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医学硕论修改版

分类号：

单位代码：

10193

密级：

学号：

硕士学位论文

麻黄内生真菌及棘豆蠕孢菌的抑菌活性研究

StudyonantifungalantifungalandinsecticidalactivitiesofUndifilumoxytropisandtheendophytesfromEphydra

学位类别：

医学硕士

专业名称：

研究方向：

指导教师：

所在学院：

年月

独创性声明

本人郑重声明：

所呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立进行研究所取

得的成果。

尽我所知，除文中特别加以标注和致谢所列内容外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

本学位论文所有内容若有不实之处，本人愿意承担一切相关法律责任和后果。

学位论文作者签名：

签字日期：

年月日

关于学位论文使用授权的声明

1、本人完全了解吉林农业大学有关保留和使用学位论文的规定，即：

研究

生在校攻读学位期间所完成的论文及相关成果的知识产权属吉林农业大学所有，并同意将本论文的版权授权给吉林农业大学，学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

2、本人（同意/不同意，务必打印后填写）吉林农业大学将本论文版权授权给不同媒体进行电子出版、多媒体出版、网络出版以及其他形式出版（涉密学位论文解密后应遵守此协议）。

3、本人声明毕业后若发表在攻读研究生学位期间完成的论文及相关的学术成果，必须以吉林农业大学作为第一署名单位。

学位论文作者签名：

签字日期：

年月日

指导教师签名：

签字日期：

年月日

摘要

植物内生真菌是指存在于植物体内且不引起植物本身任何明显病害症状的一类真菌，其生活史中的某一阶段或全部生活史发生于植物组织内，具有丰富的物种多样性，能够产生与宿主植物相似或相同的活性代谢产物。

因此，植物内生真菌具有作为新型药物的开发资源而备受学者关注。

本文选取采自日本的3种麻黄属植物进行植物内生真菌的分离，以及甘肃棘豆中的一种棘豆孺胞菌作为研究材料，对两种植物的内生真菌通过液体深层发酵培养获得发酵产物，并对其活性成分及抑菌杀虫作用进行初步研究。

为得到与宿主植物相同或相似的活性成分，本实验对采自日本的3种麻黄属植物茎组织进行内生真菌的分离。

共分离出37株内生真菌，其中草麻黄Ephedrasinica分离15株，双穗麻黄Ephedradistachya分离16株，蓝麻黄Ephedraglauca分离6株。

PDA培养基中分离出23株，占总数的62%，CMA培养基中分离出14株，占总数的38%。

通过观察分离得到的内生真菌的菌落形态将其分为以下几种优势种群：

芒果球座菌属（Guignardiasp.），拟盘多毛孢属（Pestalotiopsissp.），枝孢属（Cladosporiumsp.），炭角菌属（Xylarialessp.），毛壳菌属（Chaetomiumsp.），小丛壳菌属（Glomerellasp.）。

对37株植物内生真菌进行液体发酵培养，获得干燥菌丝体粉末各10g，加入95%的乙醇进行回流提取，提取液中加入少量2%的HCL溶解过滤，分出酸液进行生物碱项测试，结果，优势种群芒果球座菌属（Guignardiasp.）检测出有生物碱成分。

对芒果球座菌属（Guignardiasp.）内生真菌菌株ES-C4进行大量的发酵培养，得干燥菌丝体200g，发酵液浸膏450g。

本文对菌株ES-C4的发酵产物甲醇提取物各极性进行了抑菌活性部位的筛选，以菌丝体和发酵液为原料，甲醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各萃取部分作为供试品，采用滤纸片法，以黑曲霉（Aspergillusniger）、黄曲霉（Aspergillusflavus）、烟曲霉（Aspergillusfumigatus）等3种真菌及金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、克氏库克菌（Kocuriakristinae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonellatyphimurium）等4种细菌为指示菌，以伊曲康唑、青霉素和磷霉素作为阳性对照。

结果显示菌丝体的氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和发酵液的氯仿萃取物表现出抑菌作用。

其中菌丝体氯仿萃取物对烟曲霉和绿脓杆菌的抑制作用比较好，抑菌率分别为61.2%he58.3%；菌丝体乙酸乙酯萃取物对黑曲霉、金黄色葡萄球菌和克氏库克菌的抑制作用较好，抑菌率分别为56.3%、59.4%、57.5%；发酵液氯仿萃取物对克氏库克菌和绿脓杆菌的抑制效果比较好，抑菌率分别为67.2%和71.3%。

为探明菌株ES-C4次级代谢产物多糖的抗氧化作用，以总还原能力、羟自由基抑制活性、超氧阴离子自由基的清除率数据为评价指标，并进行比较研究。

结果显示菌株ES-C4次级代谢产物的胞内多糖、胞外多糖、菌丝体及发酵液甲醇提取各极性萃取物对总还原力和羟自由基、超氧阴离子的清除率均随着样品浓度增加而提高，呈现量效关系。

其中，胞内多糖在抗氧化指标中表现最好。

本实验采用GC-MS法对麻黄内生真菌菌株ES-C4的发酵产物石油醚萃取物的化学成分进行分析。

实验表明菌株ES-C4发酵液石油醚萃取物中共有12个组分，8种化合物已经确定。

其中，包含6种脂类，2种酸类。

在ES-C4菌丝体石油醚萃取物中分离出了20种化合物，确定了14种化合物，其中，包含9种脂类，2种酸。

本实验对棘豆孺孢菌发酵产物甲醇提取物各极性进行了抑菌活性部位的筛选，选取了菌丝体和发酵液甲醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分作为供试品，以白假丝酵母（Candidaalbicans）、克柔假丝酵母（Candidakrusei）、热带假丝酵母（Candidatropicalis）、黑曲霉（Aspergillusniger）、黄曲霉（Aspergillusflavus）、烟曲霉（Aspergillusfumigatus）6种真菌为指示菌，以酮康唑乳膏、伊曲康唑胶囊作为阳性对照，采用滤纸片扩散法进行抑菌试验。

研究结果表明，菌株JE-3菌丝体甲醇提取氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物对6种真菌表现出一定的抑菌效果。

其中氯仿萃取物对黑曲霉和白假丝酵母的抑制作用较好，分别达到87.23%和71.27%:

；乙酸乙酯萃取物对黑曲霉和克柔假丝酵母的抑制效果较好，分别达到71.81%和75.56%；正丁醇萃取物对烟曲霉的抑制效果最好达到65.38%。

菌株JE-3发酵液甲醇提取物各极性萃取物对6种指示菌均有一定的抑菌效果。

其中氯仿萃取物对黑曲霉、烟曲霉的抑菌效果比较明显，抑菌率可达到72.49%、78.15%；乙酸乙酯萃取物对烟曲霉、克柔假丝酵母、热带假丝酵母的抑制作用较明显，抑菌率可达62.57%、65.37%、64.84%。

正丁醇萃取物对白假丝酵母的抑菌作用较明显，抑菌率可达58.94%。

关键词：

内生真菌；药用植物；杀菌活性；发酵产物

Abstract

Endophyticfungusispresentinplantsanddoesnotcauseanysignificantplantitselfakindoffungaldiseasesymptoms,atsomestageintheirlifecycleorlifehistorywereallwithintheplanttissue,hasarichdiversityofspeciesthatcanhostplantsproducesimilarorthesameactivemetabolite.Therefore,endophyticfungiasanoveldrugdevelopmentresourcesandhighlyacademicconcern.SelectthisarticletakenfromJapan'sthreekindsofephedrabeseparatedfromtheplantendophyticfungi,aswellasoneoftheGansuOxytropisOxytropisRuAeromonasasresearchmaterialforendophytetwoplantsobtainedbysubmergedfermentationfermentationproducts,andtostudyitsinsecticidalactiveingredientandantibacterialeffects.

Inordertoobtainthesameorsimilarhostplantactiveingredients,theexperimentcollectedfromJapan,threekindsofephedrastemtissueendophyteseparation.Wereisolatedwithin37endophyticfungi,whichEphedraEphedrasinicaisolated15doublespikeEphedraEphedradistachyaseparation16,BlueEphedraEphedraglaucaseparation6.PDAmediumisolated23,accountingfor62%ofthetotal,CMAisolatedfromtheculturemedium14,accountingfor38%ofthetotal.Endophyticfungiisolatedcolonymorphologyobtainedbyobservingtheirpopulationsdividedintothefollowingadvantages:

（.Guignardiasp）mangoteaspecies,genusproposeddiskhairy,Cladosporium（Cladosporiumsp（Pestalotiopsissp.）.）,Xylariasp（Xylarialessp.）,Chaetomium（Chaetomiumsp.）,asmallclustershellsgenus（Glomerellasp.）

37withintheliquidendophyteculturefermentation,themyceliumobtaineddriedpowderof10g,95%ethanolwasaddedunderreflux,theextractionliquidwasaddedasmallamountof2%oftheleachedHCLseparatedalkaloidacidforentrytestresult,thedominantpopulationsmangoteagenus（Guignardiasp.）havedetectedalkaloids.Mangoteagenus（Guignardiasp.）EndophytestrainsES-C4lotoffermentation,themyceliumwasdried200g,brothextract450g.Inthispaper,thestrainES-C4methanolextractoffermentedproductswerescreenedeachpolarityantimicrobialactivesitetothemyceliumandfermentationbrothasrawmaterial,methanolextractpetroleumether,chloroform,ethylacetate,n-butanoleachextractionaspartofthetest,usingthefilterpapermethod,Aspergillusniger（Aspergillusniger）,aflatoxin（Aspergillusflavus）,Aspergillusfumigatus（Aspergillusfumigatus）andotherthreekindsoffungiandStaphylococcusaureus（Staphylococcusaureus）,KlinefelterCookbacteria（Kocuriakristinae）,Pseudomonasaeruginosa（Pseudomonasaeruginosa）,Salmonellatyphimurium（Salmonellatyphimurium）andotherfourkindsofbacteriaasindicatorbacteriatoitraconazole,penicillinandfosfomycinasapositivecontrol.Theresultsshowmyceliachloroformextract,chloroformextractandtheethylacetateextractofthefermentationbrothshowedinhibitoryeffect.WhichchloroformextractofmyceliumofAspergillusfumigatusandPseudomonasaeruginosainhibitionbetter,inhibitionratewas61.2%he58.3%,respectively;ethylacetateextractofmyceliumofAspergillusniger,StaphylococcusaureusandKlinefelterCookbetterinhibitionofbacterialinhibitionrateswere56.3%,59.4%,57.5%;chloroformextractofthefermentationbrothKlinefelterCookandPseudomonasaeruginosabacteriainhibitoryeffectbetter,inhibitionrateswere67.2%and71.3%.

InordertoinvestigatetheantioxidanteffectofstrainES-C4secondarymetabolitespolysaccharides,withatotalreductionofcapacity,hydroxylradicalinhibitoryactivity,superoxideanionradicalscavengingratedatafortheevaluationandcomparativestudies.TheresultsshowedthatthestrainES-C4secondarymetabolitesintracellularpolysaccharide,extracellularpolysaccharides,myceliumandbrothextractedwithmethanolextractsofvariouspolaritiestotalreducingpowerandhydroxylradicals,superoxideanionscavengingrateassampleconcentrationincreasedwiththeincrease,showingadose-effectrelationship.Amongthem,thebestperformanceinintracellularpolysaccharideantioxidantindicators.

ThetestmethodbyGC-MSinthechemicalcompositionofrawephedrineES-C4fungalstrainfermentationproductofpetroleumetherextractwasanalyzed.ExperimentalresultsshowthatthestrainES-C4brothfromthepetroleumetherextractcomponent12,eightkindsofcompoundshavebeenidentified.Whichcomprisessixkindsoflipids,twokindsofacids.ES-C4separatedmyceliuminthepetroleumetherextractofthe20kindsofcompounds,identified14compounds,whichcomprisesninekindsoflipids,twokindsofacid.

TheexperimentOxytropisRucinereafermentationproductofeachpolarmethanolextractswerescreenedforantimicrobialactivesite,selectthemyceliumandfermentationbrothmethanolextractpetroleumether,chloroform,ethylacetate,n-butanolpartasatesttoCandidaalbicans（Candidaalbicans）,Candidakrusei（Candidakrusei）,Candidatropicalis（Candidatropicalis）,Aspergillusniger（Aspergillusniger）,aflatoxin（Aspergillusflavus）,Aspergillusfumigatus（Aspergillusfumigatus）6speciesoffungiasindicatorbacteriatoketoconazolecream,itraconazolecapsulesasapositivecontrol,antibacterialtestconductedbyfilterpaperdiffusionmethod.TheresultsshowthatthestrainJE-3methanolextractofmyceliumchloroformextract,ethylacetateextract,n-butanolextractofsixspeciesoffungishowedsomeinhibitoryeffect.ChloroformextractofwhichAspergillusnigerandCandidaalbicansinhibitionbetter,respectively87.23%and71.27%:

;ethylacetateextractsonAspergillusnigerandCandidakruseibetterinhibitoryeffect,reaching71.81%and75.56%;n-butanolextractinhibitoryeffectonAspergillusfumigatusbestreached65.38%.EachpolarextractbrothstrainJE-3methanolextractonsixindicatorbacteriahavecertainantibacterialeffect.WhichchloroformextractofAspergillusniger,Aspergillusfumigatusinhibitoryeffectmoreobvious,antibacterialratereached72.49%,78.15%;againstAspergillusfumigatus,Candidakrusei,Candidatropicalisinhibitionofethylacetateextractobviously,antibacterialrateof62.57%,65.37%,64.84%.N-butanolextractalbicansinhibitoryeffectisobvious,inhibitoryrateof58.94%.

Keywords:

Endophyticfungi，Chinesemedicinalplants,Fungicidalactivity，Fermentatedproduction,

目录

摘要I

AbstractIII

第一章植物内生真菌的起源2

1.1植物内生菌的定义2

1.2植物内生菌的起源和演化2

1.3植物内生真菌的分布3

第二章植物内生真菌的次生代谢产物5

第三章植物内生真菌的生物防治研究6

第二篇研究内容9

第一章麻黄内生真菌的分离与鉴定9

1.1麻黄内生真菌的分离与鉴定9

1.2结果11

1.3讨论13

1.4小结14

第二章具有生物碱成分内生真菌菌株的筛选15

2.1麻黄内生真菌的液体发酵培养15

2.2麻黄内生真菌菌丝体生物碱成分检测16

2.3实验方法16

2.4麻黄内生真菌发酵液生物碱成分检测16

2.5结果17

2.6讨论17

2.7小结18

第三章菌株ES-C4发酵产物各极性的抑菌活性研究19

3.1实验材料与方法19

3.2