生物化学复习知识点概括.docx

生物化学复习知识点概括.docx

《生物化学复习知识点概括.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物化学复习知识点概括.docx（13页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物化学复习知识点概括

生物化学复习知识点概括

B6蛋白质的纯化（purification）

1、蛋白质的稳定作用（stabilization）

1.选择适当的缓冲液（PH=7）；

2.操作温度：

4℃；避免蛋白质变性和降解

3.添加蛋白酶抑制剂

二、硫酸铵沉淀法----蛋白质混合物的分级分离

加入硫酸铵盐离心弃去上清液，重新再溶解蛋白通过透析脱盐

结果：

目标蛋白和溶解度相似的蛋白与溶解度差异较大的蛋白及非蛋白类物质相互分离。

【盐析利用蛋白质的性质：

溶解度】

3、透析（dialysis）

1.蛋白质是高分子化合物，不易透过半透膜，因此可用透析法纯化蛋白质，主要应用是脱盐（de-salting）。

2.半透膜上的孔允许约10kDa以下分子通过，大多数蛋白质的分子质量超过了10kDa，故会留在透析袋内。

【到达平衡时，透析袋内的小分子浓度相同，故此需要多次更换周围的溶液---有效地降低小分子在蛋白质溶液中的浓度】

4、凝胶过滤层析（Gelfiltrationchromatography）

1.原理:

柱子中的固定相为多孔凝胶颗粒（porousgelbeads）,具有一定的孔径;将蛋白质溶液加到柱子上端,并使一定缓冲液（buffer,即流动相）不断流过柱子,则大分子不能进入凝胶颗粒先被洗脱（eluted）,而小分子进入凝胶颗粒,后被洗脱,因此,不同分子是基于它们的大小不同而被分离的。

（1）多孔凝胶颗粒（不溶的、高度亲水的）。

（2）Elutionvolume（Ve）（洗脱体积）

从样品被加到柱子上开始到其被洗脱出柱子所流过柱子缓冲液的总体积。

（3）Voidvolume（Vo）（空体积）

柱子内部除去凝胶颗粒以外的剩余体积。

（相对洗脱体积（Ve/Vo）与分子量的对数呈线性关系）

2.主要应用:

样品的脱盐、蛋白质分子量的估计

5、离子交换层析（Ionexchangechromatography）

1.原理:

柱子中的固定相为带正电荷（positivelycharged）或负电荷（negativelycharged）的颗粒（又称为离子交换剂ionexchanger）,在一定pH值下各种蛋白质所带净电荷不同,与离子交换剂的作用方式和强弱也不同,可通过一定方式被先后洗脱下来,因此,不同分子是基于它们所带的净电荷（onthebasisoftheirnetcharge）差异而被分离的。

（1）阴离子交换剂（自身带正电）,用于阴离子交换层析中,可吸附并分离带负电的蛋白质（阴离子）

（2）阳离子交换剂（自身带负电）,用于阳离子交换层析中,可吸附并分离带正电的蛋白质（阳离子）

6、亲和层析（Affinitychromatography）

1.原理:

利用蛋白质与另一种分子（它的配体）的特异性结合的性质进行分离。

如酶与其抑制剂或辅酶,抗体与抗原,受体与激素等。

2.过程:

配体（ligand）固定在不溶性支持物上并装入柱中,混合蛋白通过亲和柱时,其它蛋白全流过,只有目标蛋白结合在固定化的配体上,使用缓冲液对柱子进行冲洗，最后加入含可溶性配体的缓冲液可将目标蛋白以高纯度的形式洗脱下来。

随后再透析除去小分子配体。

B7蛋白质的电泳（electrophoresis）

1、电泳（electrophoresis）

1.定义：

带净电荷的分子在电场中向一极或另一极移动的现象。

2.净电荷越大，分子移动越快。

3.原理：

根据蛋白质的净负电荷和分子大小在电场中进行分离。

小的带负电荷较多的蛋白质比较大的带负电荷较少的蛋白质在凝胶中迁移得快。

2、SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）

1.原理：

用还原剂处理样品，使二硫键打开,同时用阴离子去污剂SDS使蛋白质变性，并使蛋白质覆盖负电荷,然后进行电泳。

由于所有蛋白质都带与其质量成正比的负电荷，所以是根据它们的质量而被分离。

小分子迁移快，大分子慢。

2.特点：

快速、灵敏、广泛使用

3.应用：

测定蛋白质样品的纯度；估计未知蛋白质的分子质量；推测某种蛋白多肽亚基数目。

C4酶的抑制作用（EnzymeInhibition）

1、酶的抑制作用（EnzymeInhibition）

1.抑制剂（Inhibitors）：

直接作用于酶并使它的催化速率降低的分子。

包括正常机体代谢物、药物和毒物。

2.酶的抑制作用类型：

可逆的和不可逆的。

可逆性抑制可分为竞争性抑制和非竞争性抑制。

2、不可逆性抑制

1.定义：

抑制剂不可逆地与酶结合，它通常与活性部位或其附近的氨基酸残疾形成共价键，永久使酶失活。

3、可逆的竞争性抑制

1.典型的竞争性抑制剂与酶的正常底物有相似的结构，故它与底物分子竞争性地结合酶的活性部位，酶既可以结合底物分子也可以结合抑制剂分子，但不能同时与两者结合。

2.竞争性抑制剂与活性部位可逆结合，底物浓度增高科消弱竞争性抑制剂的作用；因为足够高的底物浓度可将结合在活性部位的抑制剂分子竞争性地排出。

（增加底物浓度，竞争性抑制剂的抑制作用降低）

3.竞争性抑制剂存在时，酶的Vmax不变，但酶对起底物的表现亲和力降低，Km增加。

（竞争性抑制剂增加Km，Vmax不变）

4.Lineweaver-Burk图：

竞争性抑制剂使直线斜率增加，x轴上截距变小（Km增大），y轴截距不变（Vmax不变）。

4、可逆的非竞争性抑制

1.非竞争性抑制剂与酶活性部位以外的部位可逆地结合，导致酶的三维构象变化，从而降低酶的催化速率。

（酶既可以结合底物，也可以结合抑制剂，或两者同时结合）

2.非竞争性抑制剂的抑制作用不受底物浓度增加的影响,所以Vmax降低。

3.受非竞争性抑制剂作用时，酶对底物浓度的亲和力不变，所以Km不变。

4.Lineweaver-Burk图：

非竞争性抑制剂能增加直线斜率，改变y轴截距（Vmax减少），使x轴上截距保持不变（Km不变）。

C5酶活性的调节（RegulationofEnzymeActivity）

1、反馈调节（Feedbackregulation）

1.反馈抑制（FeedbackInhibition）：

是指最终产物抑制作用，即在代谢途径中，代谢途径的终产物对该途径前断的某种酶的抑制，这种抑制称为反馈抑制。

2、变构酶（AllostericEnzymes）

1.一般性质：

通常是多亚基蛋白质，有多个活性部位；也有调节部位；抑制剂结合调节位点降低酶E活性，催化剂提高活性；其自身亚基通常是激活剂

2.特征：

多为寡聚酶，含有两个或多个亚基。

其分子中包括两个中心：

一个是与底物结合、催化底物反应的活性中心；另一个是与调节物结合、调节反应速度的别构中心。

两个中心可能位于同一亚基上，也可能位于不同亚基上。

在后一种情况中，存在别构中心的亚基称为调节亚基。

别构酶是通过酶分子本身构象变化来改变酶的活性。

3.变构模型：

序变模型、齐变模型

4.天冬氨酸转氨甲酰酶（AspartatetranscarbamoylaseATCase）

（1）它催化嘧啶核苷酸合成途径中的第一个中间物N-氨甲酰天冬氨酸的合成，ATCase受其代谢途径的终产物CTP的反馈抑制。

ATCase由6个催化亚基和6个调节亚基组成。

当催化亚基和调节亚基混合时能迅速结合。

（由ATCase催化生成的N-氨甲酰天冬氨酸是嘧啶生物合成中的关键步骤和关键调控点）

（2）ATCase参与嘧啶合成时受其代谢途径的终产物CTP的反馈抑制和中间产物之一的激活剂ATP的调节。

调节的机制：

激活剂ATP含量高，传递给细胞的信号使提供给DNA复制的能量充足，因此，ATCase被激活，合成所需的嘧啶核苷酸；党嘧啶足够时，CTP含量高，抑制ATCase，从而阻止该途径中不需要的N-氨甲酰天冬氨酸和随后的中间产物。

5.可逆共价修饰：

非蛋白质基团和酶分子之间的共价键的形成和断裂。

6.蛋白水解的激活作用：

一些酶合成时只是一个被称为酶原的较大的无活性的前体，它们中的一个或几个肽键经不可逆地水解而被激活。

7.酶合成与分解调节：

（1）某种特定酶在细胞或组织中的存在的量取决于其合成与降解速率。

对编码酶基因的诱导和阻遏程度、模板mRNA的降解速率均可改变酶蛋白合成的速率。

酶蛋白合成后，可改变其降解速率（半衰期）对酶活性进行调节。

（2）半衰期：

蛋白质被降解50%所需的时间，可反映某种酶的降解速率。

D2抗体：

概述（Antibodies:

anoverview）

1、轻链和重链：

1.抗体的组成：

抗体分子含有以二硫键连接在一起的4条多肽链，即两条相同的约220个氨基酸组成的轻链和两条相同的约440个氨基酸组成的重链。

（1）基本结构：

抗体分子由四条肽链通过链间二硫键组成H2L2结构。

（2）轻链和重链：

重链：

五类：

a、g、m、d、e；轻链：

两型：

k、l。

2.抗原结合部位：

由每条重链与它相邻轻链的N端协同形成。

故，每个抗体分子有两个抗原结合部位，即是二价体；一分子抗体可结合两分子抗原。

（抗原结合部位由轻链和重链的高变部分绕在一起所形成）

二、可变区和恒定区

1.三个功能区：

（1）可变区（Variableregion,VH和VL）：

抗原的识别、结合。

（2）恒定区（Constantregion,CH和CL）：

含补体结合位点、巨噬细胞FC受体结合位点。

（L链C端1/2处，H链C端3/4-4/5处）

（3）铰链区（Hingeregion）：

结构柔软，通过变构促进抗体-抗原结合、暴露补体结合位点和FC受体结合位点,引发免疫反应。

2.每一条轻链和重链都有一个N端的可变区和一个C端的恒定区。

3.可变区的变异性主要局限于3个高变区，其余部分的变异性小，称为构架区。

（1）高变区也称为互补决定区,在与抗原的识别、结合中起重要的作用。

（2）构架区通常不与抗原直接接触。

D4作为工具的抗体

1、酶联免疫吸附测定法（ELISA）--对样品中特定的蛋白质抗原进行定量

1.原理：

将抗体固定在惰性多聚体载体上，然后与样品接触，洗去未结合的蛋白质，加入可与抗原其他表位结合的第二抗体，在第二抗体上结合有酶，可将无色底物转变为有色产物，第二抗体的结合量即为原样品中存在的蛋白质抗原量，根据产物颜色强度可进行定量测定。

（ELISA利用第二抗体上连接的酶将无色的底物转化成有色的产物）

2.步骤：

（1）一抗结合到固相支持物上；

（2）加入含有抗原的样品，孵育，漂洗以去除未结合的分子；（3）加入结合有酶的二抗；（4）漂洗以去除未结合的二抗，与酶作用底物共同孵育。

2、免疫印迹法（Immunoblotting）--测定混合物中一种以上的抗原

1.原理：

将蛋白质样品用单向SDS-PAGE进行分离，或用双向PAGE分离，再把分离出的蛋白质转移（印迹）到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，与此蛋白质的特异抗体共同孵育，然后洗去未结合的抗体，与抗体结合的蛋白质用放射自显影术进行测定，或使用已标记的第二抗体使其与第一抗体结合，再进行测定。

2.蛋白质印记法（WesternBlotting）

（1）蛋白质SDS-PAGE电泳分离;

（2）将蛋白质转移到膜上（印迹）--电转移;（3）膜与抗体溶液温浴;（4）洗去未结合抗体;（5）检测结合的抗体--使用放射性标记的二或酶标二抗（ELISA）

F3原核生物中DNA的复制（DNAReplicationinBacteria）

1、DNA聚合酶（DNApolymerase）

1.DNA聚合酶I（DNApolymeraseI）

（1）来源：

大肠杆菌；

（2）需要4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）作为前体，Mg