分光光度计.docx

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分光光度计

概论

紫外可见分光光度法是根据被测量物质分子对紫外可见波段范围（150～800nm）单色辐射的吸收或反射强度来进行物质的定性、定量或结构分析的一种方法。

紫外可见分光光度法从开始到现在,经历了一个漫长的、曲折的过程。

一、分光光度法

   分光光度法的使用始于牛顿（Newton）。

早在1665年牛顿做了一个惊人的实验:

他让太阳光透过暗室窗上的小圆孔,在室内形成很细的太阳光束,该光束经棱镜色散后,在墙壁上呈现红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫的色带。

这色带就称为“光谱”。

牛顿通过这个实验,揭示了太阳光是复合光的事实。

   1815年夫琅和费（J.Fraunhofer）仔细观察了太阳光谱,发现太阳光谱中有600多条暗线,并且对主要的8条暗线标以A、B、C、D、E、F、G、H符号。

这就是人们最早知道的吸收光谱线,被称为“夫琅和费线”。

但当时对这些线还不能作出正确的解释。

   1859年本生（R.W.Bunsen）和基尔霍夫（G.R.Kirchhoff）发现由食盐发出的黄色谱线的波长和“夫琅和费线”中的D线波长完全一致,才知道一种物质所发射光的波长（或频率）,与它所能吸收的波长（或频率）是一致的。

   1862年密勒（Miller）应用石英摄谱仪测定了100多种物质的紫外吸收光谱。

他把光谱图表从可见区扩展到了紫外区,并指出吸收光谱不仅与组成物质的基团有关,而且与分子和原子的性质有关。

此后,哈托莱（Hartolay）和贝利（Bailey）等人又研究了各种溶液对不同波段的截止波长。

并发现与吸收光谱相似的有机物质,它们的结构也相似。

并且可以解释用化学方法所不能说明的分子结构问题,初步建立了分光光度法的理论基础,以此推动了分光光度计的发展。

1918年美国国家标准局研制成了世界上第一台紫外可见分光光度计（不是商品仪器,很不成熟）。

此后,紫外可见分光光度计被不断改进,很快在各个领域的分析工作中得到了应用。

   朗伯（J.H.Lambert）早在1760年就发现物质对光的吸收与物质的厚度成正比,后被人们称之为朗伯定律;比耳（A.Beer）在1852年又发现物质对光的吸收与物质的浓度成正比,后被人们称之为比耳定律。

在应用中,人们把朗伯定律和比耳定律结合起来,称之为朗伯-比耳定律。

今天讲的比耳定律,就是指朗伯-比耳定律。

随后,人们开始重视研究物质对光的吸收,并试图在物质的定性、定量分析方面予以使用。

因此,许多科学家开始研究以比耳定律为理论基础的仪器装置。

二、紫外可见分光光度计

   美国Beackman公司于1945年推出世界上第一台成熟的紫外可见分光光度计商品仪器。

从此,紫外可见分光光度计仪器和应用开始得到飞速发展。

   以紫外可见分光光度计仪器的主机来讲,早期的紫外可见分光光度计是单光束仪器,都只有一条光路（一束光）、一个比色皿、一个光检测器。

操作比较麻烦。

光源波动、杂散光都不能抵消,因此,测量误差较大。

但其最大的优点是成本低。

随着科学技术的发展,紫外可见分光光度计由单光束向准双光束发展,出现了两束光、一个比色皿、两个光检测器的准双光束紫外可见分光光度计。

准双光束仪器的参比光束除起参比作用外,还可起抵消光源波动影响的作用,它比单光束仪器在分析误差上要小一些。

但其成本稍贵。

再往后,出现了两束光、两个比色皿、两个光检测器的仪器,这就是今天所讲的双光束紫外可见分光光度计。

   一般的双光束紫外可见分光光度计,大多只有一个单色器。

例如,P-E公司的Lambda25/35/45紫外可见分光光度计,岛津公司的UV-2450、UV-2550紫外可见分光光度计,北京普析通用公司的TU-1901、TU-1221紫外可见分光光度计,北京第二光学仪器厂的UV-2100紫外可见分光光度计,上海分析仪器总厂的UV-763紫外可见分光光度计等,都只有一个单色器。

国产高档紫外可见分光光度计也只有一个单色器,如北京普析通用公司的TU-1901等紫外可见分光光度计。

但是,目前国际上最高级的紫外可见分光光度计中,大多数都有两个单色器;如美国P-E公司2001年推出的Lambda900、2004年推出的Lambda650/850/950系列、美国Varian公司2003年推出的Cary6000等紫外可见分光光度计等。

这些最高级的紫外可见分光光度计仪器的单色光的单色性很好、杂散光很小、分析误差很小、自动化程度很高、操作非常简单。

但价格昂贵,如果每台仪器的附件全套配齐,则需8万～10万美元。

   从仪器使用的元器件来讲,在光学方面,早期的紫外可见分光光度计大多采用棱镜分光。

20世纪50年代开始,随着分光元件光栅的发展,再加它的价格相对便宜,所以国外有人用光栅分光,出现了光栅型的紫外可见分光光度计。

目前,国内外一般的紫外可见分光光度计都用光栅分光,只有极少数紫外可见分光光度计才专用棱镜分光,如我国的751型紫外可见分光光度计。

但是,目前国际上有很多高档的紫外可见分光光度计使用棱镜加光栅分光。

一般是利用石英棱镜在紫外区的大线色散特性,将石英棱镜单色器作为前置分光部件,这样可大大提高紫外可见分光光度计的分辨率、减少或降低紫外可见分光光度计仪器的杂散光,提高紫外可见分光光度计仪器的质量。

   紫外可见分光光度计的电子学元器件方面,开始都是采用模拟电路制作,并且是电子管等分立元件（单个电阻、电容、电子管等）。

20世纪60年代,晶体管被国外普遍采用,因此,从60年代开始,国外的紫外可见分光光度计都普遍采用晶体管分立元件组成电路。

随着集成电路的问世,国外的紫外可见分光光度计,很快都采用集成电路（集成块、芯片）制作。

我国也很快跟上了国际步法。

   紫外可见分光光度计在自动化程度方面发展很快,从20世纪50年代末期开始,国外生产的许多紫外可见分光光度计就开始采用计算机技术,到了60年代末期或70年代初期则普遍采用计算机技术。

目前,国外生产的紫外可见分光光度计的自动化程度都很高。

   我国过去的工业基础较差,直到20世纪80年代初期,我国生产紫外可见分光光度计的厂商才开始重视使用计算机。

目前,国产的紫外可见分光光度计中,除少数没有计算机外（如“75”系列的大多数紫外可见分光光度计、“72”系列的大多数可见分光光度计）,绝大多数都已普遍使用单片机或台式计算机。

   我国目前已有近30家企业在生产各种不同类型和型号的紫外可见分光光度计,其自动化程度有的也相当高。

有些紫外可见分光光度计的自动化程度不亚于国外产品,从硬件到软件,完全可以与国外的同类仪器媲美。

   总的来讲,我国的高档紫外可见分光光度计与国外差距较大,特别在主要、关键技术指标上,差距更加明显。

如杂散光指标,国外最高已达到8×10-7（如Varian公司的Cary6000型紫外可见分光光度计等）,噪声指标国外最高已达到±0.0002Abs（如P-E公司的Lambda900型紫外可见分光光度计等）。

但我国最高档的紫外可见分光光度计的杂散光指标,目前只能达到1.0×10-4（如北京普析通用公司的TU-1901紫外可见分光光度计等）,噪声指标只能达到±0.0004Abs（如北京普析通用公司的TU-1900/1901等紫外可见分光光度计）。

产生这种现象的原因是多方面的,其中最主要的原因是长期以来,在基础理论、产业化、人才培养方面还存在一些问题。

确切地说,是没有处理好中国分析仪器发展中的若干关系,如理论与实践的关系;元器件与整机的关系;软件与硬件的关系;基础与前沿的关系;普及与提高的关系;样机与批量的关系;质量与价格的关系;指标和可靠性的关系;制作仪器和使用仪器的关系;人才与产品的关系。

   但是,在中、低档紫外可见分光光度计方面,我国与国外的差距已经很小,有些技术指标还能优于国外同类产品（如TU-1900/1901等紫外可见分光光度计的光度噪声已优于岛津的UV-2401/2450、UV-2501/2550紫外可见分光光度计）。

   目前,国际上的紫外可见分光光度计正在向高速、微量、小型和低杂散光、低噪声的方向发展。

我国政府很重视科学仪器的发展,已经把科学仪器列为我国第十个五年计划（以下简称“十五”）期间,国家二十九项重大科技攻关项目中的一项。

北京普析通用公司承担的《光谱分析仪器的研制与开发》国家攻关课题期间,完成了快速便携式多功能紫外可见光谱仪和用CCD阵列作检测器的三维紫外可见光谱仪的研制,都已初步形成了产业化的规模。

   目前,我国的快速便携式多功能紫外可见光谱仪已达到国际上同类产品的领先水平。

我国的紫外可见分光光度计的应用技术发展很快,目前在我国的科研、教学、工农业生产等各个领域,都在广泛使用,其需求量每年达上万台。

应用领域正在不断扩大,它最初主要用于化学领域,随后被大量应用于其他领域。

进入20世纪90年代后,随着生命科学的重要性被人们日渐认识,其应用正在进一步向药学、医学和生物工程等生命科学领域扩展。

今后,其应用领域还将不断扩大,并将得到更大、更快的发展。

分光光度法基础

电磁辐射的基本性质

分光光度法的理论基础与电磁辐射、吸收等许多基础知识有关,本章对此将作简单介绍。

一、电磁辐射的粒子说和波动说

   人们对电磁辐射两重性的认识争论了很久,有两种说法:

一是粒子说,把光看成微粒子,认为光与物质相互作用的现象（如吸收、发射、反射等）表明光是具有不连续能量的微粒（光子）,光具有粒子性;二是波动说,把光看成一种波,它可以反射、衍射、干涉、折射、散射、传播等,它可用速度、频率、波长等参数来描述,这表明光具有波的性质。

   到20世纪初,普朗克（Planck）提出了量子论,把电磁辐射的粒子说和波动说联系起来了。

并提出了光量子（即光子）能量与电磁辐射的频率有关,其数学表达式为

   从式（2-1）和式（2-2）就可看出:

普朗克的量子论真正把粒子说的光子能量与波动说的辐射频率（波长）联系起来了。

用式（2-2）,可以方便地计算出各种频率或各种波长光子的能量。

如紫外区在200nm和可见区在500nm这两个波长处光子的能量分别如下。

   由式（2-2）可知,波长与能量成反比。

也就是说,波长越短,能量越大。

这也是我们为什么要特别注意紫外可见分光光度计短波处（220nm）的杂散光的理由。

二、电磁辐射波段的能量范围和各种波谱法

   前面已经指出了光既是粒子又是一种电磁波。

它们之间的区别仅在于频率（波长）不同,若按频率（波长）的大小顺序,把电磁波排成一个谱（电磁波谱）,见表2-1。

不同波段的电磁波,产生的方法和引起的作用各不相同,因此,出现了各种波谱法。

三、紫外可见吸收光谱的形成

   原子或分子中的电子,总是处在某一种运动状态之中。

每一种状态都具有一定的能量,属于一定的能级。

这些电子由于各种原因,如光、热、电等的激发,放出光或放出热,而从一个能级转移到另一个能级,称之为跃迁。

当这些电子吸收了外来辐射的能量后,就会从能量较低的能级跃迁到另一个能量较高的能级。

因此,每一跃迁都对应着吸收一定的能量（一定波长）的辐射。

谱线的频率（ν）或波长（λ）与跃迁前后两个能级的能量差ΔE=E2-E1之间的关系服从普朗克（Planck）条件,即

   物质的分子吸收光谱形成的机理,就是由于能级之间的跃迁所引起的。

因为分子内部运动所涉及到的能级变化比较复杂,所以,分子的吸收光谱也比较复杂。

一个分子的总能量E可以认为是内在能量E0、平动能E平、振动能E振、转动能E转以及电子运动能量E电子的总和,即

   由此可知,由于分子内部电子能级的变化而产生的光谱在紫外区或可见区内。

分子的振动能级间隔ΔE转大约比ΔE电子小十倍,一般在0.05～1eV之间。

设ΔE转为0.1eV,则为5eV的电子能级间隔的2%。

当发生电子能级之间的跃迁时,不可避免的要发生振动能级之间的跃迁,因此,得到的不只是一条波长为249nm的谱线,而是一系列谱线,其波长间隔为249nm×2%=4.98nm。

   分子的转动能级间隔ΔE转大约比ΔE振小十倍或百倍,一般小于0.05eV,也可以小到10-4eV以下。

设ΔE转为0.1eV,则为5eV的电子能级间隔的2%。

设ΔE转为0.005eV,则为5eV的电子能级间隔的0.1%。

当发生电子能级之间的跃迁和振动能级之间的跃迁时,也不可避免的要发生转动能级之间的跃迁。

因此,得到的谱线彼此间的波长间隔只有249nm×0.1%=0.249nm。

由于彼此间的波长间隔太小,因此它们就连在一起,呈现带状,称为带状光谱。

分子的能级示意如图2-1所示。

   图2-1中的A和B是两个电子能级;在同一电子能级和同一振动能级中,还因转动能量不同而分为若干J=0,1,2,3⋯转动能级。

   一些物质会呈现特征的颜色,这是由于它们对可见光中某些特定波长的光线选择吸收的缘故。

实际上,一切物质都会对可见光和不可见光中的某些波长的光线进行吸收。

但是,一切光线并不都是以相同的程度被物质吸收的。

物质对不同波长的光线表现不同的吸收能力,叫做选择性吸收。

据前所述,物质只能有选择地吸收那些能量相当于该分子振动能变化ΔE振、转动能变化ΔE转以及电子运动能量变化ΔE电子总和的辐射。

各物质分子的能级是千差万别的,因此,它们内部各种能级之间的间隔也是不同的。

所以,各种物质对光线的选

择吸收这一性质,反映了它们分子内部结构的差异;即各种物质的内部结构决定了它们对不同光线的选择吸收。

因此,研究各种物质的吸收光谱,可以为研究它们的内部结构提供重要信息。

定量分析的理论基础———比耳定律

比耳定律问世已230多年了,几乎所有的光学分析仪器（如紫外分光光度计、可见分光光度计、原子吸收分光光度计、液相色谱仪的紫外检测器等）的原理都是采用比耳定律。

   比耳定律是在假设照射到吸光物质上的光是严格的单色光,被测物质是由独立的、彼此之间无相互作用的吸收粒子组成的前提下定义的。

因此,在实际工作中,就必须要认真考虑这些问题,才能真正掌握好比耳定律,才能设计、制造出优质的紫外可见分光光度计等光学式分析仪器,使用者才能用好这些光学式分析仪器。

一、比耳定律及其数学表达式

   18世纪初期,朗伯在前人的基础上,进一步研究了物质对光的吸收与物质厚度的关系,并于1760年指出:

如果溶液的浓度一定,则光对物质的吸收程度与它通过的溶液厚度成正比。

这就是朗伯定律,其数学表达式为

   式中,A为吸光度;I0为入射光强度;I为透射光强度;b为液层厚度（即光程）;K0为比例常数。

   1852年,比耳研究了各种无机盐的水溶液对红光的吸收后指出:

光的吸收和光所遇到的吸光物质的数量有关;如果吸光物质溶于不吸光的溶剂中,则吸光度和吸光物质的浓度成正比。

即当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度成正比,这就是比耳定律。

其表达式为

   式中,A为吸光度;I0为入射光强度;I为透射光强度;C为溶液的浓度;K1为比例常数。

   若将朗伯定律和比耳定律合并,则为朗伯-比耳定律（Lambert-Beer）,一般简称为比耳定律。

它可用以下数学公式描述

   式中,b为光程;C为溶液的浓度;K2为比例常数,一般将K2称为吸光系数,单位为1/（g·cm）。

   式（2-8）中,若将浓度C以摩尔（mol）浓度表示,光程b以厘米（cm）表示,则吸光系数K2称为摩尔吸光系数,一般用ε表示,其单位为1/（mol·cm）。

此时,式（2-8）可改写为

   其中,ε是有色溶液在浓度C为1mol/L,光程b为1cm时的吸光度;它表征各种有色物质在一定波长下的特征常数,它可以衡量显色反应的灵敏度;ε值越大,表示该有色物质对此波长光的吸收能力越强,显色反应越灵敏。

一般ε的变化范围是10～105,其中ε>104为强度大的吸收,ε<103为强度小的吸收。

   如果试样的分子量M还不知道,可用A1%1cm来表示。

即

   综上所述,比耳定律可以描述为:

当一束平行的单色光通过某一均匀的有色溶液时,溶液的吸光度与溶液的浓度和光程的乘积成正比,这就是比耳定律的真正物理意义。

它是光度分析中定量分析的最基础、最根本的依据。

也是紫外可见分光光度计的基本原理。

二、影响比耳定律偏离的主要因素

（一）非单色光

   如前所述,从理论上讲,比耳定律只适用于单色光,但在实际工作中并非如此,绝对不可能从光学分析仪器上得到真正的单色光,只能是得到波长范围很窄的光谱带。

因此,进入被测试样的光仍为在一定波段内的复合光。

由于物质对不同波长的光具有不同的吸光程度,故在实际工作中即使用很高级的分光光度计、采用很窄的光谱带宽,即用波段很窄的复合光照射样品,仍然会产生比耳定律偏离。

   此时,A与C成线性关系。

但实际上,ε是有色物质的与波长有关的特征常数,对同一有色物质而言,在其他条件一定时,不同波长有不同的ε值,故ε1不可能完全与ε2相等。

因此,对非单一波长的入射光,A与C不可能真正成线性关系,因而产生了比耳定律偏离。

（二）杂散光

   杂散光是紫外可见分光光度计的主要分析误差来源。

杂散光产生的原因很多,最主要的是光栅、外光路和单色器内壁散射等原因产生杂散光。

仪器的杂散光80%来自光栅,它使分析测试的吸光度变小,特别在高浓度时,杂散光的影响会更加严重,以引起比耳定律的偏离。

同时,由于物质在某些介质中分散为许多微小的粒子,这些粒子会对入射光产生散射。

并且,随着粒子浓度的增大,这些散射光的强度会增强,会降低透射光强度,使被测试样的吸光度增大,从而引起比耳定律的偏离。

此外,由于不少物质在光的照射下会产生光致发光现象或产生荧光,也将严重影响比耳定律,使之偏离。

（三）噪声

   噪声会直接影响紫外可见分光光度计的信噪比,降低仪器的灵敏度,噪声限制紫外可见分光光度计仪器对样品分析浓度的下限。

噪声主要来自仪器的电子学系统,一般用峰-峰值来表示。

如果仪器的正噪声大,会使测定低浓度样品的吸光度值增大;如果仪器的负噪声大,就会使测定低浓度样品的吸光度值减小,从而使测定值偏离比耳定律。

（四）光谱带宽

   光谱带宽会直接影响比耳定律的偏离,这是容易被人忽视而又特别重要的问题。

本书将在后面详细介绍,此不赘述。

（五）化学因素

   化学分析中绝大多数是基于被测定成分与试剂之间的反应,从而得到一定的反应产物。

这个产物不一定很稳定,有时还会继续产生化学反应、溶剂效应,有时试剂中还有杂质等的干扰,这些都会引起比耳定律的偏离。

（六）其他因素

   除上述因素外,分析测试时的温度也可引起比耳定律的偏离,压力、光学传感器的非线性等,也可引起比耳定律的偏离。

三、比耳定律的局限性与可靠性

（一）比耳定律的局限性

   如前所述,比耳定律在低浓度时是正确的,但不排除在高浓度时,采用差示分光光度法、多波长法等适当方式进行定量分析。

（二）比耳定律的可靠性

   比耳定律假设的分析条件与实际的分析条件有偏离,因此,在使用中就会出现可靠性的问题。

在比耳定律的推导中,至少有三个假设是与实际不相符的:

第一,假设采用的是单色光;第二,入射光是平行光;第三,吸光粒子（分子或离子）的行为相互无关,而且,不论其数量和种类如何都是如此。

此外,样品的处理、测量过程中的仪器条件和操作等因素也会产生误差。

由于有这些假设和操作上的原因,引起了比耳定律应用中的可靠性问题。

下面将对此进行简单分析讨论。

1.非单色光

   在比耳定律的推导中,都是假设采用单色光,而在实际中不可能是真正的单色光,即使是选用仪器上设置的最小光谱带宽也是如此。

非单色光的谱带宽度与使用仪器的光谱带宽有关,所用的光谱带宽越大,非单色光的谱带宽度就越大,光谱纯度就越差。

因此,由于实际的非单色光与假设的单色光不符,就产生了比耳定律的偏离。

   假设入射到样品上的光是真正的平行光,这在实际中也是不可能的。

不管在何种情况下,入射到样品上的光,总是有一个孔径角。

这与假设入射到样品上的光是平行光不符。

因此,产生了比耳定律的可靠性问题。

2.吸光物质成分之间的相互作用

   在比耳定律的推导中,假设所有的吸光粒子（分子或离子）的行为都是相互无关的。

但是,这种情况只有在稀溶液（浓度≤0.01mol/L）中才存在。

因为在浓度增大时,往往产生某些附加效应,如聚集、聚合或缔合作用、水解以及络合物配位数的改变等,最后影响物质的吸光效应。

并且,吸光粒子之间的相互作用必将改变吸光成分或被激发的成分,或改变电荷分布。

从而将改变对所吸收的入射光能量的要求,导致吸收峰的位置、形状和高度随着浓度的增加而改变。

3.光程不相等

   比耳定律假设所有入射光线通过相同数量的吸收粒子或假设所有入射光线通过吸光物质的光程相等,其实不然,如果把一个样品放在几台不同的紫外可见分光光度计上测试,尽管仪器都经过认真的调试、校验,其测试结果都是不会相同的。

其原因有多方面,除前面所述因素的影响外,还有以下因素引起光

   如果光束的截面是均匀的,那么,从式（2-13）可以计算不同孔径角的吸收百分比误差。

孔径角为2°～10°时的吸收百分比误差见表2-2。

   从表2-2可知,当孔径角小于5°时,吸光度A值的误差小于0.1%。

（2）比色皿引起的误差大多数样品是以溶液形式进行分析测量的,因此,比色皿就成了重要部件。

它的几何尺寸的加工误差、配对误差会直接导致分析测试结果产生误差。

特别是比色皿的两个通光面之间的距离和平行性更是如此。

英国标准研究所曾经介绍过关于比色皿的技术要求,他们建议光程长的标准精度必须达到±0.02mm,端面窗的平行性是4个光圈/1cm（用汞灯的546.1nm测试）,对于10mm光程的比色皿,其标定精度必须在±0.01mm内。

   作者根据我国国家计量检定规程的要求,对我国某公司生产的比色皿进行过测试。

在三个月中（其中间隔一个月）,先后从两批产品中,挑选62对比色皿进行了配对检测。

第一批挑选32对比色皿,不合格者达22对,占68.8%;第二批挑选30对比色皿,不合格者23对,占76.6%。

而该公司长期从事比色皿的生产,用户遍布全国各地,甚至大量出口国外。

据该公司负责人讲,从未听到过使用者对他们生产的比色皿提出过配对不合格的意见。

这说明了广大科技人员,尚未对比色皿的配对误差给紫外可见分光光度计的分析误差带来的严重影响引起重