尖萼耧斗菜的传粉机制与遗传结构研究生命科学学院东北师范大学.docx
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尖萼耧斗菜的传粉机制与遗传结构研究生命科学学院东北师范大学
尖萼耧斗菜的进化生物学研究
史凤雪李志瑞崔娜谭判吕雪杜爽鲁晶王璞李松柏
（东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024）
摘要：
尖萼耧斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.etC.A.Mey.）隶属于毛茛科（Ranuncuaceae）耧斗菜属（Aquilegia），为多年生草本，广泛分布于朝鲜半岛、俄罗斯东南部和我国东北地区。
在本实验中，我们分别对尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜进行传粉生物学与分子生物学研究，以期望揭示花色的差异对尖萼耧斗菜和变种黄花尖萼耧斗菜传粉行为与遗传结构的差异。
通过传粉生物学的研究发现，尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜的传粉者传粉方式已出现分化，而通过分子实验也验证了其遗传结构存在了分化，这为将来进一步研究其物种形成奠定了基础。
关键词：
毛茛科尖萼耧斗菜传粉生物学分子生物学遗传结构
1背景介绍
尖萼耧斗菜（AquilegiaoxysepalaTrautv.etC.A.Mey.）隶属于毛茛科（Ranuncuaceae）耧斗菜属（Aquilegia）。
该属共有约70种，广泛分布于欧洲、北美洲与亚洲等地区【1】。
多年生草本植物，全草可人药，具有通经、活血散瘀的功效。
在我国主要分布于黑龙江、吉林和辽宁省等地区，其主要生长于海拔450－l000米的山地杂木林边和草地中【2,3】。
尖萼耧斗菜种内包括尖萼耧斗菜和变种黄花尖萼耧斗菜。
其中，黄花尖萼耧斗菜是尖萼耧斗菜的一个变种。
花瓣尖端为黄色，下端延伸的距和萼片为紫红色的为紫花尖萼耧斗菜；花瓣、距及萼片均为黄白色的为黄花尖萼耧斗菜。
尖萼耧斗菜生于林下、林缘及山麓草地，广泛分布于朝鲜、俄罗斯及我国东北。
经实地调查发现，在我国东北黑龙江省以紫花尖萼耧斗菜为主，辽宁省以黄花尖萼耧斗菜为主，而吉林省两种均有分布。
由此可知，尖萼耧斗菜是研究物种形成与适应性分化的优良材料。
因此，在本实验的研究中我们分别从传粉生物学与分子生物学角度对尖萼耧斗菜与黄花尖萼耧斗菜进行研究。
传粉生物学的研究不仅对理解物种的繁育系统、居群的遗传结构、物种分化、种群的生态特征均具有重要意义，同时也为研究协同进化和生物地理区系分布提供着直接和必不可少的证据，是目前进化生物学和生物地理学研究的热点之一【4】。
植物的进化不仅受到自身基因结构的影响，还受到外界环境对植物的选择作用，除了气候、地理条件等因素外，传粉动物与显花植物之间的协同进化也是影响植物进化的重要因素。
传粉动物对显花植物的影响主要表现在以下几个方面：
传粉动物在活动时间和地理分布上的差异；传粉动物对花朵形态、颜色或气味上的选择性差异；传粉动物对花粉或花蜜等物质的采食性差异；传粉动物在体型和数量上的差异。
显花植物与传粉动物之间通过长时间的选择和适应，逐步形成一整套相互获利的生存机制和进化特征，彼此建立了一系列专一或不完全专一的依赖关系，显花植物在对花器官的调整来适应传粉动物传粉行为的过程中经过长时间的驯化，就有可能在基因结构上发生改变，从而有别于原有物种，进而产生生殖隔离形成新物种。
由上可知，传粉系统在物种进化的过程所扮演的重要角色。
而近年来随着分子技术的不断革新与推广，各种分子标记技术都逐渐被引入到了生物学的研究中。
例如，扩增片段长度多态性（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,AFLP）、简单重复序列（SimpleSequenceRepeat,SSR）单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism,SNP）等。
这些现代分子标记技术的引入使得物种进化领域的研究取得了突出的成果，同时也为传粉生物学的研究提供强有力的分子证据。
耧斗菜因其表型的多样性、生境分布的广泛性，是研究适应辐射进化的理想材料，成为近期遗传学、染色体组学和基因组学研究的焦点，学者们旨在将物种发展为生态与进化研究的模式植物【1】。
在长白山地区主要存在紫色与黄色两种颜色的尖萼耧斗菜，它们在颜色形态上已有差别，本实验旨在通过对两种颜色的尖萼耧斗菜进行传粉生物学研究和分子实验研究，根据传粉者的不同及其传粉时间段的不同以及在其DNA序列上的碱基差异推断两种颜色的尖萼耧斗菜在物种进化上的关系，从而为进化生物学提供新的例证。
同时，耧斗菜属植物的花部性状具有丰富的多态性，而且这些性状与传粉生物学密切相关，对进一步研究进化生物学具有重要意义。
2方法与实验
2.1传粉生物学实验
2.1.1研究区域：
选取长白山地区的尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜，在7月上旬对部分尖萼耧斗菜进行套袋处理，对尖萼耧斗菜集中的区域进行传粉者观察。
2.1.2套袋实验的设计方案：
通过探究尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜自交是否可育或者可育程度是否有差异，来研究其是否在进化上产生分化。
7月3日在长白山地区山腰处对紫花和黄花尖萼耧斗菜植株上的一些未开放的花朵进行套袋处理（即用茶包将待放的花朵套住，避免传粉昆虫对花的干扰），其中紫花套袋处理6朵，黄花2朵。
九天后取下经套袋处理的果实和一些未套袋处理的果实，对比二者结实率。
2.1.3观察传粉过程的方法：
对尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜分别进行观察、拍照并以30分钟为一个时间段进行记录，主要记录传粉动物的种类、数量、传粉方式（取食花蜜或花粉）以及在不同时间段造访两类花朵的频度。
汇总观察到的数据，通过作折线统计图和饼图得出两种颜色尖萼耧斗菜传粉者的差异，进而分析两种尖萼耧斗菜在传粉生物学上的差异。
2.2分子生物学实验
2.2.1DNA的提取与样品的编号
对所采集的尖萼耧斗菜用试剂盒法提取DNA，所用试剂盒为康为世纪（CWBIO）产品，按该试剂盒内所附说明书进行DNA提取，所选样品的编号及信息见表1。
表1样品编号与信息
样品编号
花色
采集地点
采集人
采集时间
D44
黄色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D45
黄色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D46
黄色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D47
黄色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D48
黄色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D60
紫色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D61
紫色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D62
紫色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D63
紫色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D64
紫色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D70
黄色
五常
李志瑞
2011年7月5日
D71
黄色
五常
李志瑞
2011年7月5日
D73
紫色
林口
李志瑞
2011年7月10日
D74
紫色
林口
李志瑞
2011年7月10日
D75
紫色
林口
李志瑞
2011年7月10日
D76
紫色
林口
李志瑞
2011年7月10日
D77
紫色
林口
李志瑞
2011年7月10日
D78
黄色
老白山
李志瑞
2011年7月8日
D79
黄色
老白山
李志瑞
2011年7月8日
D80
黄色
老白山
李志瑞
2011年7月8日
D90
紫色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D91
紫色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D92
紫色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D93
紫色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D94
紫色
冰浴沟
李志瑞
2011年7月5日
D95
黄色
五常
李志瑞
2011年7月7日
D96
黄色
五常
李志瑞
2011年7月7日
D97
黄色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D98
黄色
敦化
李松柏
2011年7月12日
D99
黄色
敦化
李松柏
2011年7月12日
2.2.2PCR与检测
对所提取的基因组DNA用设计好的SSR引物进行荧光PCR扩增，所用SSR引物来源于 Lietal 【5】中的5对A6、A7、AA12、AA4、EST7。
本实验所用PCR仪的型号为GenecompanyLimited公司的GeneAmpPCR仪2720型。
PCR反应的体系为ddH2O14.4µL、10buffer（含Mg2+）2µL、正引物0.3µL、反引物0.6µL、M13F引物0.15µL、M13F荧光引物0.15µL、Taq酶0.2µL、DNA2µL。
PCR反应程序为：
95℃,5min;94℃,30s,50℃,30s,72℃,30s,35个循环;72℃,8min。
然后将PCR产物于1.5g/L琼脂糖凝胶电泳中检测后使用ABI3730（ABI，USA）测序仪进行检测。
3实验结果
3.1传粉实验结果
3.1.1套袋的结果
对于套袋处理的尖萼耧斗菜，统计其结实率发现紫花植株经套袋处理后，自交不育率较高（80.3%），而且自交结实率（85.0%）也明显低于自然生长状态下的结实率。
黄花植株经套袋处理后，自交不育率较紫花种类为低（50%），而且结实率与自然状态下没有太大差别。
3.1.2传粉结果
通过实地观察获得尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜传粉者的信息，利用饼图绘制各传粉者的比例，利用折线统计图绘制传粉者的访问高峰期并对比两种尖萼耧斗菜传粉者的访问高峰期，如图1、2、3、4、5。
3.2分子实验结果
对紫花和黄花尖萼耧斗菜各15个个体进行PCR扩增以后，用测序仪检测后对所得数据用生物软件populations-1.2.32分析处理后作成进化系统谱系图，见图6。
图6尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜的进化系统谱系图
4讨论
4.1尖萼耧斗菜与黄花尖萼耧斗菜传粉系统的差异
4.1.1套袋结果分析
对比套袋处理的尖萼耧斗菜，两种尖萼耧斗菜虽然在自交情况下仍然表现为可育，但已明显具有了异花传粉的倾向，在避免自交可育的行为上，紫花种类明显优于黄花种类。
因此推断出紫花种类在进化年代上具有更久远的历史（因为紫花种类更加趋向于专一性，这有可能是漫长的自然选择造成的）；黄花种类虽然继承了耧斗菜属植物的异花传粉倾向，但自花传粉不可育率不明显，因此进化年代可能会相对较短。
4.1.2传粉系统的差异
黄花植株和紫花植株在传粉动物种类上差别不大，主要的传粉动物均是黑胡蜂，但黄花植株的传粉动物种类更广泛（除黑胡蜂外，还有蜜蜂、熊蜂等而且频度还很高，有较多重叠部分）。
紫花植株的传粉动物种类则倾向于专一化，除黑胡蜂外，其它传粉动物的造访频度相对较低，而且各传粉动物间的高峰期分化较清晰，这可能是紫花植物与传粉动物经过了较长时间的协同进化而逐渐形成的不完全专一性，说明紫花品系相对于黄花品系是比较古老的存在形式（图1和图2）。
紫花尖萼耧斗菜的主要传粉者黑胡蜂的访问高峰期为8:
30-9:
00和10:
00-10:
30（图3），且通过观察发现，黑胡蜂的访花行为主要是落于雄蕊群上，采食花粉。
黄花尖萼耧斗菜的主要传粉者黑胡蜂的访问高峰期为9:
00-9:
30（图4），其行为同上。
两种花的其他传粉者访问次数较少，访问高峰期略有差别。
综合来看，黄花种类与紫花种类的传粉高峰期都主要分布在8:
00-11:
00之间，而且两者呈现明显的互补趋势（波峰和波谷相互重叠）（图5），这除了说明两者可以在有限区域内共同分享传粉动物外，还有可能形成植物间的协作关系——共同吸引传粉者；另外还可以看出传粉动物是先造访黄花植物之后去造访紫花植物的（因为黄花植物的波峰总出现在紫花植物的波峰之前，而且频度要高），这说明黄花品种比紫花品种对传粉者的吸引力更大，很有可能是紫花突变系中的优势物种。
但两者在传粉动物种类、传粉时间、传粉频度上的差异并不明显，另外，二者花器官形态除颜色外并无太大差异（花冠大小、雌雄蕊排列方式、花瓣展开角度以及花距内花蜜含量等），地理分布上也具有相似性，因此二者亲缘关系较近，推测二者起源、变异以及演化的详细信息有待DNA分子标记证据加以补充和完善。
4.2分子实验证据
通过分子生物学的实验研究，分析得到尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜的进化系统谱系图（图6）。
由此系统谱系可以看出尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜并没有地域上的分化。
但紫花尖萼耧斗菜多分布于A分化枝，除D61号个体外，其余均分布在B1分化枝；黄花尖萼耧斗菜多分布在B分枝，A分枝和D分枝含有3个个体，有一个个体分布在C分化枝。
由此可以看出尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜在分子水平上即遗传结构已有初步分化，由此也验证了传粉生物学的结果。
4.3总结
耧斗菜属植物在进化生物学上的研究已被多次应用，对尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜的探究更是作为新的内容跻身到分子水平的研究领域。
总体上，黄花尖萼耧斗菜与尖萼耧斗菜的亲缘关系颇为相近。
但通过对本实验的进一步详细分析，针对不同地点的尖萼耧斗菜及其变种黄花尖萼耧斗菜分别进行了采集编号及其传粉生物学与分子生物学研究，最终发现了二者在传粉者的种类及访花行为等方面已有些许不同，随后的分子实验也从遗传结构方面体现出了它们已有初步分化。
预计在不远的将来，对尖萼耧斗菜的研究将上升为新的研究热点。
诸如上述的实验可以为研究多态性状的遗传学提供理论支撑。
同时，对耧斗菜属植物开展大量的生理学、形态学、遗传学等方面的功能研究，对被子植物的进化比较研究也具有非常重要的意义。
参考文献：
[1]朱蕊蕊,高亦珂,张启翔.耧斗菜属的物种进化与遗传学[J].分子植物育种
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784-789.
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科学出版社，1979,498-500．
[3]费砚良.耧斗菜的引种栽培[J].中国园林,1988,
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