测定方案.docx

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测定方案

一、根系活力的测定方法

【仪器与用具】

分光光度计；分析天平（感量0.1mg）；恒温箱1台；研钵1套；100ml三角瓶；漏斗；移液管10ml1支、2ml1支、0.5ml1支；20ml刻度试管；10ml容量瓶；小培养皿；试管架，药匙；石英砂适量。

【试剂】

乙酸乙酯；连二亚硫酸钠（Na2S2O4，为强还原剂，俗称保险粉）；1%TTC溶液：

准确称取TTC1.0g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml；0.4%TTC溶液：

准确称取TTC0.4g，溶于少量蒸馏水中，定容至100ml与0.1mol/LpH7.5PBS等量混合；磷酸缓冲液PBS（0.1mol/L，pH7.5）；1mol/L硫酸：

用量筒量取比重1.84的浓硫酸（浓度为98%）55ml，边搅拌边加入盛有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000ml；

【方法】

 定量测定：

（1）TTC标准曲线的制作 

 吸取0.25ml0.4%TTC溶液放入10ml容量瓶，加少许Na2S2O4粉末，摇匀后立即产生红色的TTF。

再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。

此即为100ug/ml的标准液。

取5个10ml容量瓶，编号，按下表加入试剂

编号

1

2

3

4

5

标液

0.25

0.50

1.00

1.50

2.00

乙酸乙酯（ml）

定容至10ml

TTF含量（ug/ml）

25

50

100

150

200

摇匀，乙酸乙酯调零，在485nm波长下测定光密度，并以调零点为第1个测定点。

以TTF含量ug为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）称取根样品0.5g，放入小培养皿（空白试验先加硫酸再加入根样品，其他操作相同），加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液内，在37℃下暗处保温1h，此后加入1mol/L硫酸2ml，以停止反应。

（3）把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3～4ml和少量石英砂一起磨碎，以提出TTF。

把红色提出液移入试管，用少量乙酸乙酯把残渣洗涤二至三次，皆移入试管，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在485nm下比色，以乙酸乙酯调零，查标准曲线，求出四氮唑还原量。

【计算】

将所得数据带入下式，求出四氮唑还强度。

四氮唑（TTC）还原强度=四氮唑（TTC）还原量（ug）/［根重（g）×时间（h）］

二、叶绿素含量的测定

【实验材料】

植物叶片

【实验仪器与用品】

分光光度计、毛刷、剪刀、研钵、漏斗、滤纸、容量瓶

【实验试剂及药品】

80%的丙酮、碳酸钙、石英砂

【实验步骤】

1、选取适当的叶片，用毛刷刷去表面的尘土，用打孔器打取3个叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。

注意取样时应避开较大的叶脉。

2、研磨提取向研钵中加入80%的丙酮2.5ml，以及少量的碳酸钙和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml的80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3~5分钟用干净的滤纸过滤到25ml的容量瓶中，用少量的丙酮溶液将研钵清洗，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣变白后，用80%丙酮定容至刻度线。

3、读取吸光度第一个比色皿中装80%的丙酮作为对照，测定波长为652nm的吸光度。

结果计算：

C=（A652×1000）/34.5

叶绿素含量（mg.g-1）=（C×V）/（A×1000）

注：

C为叶绿素的浓度（mg.L-1）；V为提取液的体积（ml）；A为样品的鲜重（g）；34.5是叶绿素在波长为652nm处的吸光系数。

三、可溶性总糖（WSC）的测定

一、仪器、试剂和材料

1.仪器：

电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等

2.试剂：

（1）葡萄糖标准液：

l00µg/ml

（2）浓硫酸

（3）蒽酮试剂：

0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中。

当日配制使用。

3.材料：

淀粉

二、操作步骤

1.葡萄糖标准曲线的制作

取7支试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：

管号

1

2

3

4

5

6

7

葡萄糖标准液（ml）

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.6

0.8

蒸馏水（ml）

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.4

0.2

葡萄糖含量（µg）

0

10

20

30

40

60

80

在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。

自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0min取出，用冰浴冷却至室温，在620nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。

以标准葡萄糖含量（µg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。

2.植物样品中总糖的提取：

精确称取0.5g，置于50ml三角瓶中，加水15m1，盐酸10ml，沸水浴20min，定容至100ml，得提取液。

取10ml滤液定容至100ml

3.测定

吸取1ml已稀释的提取液于试管中，加入4.Oml蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。

以下操作同标准曲线制作。

根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（µg）。

三、结果处理

C×V总×D

样品含糖量（%）=─────────────×100

W×V测×106

其中：

C——在标准曲线上查出的糖含量（µg），

V总——提取液总体积（ml），

V测——测定时取用体积（ml），

D——稀释倍数，

W——样品重量（g），

106——样品重量单位由g换算成µg的倍数

四、SOD酶活性的测定

【实验材料】

叶片,用去离子水冲洗干净,充分研磨致碎（每个品种重复3次）

仪器设备及用品：

分光光度计、冰冻离心机、水浴锅、光照培养箱、10ml小烧杯等

【药剂药品】

10.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液（PBS）（含0.1mmol/LEDTA）

提取缓冲液：

称取0.7325gEDTA（500ml提取液量），用少量0.05mol/LPH7.8的PBS溶解，移入合适的容量瓶，洗涤几次烧杯；称取0.176gAsA（500ml提取液量），用少量0.05mol/LPH7.8的PBS溶解，合并装入有上述EDTA溶液的容量瓶，洗涤几次烧杯，定容。

②0.22mol/L甲硫氨酸：

称甲硫氨酸3.2824g，用0.05mol/Lph7.8PBS溶解定容至100ml（现用现配）。

③1.25mmol/L氯化硝基四氮唑蓝（NBT）溶液（现配）：

称NBT0.102g，用50mmol/LpH7.8PBS溶解定容至100ml。

④0.033mmol/L核黄素：

称2.52mg用PBS溶解定容至200ml（遮光保存）。

【实验步骤】

1、酶液制备

称取植物叶片0.5g，先加入2.5mlPH7.8PBS，研磨匀浆后，再加入2.5mlPBS混匀，4℃下10000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

2.酶活性测定

取10ml小烧杯7只，3只用作测定样品，4只作为对照，按照表21加入试剂。

表21各溶液显色反应用量

试剂

用量

终浓度（比色时）

0.05mol/L磷酸缓冲液

220mmol/LMet溶液

1.25mmol/LNBT溶液

33umol/L核黄素溶液

酶液

总体积

4.05

0.3

0.3

0.3

0.05

5.0

13mmol/L

75umol/L

2.0umol/L

对照以缓冲液代替酶液

将上述试剂混匀后，1只对照烧杯至于暗处，另3只对照烧杯和样品一起至于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光一致，温度高时时间缩短，温度低时可适当延长）。

最后在560nm测定反应液的光密度。

以不照光的对照烧杯作为参比，分别测定其他各管的光密度。

【实验结果及计算】

SOD活性单位是以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，可按下式计算SOD活性：

SOD总活性=

SOD比活力=

式子中，SOD总活性以U/gFW、比活力单位以U/mg蛋白表示；

为对照的光吸收值，

为样液吸光值，V为样液总体积，

为测定时样品用量，W为样重，g。

四、过氧化物酶（POD）活性测定

【实验材料】

叶片,充分研磨致碎（每个品种重复3次）

仪器设备及用品：

天平、离心机、分光光度计、研钵、漏斗、纱布等

【试剂药品】

1、50mmol/LpH7.0的磷酸缓冲液；

2、0.3%H2O2：

吸0.5ml30%H2O2加入ph7.0PBS至50ml；

3、0.2%愈创木酚：

称0.2g愈创木酚，用ph7.0PBS配成100ml溶液。

【实验步骤】

1、酶液的制备

称取植物叶片0.25g，加入5倍量（m/V）的ph7.0PBS，冰浴研磨，15000r/min离心15min，取部分上清液经适当稀释后用于酶活性测定。

用PBS进行调零。

2、CAT活性的测定

在3ml的反应体系中，包括0.3%H2O21ml，H2O1.95ml，最后加入0.05ml酶液，启动反应，测定240nm波长处的OD降低速度。

将每分钟OD减少0.01定义为1个活力单位。

3、POD活性的测定

在3ml的反应体系中，加入0.3%H2O21ml、0.2%愈创木酚0.95ml、ph7.0PBS1ml，最后加入0.05ml酶液启动反应，记录470nm处OD增加速度。

将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位。

【结果及计算】

CAT=（ΔA240×Vt）/（W×Vs×0.01×t）（u/gmin）

ΔA240：

为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml，1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml,0.1ml）。

POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）（u/gmin）

ΔA470：

为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（ml，（1.6ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。

五、活性铁和全铁的测定

采取得叶片先用肥皂水洗涤，再用自来水，最后用去离子水冲洗后，用定量滤纸夹层吸干叶表水，置硫酸纸袋中，放入鼓风干燥箱中105℃下杀青20min，70℃鼓风干燥72h,研磨。

用0.1mol/L的HCL与研磨样按50:

1的比例浸提24h,静止过滤，用WYX-9004型原子吸收分光光度计测定活性铁含量。

260℃碳化、580℃灰化6h,2ml0.1mol/LHCL溶解，去离子水定容至50ml，用WYX-9004型原子吸收分光光度计测定全铁含量。

六、锌含量的测定

将各处理幼苗用自来水冲洗干净，20mmol·L-1Na2-EDTA溶液浸泡15min除去表面粘附的锌，最后用去离子水反复冲洗干净，吸水纸擦去表面水分，分解为根、茎、叶3部分，105℃下杀青、80℃下烘干，测定干质量，干样研磨粉碎，采用湿灰化法，HNO3-HClO4消煮，原子吸收分光光度计（AES，英国PYE公司生产的SP9-400型）测定锌含量。

七、丙二醛（MDA）含量的测定

【实验材料】

植物叶片

【仪器设备与用品】

分光光度计、离心机、水浴锅、研钵、带塞试管等。

【试剂药品】

1、50mmol/LpH7.8的磷酸缓冲液；

2、10%三氯乙酸（TCA）溶液：

称取10g三氯乙酸，用蒸馏水溶解定容至100ml；

3、0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：

称0.5g硫代巴比妥酸，用10%TCA溶解并定容至100ml。

【实验步骤】

1、丙二醛的提取

去0.5g植物样品，先加入10%三氯乙酸（TCA）溶液2ml研磨匀浆后再加入3mlTCA进一步研磨，研磨后所得匀浆在3000r/min下离心10min，上清液为样品提取液。

2、丙二醛含量的测定

取上述步骤所得的上清液2.0ml于刻度试管中（可做2个重复），加入0.5%硫代巴比妥酸（TBA）溶液2.0ml，混合后于沸水浴上反应15min，迅速冷却后离心，上清液分别于532nm、600nm及450nm波长下测定OD值。

对照管以2ml蒸馏水代替提取液。

【实验结果及计算】

MDA浓度C（μmol/L）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD450

MDA含量=MDA浓度×提取液体积÷组织鲜重

然后以材料鲜重表示丙二醛含量：

MDAμmol/gFW。

八、还原性抗坏血酸（Asa）含量的测定

一、实验材料

植物叶片

二、仪器设备

天平、离心机、恒温水浴锅、分光光度计。

三、试剂药品

1、5%三氯乙酸（TCA）溶液（W/V）：

5g三氯乙酸，用蒸馏水配成100ml溶液；

2、150mmol/LNaH2PO4（PH7.4）溶液

3、10%三氯乙酸（TCA）溶液；

4、44%H3PO4；

5、4%2,2-二联呲啶；

6、3%FeCl3

四、实验步骤

1、标准曲线的制作

称取17.613mg的ASA，溶解并定容至100ml，得到1mmol/L的标准母液，利用该标准母液分别配制浓度分别为0mmol/L、0.1mmol/L、0.mmol/L2、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L的AsA标准液。

吸取上述各标准液200μL于编号的对应的不同是试管中，分别往各管中加入150mmol/LNaH2PO4200μL，H2O200μL，混匀。

超过30s后再分别往各管中加入10%TCA溶液400μL、44%H3PO4400μL，4%2,2-二联呲啶400μL、3%FeCl3200μL，混匀后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的OD值。

将测定结果以AsA浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。

2、提取

称取0.5g叶片2份，1份用于测定干重，1份用于AsA的提取。

将样品剪碎加入5ml5%三氯乙酸，研磨，15000r/min离心10min，上清液定容至5ml。

3、测定

吸取上述制备好的样品上清液0.2ml，分别加入150mmol/LNaH2PO4（PH7.4）溶液0.2ml、H2O0.2ml，混匀，至少30s后，再依次分别往各管中加入10%TCA0.4ml、44%H3PO40.4ml、4%2,2-二联呲啶0.4ml和3%FeCl30.2ml，混合后在37℃水浴中保温60min，然后测525nm处的光吸收值。

根据标准曲线计算样品中AsA的含量。

五、实验结果及计算

AsA含量用μg/gFW表示。

九、叶片水势测定（小液流法）

一、试验材料：

植物叶片

二、仪器设备：

试管、小瓶、小塞子、打孔器（直径0.5cm）、尖头镊子、移液管（1ml、5ml、10ml）、注射针钩头滴管、刀片。

三、试剂：

1mol/l蔗糖溶液，甲烯蓝粉

四、实验步骤

1.系列糖浓度配制

1.1取干燥洁净试管6支，贴上标签，标明0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/l浓度，分别从甲组相应浓度糖液1ml盛于小瓶中，随即塞上塞子，作为乙组。

2.取样及测定

2.1选取生长一致的叶片，用直径为0.5cm的打孔器钻取圆片，在玻璃皿内混匀，然后用镊子把圆片放进乙组小瓶中，每瓶放15~20片，立即塞紧塞子，放置40min左右，其间轻轻摇动几次，以加速平衡。

2.2到预定时间后，各小瓶加入几粒甲烯蓝粉染色，摇匀，取6支干燥洁净的注射针钩头滴管，分别从乙组中取出溶液，插入甲组相应浓度蔗糖溶液的中部，轻轻挤出钩头针管内的溶液，使成小液滴，并小心地抽出钩头滴管（注请勿搅动溶液），注意观察那些管的小液滴往上移动，那些管的小液滴往下移动，那一管的小液滴静止不动。

如果某一管中的小液滴悬浮不动，则说明该管溶液与小液流的密度相等，也即植物组织与该浓度蔗糖液间未发生水分净交换，植物组织的水势等于该糖液的水势，根据公式算出该糖液水势也即得出植物组织水势。

若前一浓度溶液小液流下沉，而后一浓度溶液中上浮，则组织的水势值介于两糖液水势之间，即可平均值计算。

注意事项：

1.配制糖溶液浓度要准确

2.取样时要选材一致

3．打孔时要避开大叶脉

4.加甲烯蓝粉要适量，过多会影响溶液浓度，过少则很难识别小液流移动的方向

十、叶片相对电导率（REC）的测定

一、实验材料：

植物叶片

二、实验仪器与设备：

剪刀、振动器、电导仪、水浴锅

三、实验试剂与药品：

蒸馏去离子水

四、实验方法

相对电导率（REC）采用电导法（Jiangetal．，2002）。

首先测量去离子水的电导率C0。

然后将叶片去离子水冲洗3次后，剪成0.25cm的小片，称取0.25g叶片。

放入试管中，加5mL蒸馏去离子水。

在振动器上搅拌1h，然后用电导仪测量该溶液的电导率（C1）。

然后沸水浴15min，拿出冷却至室温后，再测此溶液的电导率（C2）。

五、实验结果及计算

按下式的公式计算REC值:

相对电导率（REC）=

×100%

十一、可溶性总糖（WSC）的测定

一、仪器、试剂和材料

1.仪器：

电热恒温水浴锅，分光光度计，电子天平，容量瓶，刻度吸管等

2.试剂：

（1）葡萄糖标准液：

l00µg/ml

（2）浓硫酸

（3）蒽酮试剂：

0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中。

当日配制使用。

3.材料：

淀粉

二、操作步骤

1.葡萄糖标准曲线的制作

取7支试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：

管号

1

2

3

4

5

6

7

葡萄糖标准液（ml）

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.6

0.8

蒸馏水（ml）

1

0.9

0.8

0.7

0.6

0.4

0.2

葡萄糖含量（µg）

0

10

20

30

40

60

80

在每支试管中立即加入蒽酮试剂4.0m1，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖，以防蒸发。

自水浴重新煮沸起，准确煮沸l0min取出，用冰浴冷却至室温，在620nm波长下以第一管为空白，迅速测其余各管吸光值。

以标准葡萄糖含量（µg）为横坐标，以吸光值为纵坐标，作出标准曲线。

2.植物样品中总糖的提取：

精确称取0.5g，置于50ml三角瓶中，加水15m1，盐酸10ml，沸水浴20min，定容至100ml，得提取液。

取10ml滤液定容至100ml

3.测定

吸取1ml已稀释的提取液于试管中，加入4.Oml蒽酮试剂，平行三份；空白管以等量蒸馏水取代提取液。

以下操作同标准曲线制作。

根据A620平均值在标准曲线上查出葡萄糖的含量（µg）。

三、结果处理

C×V总×D

样品含糖量（%）=─────────────×100

W×V测×106

其中：

C——在标准曲线上查出的糖含量（µg），

V总——提取液总体积（ml），

V测——测定时取用体积（ml），

D——稀释倍数，

W——样品重量（g），

106——样品重量单位由g换算成µg的倍数

四、注意事项：

该法的特点是几乎可测定所有的碳水化合物，不但可测定戊糖与已糖，且可测所有寡糖类和多糖类，包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。

在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值，但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，否则会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。

此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时则可避免此种误差。

十二、游离脯氨酸（Pro）含量的测定

一、实验材料：

幼苗

二、实验设备及用品：

分光光度计、水浴锅、烘箱、天平、带塞试管、烧杯、研钵、石英砂、漏斗、玻璃棒、滤纸

三、实验药品配制：

1、80%乙醇

2、酸性茚三酮试剂：

称取2.5g茚三酮，加入60ml冰醋酸和40ml6mol/L磷酸，于70℃加热溶解，冷却后存于棕色试剂瓶中，4℃保存，2天内稳定；

3、脯氨酸标准母液：

称取10mg脯氨酸溶于少量80%乙醇中，再用蒸馏水定容至100ml，成100μg/L母液；

4、人造沸石、活性炭等。

5、冰醋酸

四、实验步骤：

1、材料的处理：

将材料分成两组①对照：

正常条件下继续生长；②进行干旱胁迫处理。

2、脯氨酸标准曲线的制作

吸取脯氨酸标准母液0ml、0.5ml、1.25ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml、15.0ml分别加入8个50ml容量瓶中，分别加入蒸馏水定容至50ml，配成

0.0μg/ml、1.0μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml、15.0μg/ml、20.0μg/ml、30.0μg/ml、的系列溶液。

分别吸取上述各标准溶液2ml、冰醋酸2ml、茚三酮试剂2ml，加入到10ml带塞刻度试管中，塞上塞子，于沸水浴中加热15min，用分光光度计测定520纳米的光密度值，以0浓度为空白对照。

将测定结果以脯氨酸浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标制作标准曲线。

3、样品中脯氨酸的提取及测定

（1）提取脯氨酸分别称取两种处理的植物材料幼苗的上部，每种处理各取3份，每份材料分别称重0.3g，剪碎，加入适量的80%乙醇，少量石英砂，于研钵中研磨成匀浆。

匀浆液全部转移至10ml刻度试管中，混匀，80℃水浴中提取20min。

（2）除去干扰的氨基酸。

向提取液中加入1勺人造沸石和少许的活性炭，强烈振荡5min，过滤，滤液备用。

（3）脯氨酸含量的测定。

分别吸取上述提取液2ml于刻度试管中，再取一支刻度试管，加入2ml80%乙醇作为参比，分别向上述各试管中加入2ml冰醋酸和2ml茚三酮试剂，沸水浴加热15min，冷却后在分光光度计测量520纳米处各样品的光密度值，从标准曲线上查出每毫升被测样品液中脯氨酸的含量。

用μg/gFW或μg/gDW表示。

十三、可溶性蛋白的测定

【仪器】

分析天平、具塞刻度管（10ml×8）、吸管（0.1ml×1；1ml×2；5ml×1）、研钵、离心管（10ml）、容量瓶（10ml）、离心机、721型分光光度仪

【试剂】

（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清蛋白，溶于蒸馏水并定容止100ml，制成100pg/ml的原液。

（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%的乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml（此液在常温下可放置一个月）。

【操作步骤】

1、标准曲线的制作取6支具塞试管，编号，按下表加入实际。

操作项目

管号

123456

标准蛋白质溶液（ml）

00.20.40.60.81.0

蒸馏水（ml）

1.00.80.60.40.20

G-520试剂（ml）

各加5ml

盖上塞子，摇匀。

放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在一小时内完成）。

以牛血清蛋白含量（u