959年Teah在NotreDame大学已能使无菌豚鼠繁衍。

　　关于无菌鸡的培育，早在1897年Schottelius就曾取得，但没有继续养活。

1908年Cohendy育成无菌鸡，且生长情形良好。

1935年Kimura，Naito和Kobayashi在日本京都大学饲养了无菌鸡。

1944年Luckey和Lakey又开始进行无菌鸡饲料营养的研究。

1948年美国Lobund小组饲养的无菌鸡，成长后第一次产卵，并孵化出新的一代，从此饲养无菌鸡取得完全的成功。

　　由于1922年Baeot和Harden发觉无菌蝇蛆必需饲喂B族维生素才能正常生长，证明了无菌动物对B族维生素的需要，因为无菌动物肠内没有细菌存在，自身不能合成B族维生素，从而找到了过去的饲养无菌动物失败的缘故。

1937年Balzam在无菌鸡的维生素B族缺乏症及在鸡体内可否合成B族维生素的研究中，加倍清楚地证明了那个问题。

无菌动物对B族维生素需要的发觉是很有价值的，它推动了无菌动物培育工作的进展，并使之走向成功。

　　第一个无菌大白鼠群是美国Lobund小组于1951年成立的。

第二个无菌大白鼠群是Gustafsson于1956年在瑞典建成。

1959年Reyniers在Tempa大学成立无菌动物实验室。

印度的无菌动物群于1959年在印度大学医学中心成立。

　　随着无菌动物研究的开展，无菌动物的饲养装置也不断地改良。

1915年德国的科斯特第一次制造无菌动物培育隔离器。

1928年美国圣母大学细菌学实验室的Reyniers制造了不锈钢制的无菌动物大型隔离器。

从此开展了无菌动物的系统实验。

此刻美国有48个无菌动物研究单位，仅国立卫生研究院的5个研究所里，就别离设有无菌动物研究室。

1930年Gustafsson设计了第二型隔离器，整个隔离器的原料是不锈钢的。

在日本，自1946年开始培育无菌动物，1959年宫川用不锈钢做隔离器的主体部份，并附有小的玻璃观看窗和灵敏的机械手，使不锈钢隔离器达到比较完善的境界。

但这种隔离器既笨重造价又昂贵，不可能大量推行利用，因此也限制了无菌动物工作的开展。

在日本现有24个单位从事无菌动物研究工作，仅在东京就有9个无菌动物研究单位。

50年代，发明了用过氧乙酸进行表面灭菌的方式以后，1957年在美国印第安那州圣母大学Lobund研究室里制造了塑料膜隔离器，用无毒聚氯乙烯薄膜制造隔离器的主体部份。

由于这种隔离器制作方便，既轻便又有效，所需用费用又不高，仅为不锈钢隔离器的几十分之一，灭菌方式也大为简便，因此日渐普遍地取得应用，增进了无菌动物研究的进展。

　　1978年Lobund研究室的MorrisPollard博士来华讲学时给我国赠送了一具Trexler隔离器，中国医科院动物中心已仿造成功，上海、苏州等地也已制作成功，并已小批量生产。

近二年来，Trexler教授亲自来华讲学，教授隔离器和无菌动物饲养繁衍技术，增进了我国无菌动物研究的进展。

此刻北京、上海等地已有几个单位在研究无菌动物。

　　另外，澳大利亚、比利时、西德、苏联、捷克、英国、法国、意大利等国和地域，都已成立了包括无菌动物在内的实验动物中心。

　　对无菌动物的研究最初只是为了探讨高等动物与体内微生物之间的关系。

19世纪末,Nattal氏及Thierfelder氏用剖腹术掏出了怀胎豚鼠的胎儿，在无菌环境下饲养了10天。

随后，Schettelus发觉鸡的胚胎是无菌的，后来成功地进行了雏鸡的无菌化。

无菌动物所具有的独特优越性使其成为一种新型的实验动物。

随着生物学的进步和技术的进展，试行了各类动物的无菌化，此刻无菌动物的品种已经很多，不仅小鼠、大鼠、豚鼠和家兔等小动物已有无菌动物，而且狗、猫、猴、猪、山羊、绵羊和牛等大动物和鸡、火鸡、鹌鹑、青蛙、蛇乃至蚕、苍蝇、白蚁等也都有了无菌动物。

这些都是为了适应科学进展的需要而培育的，其中的小鼠、大鼠、豚鼠，国外一些发达国家已能大量生产，并比较方便地应用于日常研究中了。

已育成的无菌动物见表6-2。

表6-2　已育成的无菌动物

种　　类

培育者及育成时间

小　鼠

Pleasants,1959

大　鼠

Reyniers等，1946:

Gustafsson,1948;Pleasants,1959

豚　鼠

Miyakawa等,1958;Tanami,1959;Pnillips等,1959;Horton和Hickey,1961;Newton和Dewitt,1961

兔

Wostmann和Pleasants,1959;Luckey,1963

狗

Glimsedt,1946

猫

Bleby,1969

山羊、绵羊

Smith,1961,1966

猪

Whitenair,等,1960

马　驹

Drummond等,1973

猴

Reyniers,1942

鸡

Reyniers,1943

鹌　鹑

Woodard等,1965;Miles,1966

三、无菌动物的特点

　　只要饲料配备适当，无菌动物发育正常，外观和一般动物相同，可是其性能、结构和一般动物有专门大的不同。

无菌动物受两个因素阻碍，即微生物和因饲养比较聚集而致的肾上腺增大。

　　无菌动物的特点要紧反映在下面二个方面

（一）形态学改变

　　1．消化系统：

要紧转变在肠道

　　⑴无菌动物肠道肌层薄，更为特异的是盲肠肥大，比一般动物要大5-6倍。

无菌豚鼠的盲肠可达体重的1/3。

主若是由于肠壁薄、张力低而增大。

由于盲肠膨大，肠壁菲薄，常因盲肠扭转或肠壁破裂而死亡。

如给无菌动物注入梭状芽孢杆菌那么可缩小盲肠体积。

　　⑵肠粘膜绒毛增多。

　　⑶肝脏重量下降。

　　2．循环系统：

心脏相对缩小。

　　3．血液系统：

白细胞增加。

一般动物白细胞总数波动范围大，无菌动物白细胞数值恒定。

　　4．网状内皮系统：

脾脏缩小，无三级滤泡，网状内皮细胞功能降低。

（二）生理学改变

　　1．免疫功能：

由于网状内皮系统、淋巴组织发育不良，淋巴小结内缺乏生发中心，产生丙种球蛋白的能力很弱（在检查无菌动物的无菌性时，血清丙种球蛋白阴性能够作为无菌的一个辅助证据），又因为体内无微生物和寄生虫，血中无抗体，血清杀菌力低，吞噬细胞噬菌力也低，因此对微生物感染异样灵敏，某些病原性弱和必需经腹腔或颅脑接种才能感染一般动物的微生物很容易感染无菌动物。

　　2．生长率：

无菌条件下对不同种属阻碍不同。

无菌鸟类生长率高于同种的一般鸟类；无菌大小鼠与一般鼠差不多；无菌豚鼠和无菌兔生长率比一般者慢。

因肠内无菌，不能帮忙消化纤维素以提供机体所需要的营养。

　　3．生殖：

无菌条件对动物的生殖阻碍不大。

大鼠和小鼠因诞生无感染躯体较好；无菌豚鼠及兔比一般者繁衍力低，可能因大盲肠之故。

　　4．代谢：

血中含氮量少，肠管对水的吸收率低，代谢周期比一般动物长。

　　5．营养：

与动物品种有关，豚鼠和兔的肠道长，故有