生物制品学29章部分重点doc.docx
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生物制品学29章部分重点doc
第二章生物技术与生物制品学的新进展
第一节世界总的特点
一、基础研究不断深入
1、新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开;
2、以DNA、RNA和蛋白质为轴心的分子生物学理论和技术两大体系已基本完成。
3、DNA转化和测序也得到应用,开创了生物科学的一个新时代,使生物各学科都进入了分子生物学时代。
4、利用生物技术能有效地研制出对付各种“不治之症”的新药,因而它正吸引和激励着越来越多的科学家进行医药生物技术的基础和应用研究。
5、人类基因组的研究目标,就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列。
二、新产品不断出现
1、生物技术药物的品种不断增多,包括基因工程疫苗、细胞因子等。
2、研制了新一代生物技术药物与生物制品,并更新了应用方法。
3、生物技术药物和生物制品的生产方法取得了进展.
4、利用基因工程技术构建新型多价活疫苗,是生物技术的又一个新进展。
三、新技术、新试剂不断出现
1、产生了两种医疗技术:
细胞移植和基因治疗
2、生物试剂的开发。
(1)单抗的主要优点
1)高度同质性:
单抗是由源于一个B淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞系所分泌的,因此抗体分子是同质的,即完全一样的;而多抗是由多种异质抗体分子组成的;
2)高度特异性:
单抗是针对一个抗原决定簇的;
3)无限量供应性:
分泌特异单抗的杂交瘤细胞系一旦建立,即可在液氮中长期保存,并可根据需要随时生产理化特性和免疫生物学特性明确的单抗试剂。
同一种单抗不同批次的差异很小,便于标准化。
(2)单抗的交叉反应
特异性强是单抗的特性,但有时单抗可与相关或不相关的抗原发生交叉反应。
因为单抗所识别的是抗原分子上的单个抗原决定簇,其他相关或不相关的抗原分子上有相同或相似的抗原决定簇就可发生交叉反应。
如有些鸡马立克氏病病毒单抗可以与伪狂犬病病毒发生交叉反应。
筛选没有交叉反应的单抗,如在制备新城疫病毒单抗时,首先要去掉与其他副粘病毒发生交叉反应的单抗。
因为新城疫病毒有些抗原决定簇是与其他副粘病毒共有的。
利用交叉反应的特性,如筛选沙门氏菌的属特异单抗。
3、荧光抗体法(fluoresceneAb)、化学发光免疫检测技术(immunitydetection)、DNA探针(probe)和聚合酶链式反应(PCR)等先进分子生物学检测技术的建立,大提高了诊断方法的敏感性和特异性,促进了诊断试剂的发展。
四、新型生物反应器(Bioreactor)和新分离技术(Newisolation)不断出现
各种反应器的应用原则一般是:
1)进行悬浮培养,可用气升式、搅拌式、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器;
2)进行贴壁培养,可用搅拌式(微载体系统)、中空纤维管及陶质矩式通道蜂窝状生物反应器;
3)进行包埋培养,可用流化床、固定床生物反应器。
针对各种生物反应器,还开发出了相应的控制装置和技术。
第三章生物制品的制备
原料的选择原则:
①有效成分含量高,新鲜;②原料来源丰富,产地较近;③原料中杂质含量少;④原料成本低等。
原料的选择注意事项:
①植物原料生长的季节性;②微生物原料的对数期;③动物原料的年龄与性别。
原料的预处理与保存:
①动物原料:
采集后要立即处理,去除结缔组织、脂肪组织等,并迅速冷冻贮存。
②植物原料:
要择时采集并就地去除不用的部分,保鲜处理;
③微生物原料:
要及时将菌细胞与培养液分开,进行保鲜处理。
原料的保存方法主要有:
①冷冻法②有机溶剂脱水法③防腐剂保鲜
常用的破碎方法:
①磨切法②压力法③反复冻融法④超声波振荡破碎法⑤自溶法或酶解法
提取注意事项:
①选择提取试剂。
②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。
③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。
分离纯化技术应满足的要求:
①技术条件要温和,能保持目的产物的生物活性;
②选择性要好,能从复杂的混合物中有效地将目的产物分离出来,达到较高纯化倍数;
③收率要高;
④两个技术之间要能直接衔接,不需要对物料加以处理或调整;
⑤分离纯化过程要快,能够满足高生产率的需求。
分离纯化主要依赖色谱分离方法。
色谱技术是下游精制阶段的常用手段,该法优点是具有多种多样的分离机制,设备简单,便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。
蛋白质类制品的分离纯化方法:
(1)沉淀法:
原理是使蛋白质胶体颗粒破坏,从而沉淀蛋白质。
常用的有盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、与靶物质结合沉淀法(如抗体—抗原)等。
(2)按分子大小分离的方法:
有超滤法和透折法(即膜分离方法)、凝胶层析法、超速离心法等。
其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。
(3)按分子所带电荷进行分离的方法:
离子交换柱层析法、电泳法、等电聚焦法等。
(4)亲和层析法
核酸类药物生产方法:
主要有提取法和发酵法。
糖类制品的分离纯化方法:
(1)提取方法:
①非降解法适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖,提取采用的溶剂是水或盐溶液。
②降解法(degradation)适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。
(2)分离方法:
沉淀法和离子交换层析法。
脂类制品的分离纯化方法:
沉淀法、吸附层析法、离子交换层析法
洗脱一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行,非极性的先流出,极性的后流出。
氨基酸类制品的分离纯化方法
氨基酸的生产方法:
蛋白质水解法(酸水解、碱水解和酶水解)、发酵法
①用盐酸水解为常用方法,其优点是水解迅速、完全,产物全部是L—型氨基酸,缺点是色氨酸全部被破坏,丝氨酸等部分被破坏。
②碱水解法易产生消旋作用,较少应用。
③酶水解法水解不够完全。
氨基酸的分离方法:
有沉淀法、吸附法和离子交换法
人血浆白蛋白制剂的制备
白蛋白又称清蛋白,白蛋白是血浆蛋白中含量最高(3.8~4.8%)、分子量最小、分子数最多的一类蛋白质。
从人体中分离的白蛋白有两种:
一种是从健康人血浆中分离制得的人血清白蛋白,另一种是从健康产妇胎盘中分离制得的胎盘白蛋白。
白蛋白工艺要点:
①络合:
对于络合所要求的pH值,可以略高些,这样,白蛋白络合完全,络合物形成一个相当硬的块,倾倒上清液方便,损失少。
但不能太高,以防络合血浆中的其它蛋白,影响解离与白蛋白制剂的纯度。
若pH值偏低,络合不完全,络合物松软,甚至成汤状,不利于倾去上清液。
血浆搅拌用NaHCO3调节pH至8.5-8.7之间,缓慢加入与血浆等体积的2.3%利凡诺溶液,边加边搅拌,充分络合后,静置2~4h,分离上清与络合物沉淀。
加入2.3%利凡诺溶液比加入5%利凡诺溶液的效果好?
因为加5%利凡诺溶液常造成灭活时白蛋白部分变性或者分装困难。
加入2.3%利凡诺溶液的体积一般不超过血浆体积的一半。
这可能是加入利凡诺溶液除去了解离物中过多的Cl-而澄清,或者是加入的利凡诺(过量)使白蛋白与利凡诺的络合物反溶,从而使造成混浊的物质消失,达到澄清的目的。
②解离:
生产中要严格控制溶液的温度。
25℃左右室温,络合物形成一个硬块,利于去上清和解离。
温度太低,虽然不影响络合,但络合物呈稀糊状,倾倒上清液时常会丢失部分络合物,而且络合物内残存较多的利凡诺的水溶液。
解离温度要维持在40℃左右,是解离反应的最适温度。
解离液的pH值在1.28~1.45之间,解离效果良好。
络合物中加入解离液并搅拌均匀后,将解离后混合溶液pH值控制在6.0左右较理想。
以解离后解离混合溶液pH值决定加入解离液的体积。
解离后解离混合液的pH值高于6.5时,表明加入的解离液少了,有部分络合物未被解离开;低于5.85,表明加入的解离液多了,解离过度。
这两种情况下,解离效果均不佳。
在沉淀中加约二分之一血浆体积的灭菌蒸馏水解离所得到的络合物沉淀,将解离混合物溶液用0.5mol/LHCl调节pH至5.5-6.0,加NaCl至0.15%~0.2%,充分搅拌、40℃过夜解离(8-10h)。
在生产过程中常发现,由于解离效果差,从而不能使生产过程顺利进行。
方法:
(1)加入活性炭法:
在解离效果略差,即能够较顺利地离心,得到部分或全部稍混浊的滤液,但不能正常进行压滤时,加入适当的活性炭于滤液中,搅拦均匀后,立即离心,由于活性炭吸附溶液中粘稠物质,形成大颗粒,经离心可以除去杂质,起到澄清的作用。
(2)加入利凡诺法:
在解离时,在由加入的盐酸或(和)盐过多而造成解离物的滤液混浊的情况下,变性前后,向解离物中加入适量的利凡诺溶液均会起到澄清的作用,而回收率却不会降低太多。
变性前加利凡诺溶液比变性后加利凡诺溶液的效果显著。
由于前者在变性过程中反应温度升高了,反应时间增加了。
(3)多次络合法:
如果解离效果极差,用以上两种方法处理都难以达到澄清的目的,那只有采取多次络合法,即在尽量除去解离物中粘稠物质后,将其pH值调至9.0~9.2,加入适量的5%利凡诺溶液,进行重络合,继尔重解离,一般都会得到很理想结果。
如果仍然出现解离不良的现象,重复以上处理过程,直到得到满意的结果。
这种方法使产品纯度高,外观变黄(棕),同时也使成本提高,回收率降低。
③去杂蛋白:
白蛋白具有生物活性,凡是使蛋白质变性的温度都会使白蛋白变性。
65℃条件下变性1h,离心分离出上清液。
④热处理:
在60±0.5℃条件下处理10h,灭活病毒。
⑤检验方法:
冻干品白色疏松物体。
白蛋白含量占95%以上,水分<1%,水溶后pH为6.6-7.2,硫酸铵残量<0.01%,细菌学和热原质检测合格。
尿激酶工艺要点:
①收尿:
男性尿,8h内处理。
调尿液pH6.5以下。
②硅藻土吸附:
加入1%的硅藻土,5℃下搅拌吸附1h。
③洗脱:
硅藻土吸附物用5℃冷水洗涤后装柱,当洗脱液由清变浑时开始收集。
④除热原、色素:
收集液用饱和NaH2PO4,调pH8.0,加NaCl调电导至22M/Ω,过DEAE-SephadexA50层析柱,收集流出活性部分。
⑤CMC浓缩:
流出液用1mol/LHAc调至pH4.2,用蒸馏水调电导至16-17M/Ω,通过CM-C层析柱。
用10倍体积的pH4.2的HAC-NaAc缓冲液洗涤柱床。
洗后用0.1%氨水0.1mol/LNaCl溶液洗脱尿激酶。
收集活性组分,杂质被吸附。
⑥产品质量:
无色澄清液或白色冻干粉末。
酶活力>15000IU/mg蛋白质。
绒膜促性激素(HCG)工艺要点:
①吸附粗品:
HCl调孕妇尿至pH4-5,加苯甲酸—乙醇饱和液(孕妇尿:
苯甲酸乙醇饱和液:
乙醇=1:
0.075:
5)搅拌1h静置2-3h,过滤,弃滤液,得吸附物。
在搅拌下加入95%乙醇,至苯甲酸全部溶解有絮状沉淀产生,静置过夜,离心,沉淀用95%乙醇和丙酮洗涤,干燥得粗制品。
②提取:
加10倍量的4℃1/15mol/L、pH4.8醋酸盐缓冲液,搅拌4h,离心,取上清液。
沉淀再提取2h。
合并两次提取液,弃去沉淀。
③离子交换层析:
CM-Sepharose柱用0.01mol/L的醋酸盐缓冲液平衡后样品上柱。
依次用pH4.8、0.01mol/L的醋酸盐缓冲液和pH5.9、0.01mol/L的磷酸盐缓冲液洗涤出两个峰(杂质)。
再用pH8.5、0.2mol/L的醋酸盐缓冲液洗脱,得到的第3峰即为HCG。
④羟基磷灰石柱层析:
柱用pH6.8、0.5mmol/L磷酸盐缓冲液平衡。
样品用pH6.8、0.5mmol/L的磷酸盐缓冲液进行层析上柱。
洗脱先用pH6.8、0.5mmol/L再用pH6.81.0mmol/L的磷酸盐缓冲液。
得到I、II活性峰。
然后冷冻干燥。
HCG纯品的比活性为10,000-12,000IU/mg蛋白质。
白细胞介素-2(IL-2)工艺要点:
①诱生:
刺激人外周血白细胞,37℃培养。
②病毒灭活和固液分离:
HCl调节pH再用NaOH调,除去变性杂蛋白。
③分级沉淀:
加饱和硫酸铵溶液至0.35饱和度,4℃静置24h,离心,收集沉淀。
④除盐:
除沉淀溶于pH6.5、10mmol/L的磷酸钠缓冲液(PBS)中(内含2%(g/100mL)正丁醇,0.15mol/LNaCl)。
用pH6.5的10mmol/LPBS透析24h(更换5次透析外液)。
⑤蓝色琼脂糖层析:
透析内液通过Sepharose4B层析柱,用200mL平衡柱缓冲液洗去不吸附蛋白,再用含0.4mol/LNaCl的PBS液洗涤亲和柱,最后用含1.0mol/LNaCl的PBS液解吸IL-2活性组分。
⑥凝胶层析:
活性组分经超滤浓缩,上UltrogelACA44层析柱,柱用含0.1%聚乙二醇MW6000的2%正丁醇和pH7.6的0.5mol/L甘氨酸的0.2mol/LTris-HCl洗脱,得IL-2。
动物来源生物制品的制备
胰岛素的工艺要点
①提取:
绞碎胰脏,加2.3-2.6倍的86%-88%乙醇和5%的草酸,提取3h。
②浓缩:
30℃减压浓缩至比重为1.04-1.06为止。
③除酸性蛋白:
加入7倍量的蒸馏水溶解,再加3倍量冷丙酮,用氨水调pH至4.2-4.3,补加丙酮,离心去除酸性质白沉淀。
④锌沉淀:
用氨水调pH为6.2-6.4,加入3.6%醋酸锌溶液(20%浓度),再用氨水调pH至6.0,4℃放置过夜;收集沉淀。
⑤除碱性蛋白、结晶:
每克加冰冷的2%柠檬酸溶液50mL,6.5%醋酸锌溶液2mL,丙酮16mL,用冰水稀释至100mL,使充分溶解;冷至5℃以下,用氨水调至pH至8.0,过滤;滤液用10%柠檬酸溶液调pH6.0,补加丙酮,慢速搅拌3-5h使结晶析出;再转入5℃左右放置3-4d,使结晶完全;收集结晶,用丙酮、乙醚脱水后,真空干燥,即得结晶胰岛素。
超氧化物歧化酶(SOD)工艺要点:
①收集:
离心去黄色血浆,红细胞用0.9%NaCI溶液离心浮洗3次。
②溶血、去血红蛋白:
加去离子水,5℃下搅拌30min后加入乙醇和氯仿,搅拌15min;离心去血红蛋白,收集上清液。
③沉淀、热处理:
0℃下将上清液加入1.2-1.5倍体积的丙酮,产生絮状沉淀;离心去上清液,得沉淀物;沉淀物加适量蒸馏水溶解,上清在55-65℃下热处理10-15min,除去热变性蛋白,收集黄绿色澄清液。
④沉淀、去不溶蛋白:
澄清液在0℃下加入适量丙酮,使其产生大量絮状沉淀;离心去上清液;沉淀用去离子水溶解,除不溶性蛋白;上清液置透析袋中得透析液。
⑤吸附、洗脱、超滤、冻干:
透析液加到用磷酸缓冲液平衡好的DEAE-SephadexA50柱上吸附,用磷酸钾缓冲液梯度洗脱,收集SOD活力洗脱液,超滤浓缩后,冷冻干燥得SOD成品。
⑥电泳鉴定条件:
0.5%琼脂糖凝胶平板电泳法,用聚丙稀酰胺凝胶电泳方法鉴定更灵敏。
用肝脏生产核糖核酸(RNA)工艺要点
①匀浆:
肝用生理盐水洗净,切成小块,加入1-2倍量柠檬酸钠、聚乙烯硫酸脂(PVS)TritonX100(pH7.0)溶液,用组织捣碎机捣成匀浆,离心。
②提取:
加入等体积三乙醇胺、十二烷基磺酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA,pH9.0)溶液,搅拌均匀后,加等体积苯酚(含0.2%8-羟基喹啉)及等体积氯仿;室温振荡30min,离心20min。
③除蛋白:
离心清液中加入等量氯仿振荡,反复2-3次,至中间界面无明显蛋白层为止。
④乙醇沉淀:
清液中加入1/10体积KAC和两倍体积-20℃乙醇;0℃放置1h,离心得白色沉淀。
⑤除糖原:
将沉淀溶于含EDTA-0.01mol/LNaAc溶液中,加入等体积K2HPO4,搅拌下再加入等体积乙二醇甲醚,0℃放0.5h,离心得清液。
⑥络合:
清液在0℃下搅拌加入等体积0.2mol/LNaAc溶液和1/4体积1%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB);0℃放0.5h;离心取沉淀。
⑦洗涤:
沉淀用NaAc,70%乙醇溶液反复洗涤5次,至无泡沫为止。
分离纯化技术和工艺的影响因素:
①菌种类型及其代谢特性;②原材料和培养基的来源及其质量;③生产工艺和条件;④初始物料的物理、化学和生物学特性。
分离纯化包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工。
离子交换色谱原理:
通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换,从而达到分离目的。
离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料,功能基是由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动的离子两部分组成。
二者所带电荷相反,可进行交换的离子称为反离子。
反离子可与溶液中带同种电荷的离子进行交换,这种交换反应是可逆的,在一定条件下被交换的离子可能解吸,交换剂又恢复到原来的形式,离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。
纯化生物可以采用两种方式:
一是将目的产物离子化,然后被交换到介质上,杂质不被吸附而从柱中流出,称之为“正吸附”,其优点是目的产物纯度高,起到浓缩作用,适于产物浓度低、工作液量大的溶液;
二是将杂质离子化后交换,目的产物不被交换而直接流出,称之为“负吸附”,适用于目的产物浓度高的工作液,只可除去50%~70%的杂质,产物的纯度不高。
B、影响因素
①蛋白质的等电点和表面电荷的分布影响其离子交换的性能
②交换基团和交换介质的种类、吸附和洗脱的条件(pH、离子强度、反离子)等。
③等电点处于极端位置(pI<5或pI>8)的基因工程产物应首选离子交换色谱方法,往往一步即可除去几乎全部的杂质。
反相色谱和疏水色谱原理:
根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化。
反相色谱是利用溶质分子中非极性基团与非极性固定相之间相互作用力的大小,以及溶质分子中极性基团与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小的差异进行分离。
进行生物大分子反相色谱分离时,常用的固定相为硅胶烷基键合相;流动相多采用低离子强度的酸性水溶液,并加入一定比例的能与水互溶的乙腈、甲醇、异丙醇等有机溶剂。
由于固定相骨架的疏水性强,吸附的蛋白质需要用有机溶剂才能洗脱下来。
疏水色谱的原理与反相色谱相似,主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域(非极性氨基酸的侧链)和介质的疏水基团(苯基或辛基)之间的相互作用,无机盐的存在能使相互作用力增强。
所用介质表面的疏水性比反相色谱所用介质的弱,为有机聚合物键合相或大孔硅胶键合相,流动相一般为pH6~8的盐水溶液。
在高盐浓度时,蛋白质分子中疏水性部分与介质的疏水基团产生疏水性作用而被吸附;
盐浓度降低时蛋白质的疏水作用减弱,目的蛋白质被逐步洗脱下来,蛋白质的疏水性越强,洗脱时间越长。
与反相色谱相比,疏水色谱回收率较高,蛋白质变性的可能性小。
二者比较:
反相色谱和疏水色谱的差异在于前者在有机相中进行,蛋白质经过反相流动相与固定相作用有时会发生部分变性,而且后者通常在水溶液中进行,蛋白质在分离过程中一般仍保持其天然构象。
亲和色谱
基本概念:
亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术。
配基(ligand):
被固定在基质上的分子称为配基,配基和基质是以共价键结合的。
基质(matrix):
亦称为载体(vector),是构成固定相的骨架。
2)亲和层析有如下特点:
纯化过程简单、迅速;分离效率高;产物纯度高;必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。
3)亲和层析的基本原理
①亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂。
②当含有混合组份的样品(流动相)通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出。
③然后改变流动相成份,将结合的亲和物洗脱下来。
4)配基的种类
抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA(cDNA、mRNA)、酶与其底物、激素与其受体、维生素与结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素。
5)亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择:
多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的大分子自由通过。
颗粒均匀,具有良好的流速。
具有惰性,尽量减少非专一性吸附。
在温和的条件下能与配基共价偶联。
6)常用的亲和层析载体
纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃珠、其它新型载体
7)亲和层析配基的选择(Selectionofligand)
1.纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力。
2.但亲和力太高也是有害的,因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈,这样可能使生物分子变性。
3.配基必须具有适当的化学基团,可用于和载体相连,同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力。
8)载体、配基、目的物的连接
9)亲和层析的基本操作方法:
①平衡:
用平衡Buffer冲洗柱体,至基线平稳.
②样品上柱和冲洗:
样品中的目的物与层析介质选择性的吸附,杂质不被吸附。
用上样Buffer冲洗柱体,杂质被冲洗下来。
形成杂质峰(见下图)。
③洗脱:
选择适当的条件,将吸附在亲和介质上的目的物解吸下来(见下图)。
凝胶过滤色谱
以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质,小分子能进入孔内,在柱中缓慢移动,而大分子不能进入孔内,快速移动,利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。
根据蛋白质的相对分子质量和蛋白质分子的动力学体积的大小差异,可以利用凝胶过滤来分离纯化目的蛋白。
一是用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液;二是用于蛋白质分子的分级分离,细胞因子的相对分子质量在1.5×104,很容易分离纯化;另一个应用是用于去除产物的多聚体及降解产物。
四、选择分离纯化方法的依据
1、根据产物表达形式来选择
分泌型表达产物的发酵液的体积很大、但浓度较低,必须在纯化前进行浓缩,可用沉淀和超滤的方法浓缩。
产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达之间的一种形式,它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质,在一定程度上有利于分离纯化。
为了获得周质蛋白,E.coli经低浓度溶菌酶处理后,可采用渗透压休克的方法来获得,能够回收到高质量的产物。
E.coli细胞内可溶性表达产物破菌后的细胞上清,首选亲和分离方法。
如果没有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基,一般先用离子交换色谱,处于极端等电点的蛋白质用离子交换分离能去掉大部分的杂质。
2、根据分离单元之间的衔接选择
应选择不同机制的分离单元来组成一套分离纯化工艺,尽早采用高效的分离手段,先将含量最多的杂质分离去除,将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段。
即通常:
①先选用非特异、低分辨的操作单元(如沉淀、超滤和吸附等),以尽快缩小样品体积,提高产物浓度,去除最主要的杂质(包括非蛋白类杂质);
②采用高分辨率的操作单元(如具有高选择性的离子交换色谱和亲和色谱);
③凝胶排阻色谱这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后。
色谱分离次序的选择同样重要
色谱次序能够提高分离效率,当几种方法连用时,最好以不同的分离机制为基础,经前一种方法处理的样品应能适合于作为后一种方法的料液,不必经过脱盐、浓缩等处理。
如经盐析后得到的样品,不适宜于离子交换层析,但对疏水层析则可直接应用。
离子交换、疏水及亲和色谱通常可起到蛋白质浓缩的效应
凝胶过滤色谱常常使样品稀释
在离子交换色谱之后进行疏水层析色谱就很合适,不必经过缓冲液的更换
亲和层析选择性最强,但不能放在第一步:
一方面因为杂质多,易受污染,另一方面,体积较大,需用大量的介质,因此亲和层析多放在第二步以后。
3、根据分离纯化工艺的要求来选择
分离纯化工艺应遵循以下原则:
(1)工艺条件应温和,具有良好的稳定性和重复性:
不受或少受发酵工艺、条件及原材料来源的影响,在任何环境下使用都应具有重复性,明确需严格控制的步骤和技术。
(2)尽可能减少组成工艺的步骤:
步骤越多,产品的后处理收率越低,但必须保证产品的质量
(3)组成工艺的各技术或步骤之间要相互适应和协调
(4)在工艺过程中要尽可能少用试剂,以免增加步骤,或干扰产品质量
(5)时间要尽可能短,因稳定性差的产物随工艺时间增加,生物活性