拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应.docx

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拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应

1.题目：

拟南芥干旱胁迫的分子和生理分析揭示了植物生长对环境适应的初期反应

2.背景知识：

对由土壤水分亏缺引起的干旱，植物会表现出一系列的抗旱机制，进一步把这些抵抗行为分为干旱逃避和耐干旱两种。

干旱逃避是植物整个生长发育过程不与干旱相遇逃避干旱危害，即在干旱来临前完成生命周期的能力；或植物具有防御干旱的能力，以抵御干旱对植物的有害影响，使植物在干旱下仍能维持正常的生理状态（逆境排外）。

耐干旱是在植物组织低水势下抵抗水分亏缺的能力，植物可以通过代谢反应阻止、降低或修复由逆境造成的损伤，使其在逆境下仍保持正常的生理活动。

3.用来检验植物的耐受性和抗性反应的干旱处理方法有很多种：

累积干旱（pDr）即水分被抑制一段时间直到可以观察到萎焉症.这种干旱处理方法通常用来确定存活率或检测基因表达的变化。

然而，累积干旱（pDr）处理的一个缺点是，由于土壤水分湿度不能控制，它不能用来比较不同生长特性下不同基因型的行为功能。

为了模拟田间条件和量化干旱反应，可以利用以下方法：

可控制的干旱处理，就是使植物处于土壤水分亏缺的恒定水平，对植物非致死干旱反应的基因型和生态型进行评估。

4.材料与方法

1.生长条件和干旱处理

将拟南芥生态型（哥伦比亚）种子播于湿润的泥炭团中，分层的在4℃放置2天，然后转移至22℃10小时光照（100μmolem-2s-1）的培养室里。

实验的最开始，对做干旱处理的泥炭团在播种之前进行称重以确定泥炭团里的水分含量。

可控制的中等干旱条件（mDr）是给植物田间持水量的30%，即200%或每克干土壤含2克水。

5.为了做到这点，制作了一个半自动的系统：

一个天平连接在计算机上利用软件来操作，软件使输入的重量直接进入Excel系统，Excel软件运用一系列的方程计算每个称量的泥炭团中的含水量，最终需水量，所需加水量。

每天都需要对泥炭团进行称量，通过计算补充水分，使其维持在田间蓄水量的30%即mDr水平。

本实验分为三组：

第一组播种后（DAS）25天进行上述处理，第二组播种30天后处理，第三组播种35天后处理。

同时三组植物分别表现为：

8片叶子10片叶子、12片叶子。

6.对累积水分亏缺（pDr）处理，植物也是在上述培养室中培养，播种后35天不给于水分，泥炭团保持干燥，通过称量泥炭团的重量使其达到所需要的累积水分亏缺水平（pDr）。

在这项研究中进行两个水平上的测定：

萎焉水平和萎焉前一天（萎焉前水平）.

7.2.植物生长期生长率的测定

如上所述，植物在正常生长条件下生长，然后采摘不同时期的植物测其生物量。

第一组播种后25天采摘，第二组播种后30天采摘，第三组播种后35天采摘。

这些日期不像上面所述的干旱处理的时间，而是收获的真正时间。

两个不同发育时期的生长率：

播种后25-30天和播种后30-35天，利用公式计算：

相对生长率（RGR）=（lnW2-lnW1）/（t2-t1）

生长率通过生物量和叶面积来测定。

叶面积,通过扫描干旱处理和水分充足条件下的叶子利用J图像来测定。

通过计算相对膨胀率来描述生物量。

8.3.中等干旱条件下的脱落酸和JA突变体

在我们的中等干旱条件下可以检测到脱落酸缺乏和JA突变体的信号。

本实验用到的突变体有

abi1（SALK_076309C）,蛋白磷酸化酶，引起对ABA不敏感的显性突变

coi1（SALK_095916C）,对响应茉莉酮酸酯类是必须的

jin1（SALK_061267C）,

jar1（CS8072）inColbackground,腺苷酸形成酶，

abi1（CS22）,

aba1（CS21）inLerbackground玉米黄质环氧化酶，玉米黄质到紫黄质的环氧化，ABA合成的第一步

4.气体交换测定

在中等干旱条件下对五个时间点进行测定：

中等干旱（mDr）处理的-1,0,1,2,3天。

气体交换的测定在气体流动率为150μmoles-1,CO2400μmole,湿度为50%.的条件下用LICOR6400XT和拟南芥扩展室来测定。

9.5.生化分析

干旱条件和水分充足条件下植物进行淀粉分析，对植物在以下不同的时间点采样：

干旱处理（ＤＭＤ）的－１，０，１，２，３天水分充足的采样时间点同上。

采样在傍晚淀粉积累量达到最高值时进行.采样后将其保存在－８０℃。

将每个样本在液氮中研磨成良好的粉末，称重，然后利用酶染色淀粉试剂盒对每个样本进行定量分析。

脱落酸的量化即在以下不同的时间点采样：

中等干旱处理的第0，1，2天。

脯氨酸在中等干旱条件下第3,4天取样，用上述方法进行量化.

10.6.基因表达模式分析

7.拟南芥后基因芯片—基因探针图谱分析

8.启动子分析

9.基因功能富集分析

10.利用qRT-PCR进行基因表达分析

11．植物对适度干旱（mDr）的时间性反应

为了研究拟南芥对可控制的土壤水分亏缺性干旱反应，在不同的植物发育时期测定适度干旱（mDr）效果（见图1）。

根据控制植物水分的生长时期不同分为三类：

播种后25天、播种后30天、播种后35天。

这些生长时期相当于在拟南芥的6-叶期、8-叶期、10-叶期停止给植物浇水。

12．图2显示了适度干旱（mDr）处理和水分充足条件相比，最高的生物相对减少率是在播种后30天进行干旱处理的植物，播种后25天进行干旱处理的也很明显，播种后35天进行干旱处理对干旱的反应最不敏感（图2A）。

拟南芥生态型哥伦比亚植物的生长速率由两个发育时期决定的：

播种后25-30天和播种后30-35天。

植物的生长速率（生物量和叶面积）在第一发育阶段即播种后25-30天比第二发育阶段播种后30-35天高些。

（图2B）由图可以看出干物质积累和叶片扩张明显减慢，生长明显受阻。

RB：

生物量的相对减少率RGR:

相对生长率RER：

相对膨胀率DAS：

播种后的天数

13．

LRWC（叶片相对含水量）SWC（土壤含水量）DMD（mDr的处理时间）WW（充足水分条件）DRT（干旱条件）

在每个时间点测定植物样本和土壤中的相对含水量（图2C和D）。

14．叶子的相对含水量（LRWC）的测量值显示植物在mDr处理前1天开始感知干旱（图2C）.

在mDr的第0天（mDr的开始）叶子的相对含水量（LRWC）减少，一直持续到适度干旱处理后1天（图2C和D）。

然而，在适度干旱处理后第2天叶子相对含水量（LRWC）开始增加到水分充足条件的正常水平（图2C），土壤含水量从mDr处理后第1天开始直到mDr处理的最后一直保持恒定不变（图2D）。

15．激素途径突变体的干旱反应

在mDr条件下，敲除ABA信号传送和生物合成反应的基因的突变体在两组拟南芥中被测定。

在可控制的适度干旱（mDr）条件下和水分充足的条件下相比，生长的减少量（测定的生物量）为不同的基因型和野生型相比较提供了一个参数，辨别出了对干旱敏感/有抗性的变异的基因型。

生物量的相对低减率（RB）=（Ｂｗｗ－BDRT）/BwwBww是充足水分条件下生物量；BDRT是中等干旱条件下生物量。

16．

RB（生物量的相对减少率）WW（充足水分条件）DRT（干旱处理条件）WT（野生型）

ABA信号发送突变体（abil）和生物合成突变体（abal）和各自的野生型相比对干旱胁迫更敏感（图3A.B）。

17．

茉莉酸反应突变体coil和jinl在mDr处理的第10天显示了显著的干旱抗性（图3C和D）。

。

其它茉莉酸反应突变体jarl显示了干旱反应表现型但和野生型没有显著的差异。

这种茉莉酸突变体的反应和coil和jinl相比更加缓和，可能是因为jarl的等位基因并没有完全敲除而是一种氨基酸置换的突变体.

18．对mDr反应的气体交换参数的改变

Pn：

光合作用gs：

气孔导度Ci：

内部CO2浓度WW：

充足水分条件

19．在mDr处理后第1天气孔电导率下降至水分充足条件下的59%（图4A）。

在mDr处理前1天和处理的当天气孔电导率降低将近50%（图4A），并且会继续下降直到mDr处理后第2天，大约降低水分充足条件下的40%。

在mDr处理后第3天气孔电导率会增加到水分充足水平。

内部CO2

浓度也表现出同样的趋势（图4A）然而光合作用表现了不同的趋势，mDr处理后第1天没有下降，第2天和水分充足条件的相比下降了10%（图4A）.

20．在mDr处理后第1和第2天瞬时水分利用率（WUEi）比水分充足条件下高（图4B），在mDr处理后第1和第2天高于4μmolmmol-1

而水分充足条件下瞬间水分利用率大约为2μmolmmol-1，在-1,0,3瞬间水分利用率和水分充足条件下相同。

（图4B）

WUEi：

瞬时水分利用效率WW:

充足水分条件DRT:

干旱处理条件DMD:

中度干旱处理时间

21.植物对土壤水分亏缺的转录应答反应的描述

为了了解干旱胁迫下基因表达的整体效应，以mDr（第1天和第10天）和累积干旱条件下的小叶片为材料进行了微序列（基因芯片）分析。

不同的表达分析显示了在对mDr反应的早期（mDr处理后第1天）很多基因（2039个）都受到了显著地扰乱。

然而，在中等干旱胁迫持续了一段时期后（第10天）明显较少的基因（728个）表现出一些反应。

通过这些反应相对比，对累积干旱（pDr即萎焉）的反应中基因表达受到了严重的而影响：

7648种差异性表达（DE）基因-大约占基因组的30%-全都是已知的压力反应基因和程序。

22.首先在基因水平进行这三种反应（mDr处理后第1天，第10天，pDr）的比较（图5）。

mDr和pDr处理有178个共同的差异性表达基因（91个上调，87个下调）而mDr处理中有1083个特异的基因（545个上调，538个下调）。

23.在mDr处理后第1天和pDr处理中的上调基因是主要的水分缺失反应基因（q-值~1E-15），对ABA刺激（q~1E-12.6）,渗透压（q~1E-8.1）,寒冷（q~1E-4.1）和氧化（q~1E-2.5）的压力反应的重叠基因。

这些基因中其中几个表达动力学已通过qRT-PCR技术被证实。

在mDr处理后第1天和pDr的材料中我们已知的被干旱影响的细胞的基本过程包括DNA包装（q~1E2.6）,核糖体的生源（q~1E-2.9）和蛋白质折叠（q~1E-3.2）都被下调。

因此，植物具有对mDr的早期反应和对累积水分亏缺的经典反应是相似的。

但是，严重的影响包括光合作用基因（q~1E-20.7）下调及相关过程仅限于pDr。

24.大部分典型的水分亏缺反应的基因表达在mDr处理后第1天和pDr条件下是上调的，在相似的控制条件下，随着植物生长到持续mDr的第10天其中一些基因甚至被下调（q~1E-2.8）。

这些急剧变化的反应很可能是因为植物对持续压力的适应。

在这个阶段中，这些上调的基因中有几个激素（ABA）介导的信号发送基因（q~1E-2.1），这些基因可能介导了对环境的适应。

硫配糖体（q~1E-4）,IAA-衍生物（q~1E-2.9），JA（q~1E-2.8）和特定的长链脂肪酸（q~1E-2）的新陈代谢基因在mDr处理后第10天都是下调基因。

细胞壁增厚涉及到的一些基因（q~1E-2.9）和少数调节细胞生长的基因（q~1E-2.8）只有在mDr处理后第10天和mDrDay10-pDr条件下为下调基因。

这些都支持了一般而言持久的水分缺乏阻碍细胞生长的观点。

25.干旱反应基因的顺式调节

为了鉴定顺势调节因子可能介导已鉴定出来的干旱反应基因的转录调节，我们设计了一个转录因子探索传递途径：

（CRE-discoverypipeline）:

利用一个脱-新基序探索工具FIRE来发现新的因子，并把这些发现的因子和权威数据库已知的顺式因子作对比，取出顺式调节因子中有意义的序列.

分析mDr处理后1天、10天和pDr基因序列（进一步分为上调和下调）的顺式因子传递途径，来鉴定几个已知的和新发现的顺式调节因子（CREs）

26.顺式调节因子突显在mDr处理后第1天和pDr的上调基因中，这和实验鉴别的ACGT-包含在ABRE-（ABA响应元件）序列ACGTG（G/T）C中高度相似（见图5）。

在pDr-ABRE中位置6（G/T）的简并性恰好保留下来，而在mDrDay01-ABRE中它是严格的T.

有趣的是，mDrDay10的下调基因中发现的一个因子和ABRE-A（A/C）（A/C）RCGTG非常相似。

27.在mDrDay01的上调基因和mDrDay10的下调基因中发现另一个支持反向调节的因子和DRE/CRT-序列（A/G）CCGAC高度相似.

适度干旱处理后第1天（mDrDay01）中的上调基因中鉴别出的UPRE-类似因子给予了有力的证实。

与此相反，一种UPRE-类似因子在pDr的下调基因中被鉴别出来。

这里必须指出在mDrDay10和pDr条件下，下调基因中蛋白质折叠非常丰富，这证实了在这两个处理中蛋白质折叠是受影响的。

28.在mDrDay01上调基因和mDrDay10上调和下调基因中发现了两个富含AT序列的元件：

前者和光反应基因的顺式调节因子相似，后者和拟南芥中控制生理节奏的夜晚环境基因表达相似。

一种新的顺式调节因子（CRE）–（G/T）（A/C）CAGCT（A/C/G）（A/T）–在mDrDay10的下调基因中被鉴别出来，它非常丰富但是它的功能我们还不知道。

29.干旱胁迫下细胞的新陈代谢

总体的基因表达分析显示了在pDr-萎焉干旱条件下大量的光合作用基因下调，而在mDr条件下变化很不明显。

在拟南芥中多于50%的光合作用产物以淀粉的形式储存。

因此，我们检验两种干旱处理中关于淀粉的生物合成和降解基因表达的结果。

在pDr条件下，淀粉的生物降解中的两种酶即α-淀粉酶、β-淀粉酶，分别以log21.5、log23的速率表达。

在mDr条件下只有β-淀粉酶以log20.4的速率表达。

为了证实这些观察结果，在这两种干旱处理中对植物样本进行了量化。

在下午的后期采收生长期相同的植物体，即萎焉1天的植物和mDr处理后1天的植物。

淀粉分析表明在萎焉的植物中没有淀粉积累，而mDr处理后1天的植物淀粉累积量和正常植物差不多（具体数据未给出）。

30.对mDr处理以时间程序的气体交换测量显示了植物的光合作用速率几乎接近正常水平（图4A）。

因为拟南芥大于50%的光合作用产物都以淀粉的形式储存，因此在mDr条件下以时间程序进行的实验中我们需要通过淀粉的量化来确定气体的交换量。

淀粉的浓度在5个时间点来确定：

mDr处理的-1,0,1,2,3天，这些时间点的淀粉浓度和水分充足条件下相应时间点的淀粉浓度没有显著地区别（数据未给出）。

为了测定mDr条件下渗透压的适应性，在mDr的第3天和第4天对脯氨酸的含量进行了测定。

我们发现干旱处理条件下和水分充足条件下相比没有显著地变化。

31.因为脱落酸（ABA）是最重要的压力激素，我们也在mDr条件下以时间程序进行的实验中对ABA浓度的变化进行了测定。

在mDr处理的当天植物积累了很高浓度的ABA，浓度继续升高直到mDr处理后1天（见图8A），在mDr处理后第2天ABA浓度开始下降。

32.干旱胁迫下压力信号传送途径基因的表达

在pDr萎焉前（PPW）条件下和mDr条件下相比，ABA生物合成基因NCED3被多诱导了4倍（见图8B）pDr条件下与mDr条件下相比，干旱反应转录因子DREB2A被诱导至更高的水平。

在两种干旱处理中另一个基因RD29B显示了差异性表达，它在pDr条件下被诱导了将近100倍，而在mDr处理后第1天它变化了20倍（图8B）。

测定的其它压力信号传送基因的干旱反应表达水平在两种干旱处理条件下没有显著的不同（图8B）。

33.压力信号传送途径（ABA依赖型和非ABA依赖型）中的两种关键基因的表达水平在mDr处理分析中以时间程序被量化。

NCED3是ABA生物合成中的一种关键酶，它在mDr处理的第0天和第1天与第-1,2,3天相比被高度诱导表达（图8C）。

在mDr处理的当天（0day）ABF3（ABA依赖型途径中的基因）的表达量很高，之后它的表达量降低。

在非ABA依赖型途径中，DREB2A在第0天开始被诱导表达且持续到处理后第1天，之后它的表达量下降（图8D）。

34.NCED3,ABF3,和DREB2A,的下游有很多反应基因，它们都被认为是压力标记基因：

RD22,RD29A,RD29B,andRAB18.。

在mDr处理的按时间程序的实验中，这些标记基因在mDr处理当天（0Day）被诱导表达并且持续到处理后第1天，之后其表达量降低（图8E）。

35.mDr条件下气孔反应的时间程序分析

为了在分子水平了解气孔对mDr处理的反应，在我们mDr微序列数据库中选择了一系列的气孔相关的基因，来研究它们在mDr时间进程中的表达动力学。

PLDα1和GPA1,是气孔中ABA信号传送的两个正调节因子，mDr条件下它们的表达量从第-1天开始增加到处理后第1天达到最大值，之后开始下降（见图9A）。

因为在气孔对周围环境的反应中外流的钾离子通道起着很重要的作用，我们对外流的钾离子通道基因GORK的表达进行了量化，在mDr处理后第1天GORK的诱导表达量最高，从第2天开始下降（图9A）。

36.在气孔反应和ABA信号传送途径中另一组起主要作用的基因属于属于蛋白质磷酸酶家族C型（PP2Cs）。

因此我们检测了三种主要的PP2Cs基因（ABI1,ABI2,andHAB1.）的表达图谱。

在mDr处理的-1天ABI1,ABI2的表达开始上升，一直持续到处理后第1天，然后降低（图9B）。

HAB1.在mDr处理的-1天表达降低，在mDr处理后第1天诱导表达，之后下降（图9B）。

37.在气孔中，ABA信号传送的早期反应中，一个类似受体的激酶1（RPK1）活性很高，它在mDr的微序列中被诱导表达。

在mDr条件下，对RPK1进行的时间程序分析显示，在mDr处理的-1天被诱导表达，它持续到处理后第1天，之后开始下降（图9C）。

38.在我们的干旱微序列中我们发现MY60在mDr处理后第1天和pDr条件下被抑制。

已经发现这个基因在保卫细胞中特异性表达，它的无效突变体抑制气孔打开。

因此我们检测了mDr条件下按时间程序的反应，在五个时间点对MY60的表达进行了量化。

MY60在mDr处理的-1天和0天被诱导表达（图9D），在处理后第1天被抑制，从处理后第2天开始稳定直到水分充足（图9D）。

39.干旱胁迫条件下的光合作用和抗氧化基因的表达

mDr和pDr微序列比较显示：

很多光合作用基因在萎焉条件下受到显著地抑制，相反mDr处理条件下其基因表达所受影响不明显（见附表S1）。

我们选择了几个光合作用基因，在mDr时间程序实验中它们的表达图谱是光系统1（PSI（PQL2,PSAH2）和光系统II（PSII（PSBW,PSBQA）的蛋白质（图10A）。

PSBW的表达从mDr处理后第1天开始显著降低，到mDr处理后第2天到达最低水平。

然而PSBQA的表达在mDr处理的-1、0、1天都是正常的，从处理后第2天开始下降。

光系统1亚组基因PQL2在mDr处理中的-1、0、1、2天其表达到处于正常水平，从处理后第3天开始下降。

PSAH2在-1天被诱导表达，第0天降低至正常水平，在处理后第1天和第2天又被诱导表达，在第3受到抑制（见图10A）。

40.为了测定氧化压力相关的对mDr反应的分子活动，选择了具有抗氧化活性的6种酶：

抗坏血酸盐过氧化物酶1（APX1），硫氧化还原蛋白过氧化物酶1（TPX1），谷胱甘肽过氧化物酶6（GPX6），胞质Cu/Zn岐化酶（CSD1），叶绿体Cu/Zn岐化酶（CSD2）和Fe岐化酶（FSD1）。

APX1和TPX1的表达在时间进程中发生微小的变化（图10B）。

GPX6在mDr处理后第1天急剧下降。

CSD1和CSD2在mDr处理后第1天和第2天受到显著的抑制，而FSD1在整个时间进程中变化不显著（见图10B）

41.干旱条件下细胞扩张基因的表达

mDr条件下细胞扩张基因的诱导表达是特异的，同样的基因在pDr条件下被下调或没有差异性表达。

通过mDr和pDr条件下ABA反应基因微序列数据库的比较，显示了在mDr条件下比pDr萎焉和ABA处理条件下的细胞扩张基因表达升高。

因此，我们对pDr萎焉前（PPW）和mDr（MD）处理对细胞扩张基因表达水平的影响进行了量化，这些基因为：

EXPA3,EXPA4,EXPA8,EXPA10,和EXBL1（图11A）。

mDr处理后1天大部分扩张基因被诱导表达，而在pDr条件下EXPA3和EXPA8被抑制，EXPA4保持不变（图11A）。

42.在mDr处理的时间进程分析中EXPA3,EXPA4,EXPA8,EXPA10基因在第0天被抑制，在处理后第1天被诱导表达，随后处理后第2天和第3天表达下降（见图11B）。

EXBL1基因的表达稳定增加直到mDr处理后第1天，然后逐渐下降，直到处理后第3天达到水分充足条件下的正常表达水平。

43.讨论

干旱条件下生长受阻

我们的兴趣在于找到干旱条件下植物生长受阻的原因，产生反应的时间，以及在生理、生化、分子水平上导致生长受阻的原因.

干旱转录基因组分析

对累计水分亏缺-萎焉（pDr-wilting）和中等干旱条件下（mDr）（1和10天）进行了转录基因组分析比较，显示了共同的干旱反应过程。

此外，qRT-PCR分析显示：

在累计水分亏缺-萎焉（pDr-wilting）和中等干旱处理的第一天（mDrDay01）所引起的大部分特征压力信号和压力标记基因都是相似的。

拟南芥植株对中等干旱条件的感受力和对干旱压力的反应与对更剧烈的环境，萎焉或更干旱处理等致命性条件下都是以同一种方式进行的。

压力的感受和信号的发出时短暂的，它发生在干旱的早期

在干旱压力的初期通过气孔的关闭免除干旱

中等干旱条件（mDr）下光合作用正常也没有氧化压力

光合作用速率是通过瞬间气体交换的测量值来决定的，它不受mDr压力处理的影响，光合作用相关基因的表达图谱也证实了这一点.。

在mDr处理中淀粉的积累也是正常的.

三种抗氧化酶基因APX1,TPX1和FSD1的将近正常的表达水平，而其它测定的抗氧化酶基因GPX6,CSD1,和CSD2.受到抑制，

正如该结果所显示的那样，mDr没有表现出严重的氧化压力。

通过细胞壁的调节来适应mDr环境

44.在mDr晚期的干旱适应过程

在mDr晚期（day10）气体交换的测量值表明：

干旱处理植物的气孔电导率和光合作用与水分充足条件下没有明显的不同。

此外在这个时期没有气孔相关基因的差异性表达。

在mDr晚期（day10）,ABA达到正常水平，生物合成基因没有上调现象，而JA信号发送和生物合成基因显著下调。

为了降低长期干旱条件下（mDr晚期）JA对植物生长的抑制作用，在适应环境的过程中，JA的生物合成和信号发送途径都下调，以建立新的内稳态。

45.植物对干旱反应的模型

对中等干旱条件（mDr）的反应持续的时间可以分成多个不同的时期，从早期到中期和晚期（图12）。

早期装植物或预处理，压力感受、信号发送、基因的重排和表达各个程序依次发生。

在中期反应中，尽管没有可测量的明显的变化，但是植物的生长开始减慢。

接着，作为适应环境反应的一部分，细胞壁的调节发生了。

在晚期，植物到达一个新的内稳态，茉莉酸改变，ABA途径平衡，生长减慢同时伴随着相应低水平的能量消耗，但是其新陈代谢很稳定，生理机能也和水分充足条件下的相同。