打靶载体构建.docx

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打靶载体构建

利用同源重组技术进行打靶载体的构建

孔冬

小鼠遗传学实验室

南京大学模式动物研究所

基本原理

传统意义上的打靶载体的构建受基因组DNA上限制性内切酶位点的强烈局限。

考虑到后期利用Southern杂交进行阳性克隆筛选时的内切酶是否可以区分重组和野生型染色体，同时顾及同源臂两端的内切酶是否能与常用载体的多克隆位点相匹配，最后可供我们进行选择的打靶区域往往非常有限。

而近年来发展起来的基于噬菌体的大肠杆菌同源重组系统为我们摆脱这种束缚提供了一个有效的平台。

高效、省时、灵活是该系统的三大特点。

2004年底小鼠129品系BAC文库末端测序的完成更为这一技术的应用提供了巨大的便利。

大肠杆菌中同源重组的研究由来已久，其原理如图1所示。

而NealG.Copeland,NancyA.Jenkins以及DonaldL.Court实验室所采用的λ噬菌体RED系统较之前代又有以下优势：

高效；所需同源序列由500bp降至45bp；低突变率。

为使此系统能便利的应用于条件性基因敲除打靶载体的构建，他们建立了两个大肠杆菌菌株EL250、EL350；三个质粒pL253、pL451、pL452（图谱见附录）。

两个菌株中的gam基因以及RED重组酶基因exo和bet均受温度敏感性λ抑制子cI857的严格调控。

抑制子在32℃处于活化状态，而其在42℃的短暂失活能使其控制的基因迅速表达。

此外，EL250中的Flpe及EL350中的Cre重组酶基因则受阿拉伯糖诱导的PBAD启动子的调控，在阿拉伯糖的参与下进行表达。

这两个菌株可以有效地去除loxP或FRT重组位点间的NEO筛选框。

质粒pL253、pL451、pL452均来源于pBlue/Script载体，分别用于打靶载体的骨架，loxP－FRT-NEO-FRT、或loxP-NEO-loxP片段的PCR扩增。

利用此系统构建条件性打靶载体的基本步骤如图2所示。

自Sanger研究所定购的129BAC克隆被装入DH108菌株以琼脂为载体进行邮寄。

为使后续操作易于进行，我们首先从100～200Kb的BAC中将包含左右同源臂的目的片段（约10～20Kb）套取下来（见图3－A）。

pL253载体中的两段同源序列各长500bp，是以129基因组DNA为模板，用PCR的方法获得，经内切酶消化后连接克隆入pL253载体。

利用介于两段同源序列之间的线性化位点进行线性化的pL253载体在EL350中与BAC发生同源重组。

阳性克隆可用氨苄青霉素筛选获得。

插入loxP位点的原理如图3－B所示。

包含两段各长～80bp同源序列的loxP-NEO/Kan-loxP片段同样以PCR制备，所不同的是该同源序列包含在PCR的引物进行合成。

同源重组后的质粒同时具有氨苄青霉素和卡那霉素抗性。

重新将质粒抽提物转入EL350中可以去除菌株中其它未发生重组的质粒。

加入阿拉伯糖后Cre重组酶的表达可以将loxP位点间的NEO剪切掉，从而只留下一个loxP。

同样道理我们可以在EL250中插入第二个loxP。

FRT－NEO/Kan－FRT留在载体中可用于ES细胞的筛选。

最终的载体用测序的方法进行验证。

图2

图3

实验技术

以下以基因MLCK（myosinlightchainkinase）为例，其载体构建过程如图4E所示。

129小鼠品系BAC克隆的查询及订购

1．

前往www.ensembl.org，点击Mouse（如箭头所示）。

2．在Search框内寻找目的基因，例如p53。

3．在检索结果中选则所要的项。

4．

点击Viewgeneingenomiclocation后面的链接。

5．

滚动页面到图示位置，点击DASSource，选择129S7/AB2.2clones和BACends选项。

6．点击closemenu，等待页面刷新。

滚动页面到图示位置，绿色和红色（代表在克隆内不同的方向）的线条都代表包含Trp53的BAC克隆，左边线条下是克隆号。

7．任选一个克隆比如bMQ358p19，点击克隆号出现下拉菜单，点击DASLINK:

bMQ358p09。

8．滚动页面到图示位置

，点击MTArequired（箭头所示处）

9．从Sanger定购BAC需完成两部分表格：

（1）网上电子表格

（2）MTA表格，此表格需传真并邮寄原样。

登陆http:

//www.ensembl.org/Mus_musculus/网站查询目的基因。

BAC的抽提及纯化

试剂：

SolutionI:

Tris-HCl0.05M

EDTA0.01M

pH8.0

SolutionII:

SDS1%

NaOH0.2M

SolutionIII:

KAc5M

pH5.5

步骤:

1．搜集细菌。

9000rpm离心10分钟，倒掉上清；

2．加入5ml预冷的SolutionI及20ul25mg/mlRNaseA，重悬；

3．加入5mlSolutionII,上下颠倒5～10次，室温放置10分钟；

4．加入5ml预冷的SolutionIII，上下颠倒5～10次，冰放置10分钟；

5．10，000rpm离心10分钟，收集上清到新离心管，如仍有白色沉淀物悬浮，重复离心一次；

6．加入12ml异丙醇，振荡器混匀；

7．10，000rpm离心10分钟，倒掉上清，留下白色DNA沉淀；

8．重悬入500ulSolutionI，加等体积1：

1酚氯仿，振荡器混匀；

9．12，000rpm离心5分钟，将上层吸入新的1.5ml离心管中，注意不要吸入白色沉淀；

10．加50ul3MNaAcpH5.2,以及350ul异丙醇，混匀并在12，000rpm离心10分钟；

11．倒掉上清，加入500ul70％乙醇，12，000rpm离心5分钟；

12．倒掉上清，将DNA沉淀在空气中凉干；

13．用100ulMilliQ水溶解DNA。

电转感受态细菌的制备及BAC电转

1.接种单克隆EL350/EL250至3mlLB培养基中，32℃240rpm培养12～16小时；

2.第二天，将过夜菌液1ml接种到50mlLB培养基，32℃240rpm培养2～3小时至OD600＝0.5~0.7；

3.（如只转BAC而不进行同源重组，此步省略）将10ml菌液分装到200ml锥形瓶，置于42℃水浴摇床中（约40rpm）保温15分钟；

4.将锥形瓶置于冰上20分钟，此间将pH7.4MilliQ水，以及电转杯，离心管置于冰上预冷；

5.于4℃离心机3，500rpm离心5分钟将菌液沉淀；

6.以1ml冰水将菌体轻轻重悬，3，500rpm离心5分钟，倒掉上清；

7.重复步骤6三次；

8.倒掉上清，余下约50ul用以悬浮菌体；

9.将此感受态细菌与100～400ngDNA（必须溶于MilliQ）混合并转入预冷的0.1cM电转杯中，置于冰上准备转化；

10.设置BIORAD电转仪，1.75KV，25uF，200Ω,进行电转；

11.电击后，迅速加入500ulSOC并于32℃保温30分钟；

12．将菌液均匀的涂在相应的LB琼脂板上，于32℃保温

12～20小时

PCR引物设计及PCR纯化

MI-L5’---GCGGCCGCTGTCCCTACTCCTAATTTGTCC---3’

MI-R5’---AAGCTTAGTGTGTTGGGGACATGGCT---3’

MII-L5’---AAGCTTGCAAACCTCAGACATCAGGG---3’

MII-R5’---ACTAGTGGGAAGCACCTGAAATCTGG---3’

PloxpL5’---tgaagtacccaaggactacaagaaaggttca

tgaggaaataaatggctggcagtcactggtaagaggaga

gtttgaaggtgaattcctgcagcccaattccgatc----3’

PloxpR5’---ctgactggaaaaggagccagatacatattgg

caagctctggtctcctcagcccagcctcctgactcctcca

ccatgtctggctctagaactagtggatcccctcg----3’

PfrtL:

5’-agcagtctgctagccttgggacccctgtacccact

gtcctcctgacttcttgtctaatcttatctttttaacatata

aattCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCC-3’

PfrtR:

5’-ccccatgatttgcctctagtagtgtagaaacagga

aagatgaatgaatggatgggagtaagaccattttctgttt

tcttatcGCTCTAGAACTAGTGGATCCACCTAATAACTTC-3’

其中MI，MII两对引物用于扩增两段各长500bp同源序列I和II。

PCR产物与T载体连接，然后分别用NotI,HindIII和HindIII，SpeI将片段I和II切下来，同时连入NotI,SpeI酶切过的PL253载体，这样就构建好了用于套取目的片段的载体I-II-PL253。

其中HindIII将用于该载体线性化。

PLoxp这对引物用于扩增两端各长～80bp同源序列的loxP-NEO/Kan-loxP片段，而引物Pfrt用来扩增两端各长～80bp同源序列的FRT－NEO/Kan－FRT片段。

以上PCR产物以及酶切片段均用QIAquickGelExtrcctionKit纯化。

套取BAC中的目的片段

将转入BAC的EL350制备成电转感受态，同时将线性化的载体I-II-PL253转入其中（100～200ng/50ul感受态菌）。

电转后的菌用Amp+的LB板筛选。

其中发生准确交换而形成的质粒MLCK-PL253的酶切图谱如图4A所示。

插入loxP-NEO/Kan-loxP片段

将上述含有MLCK-PL253的EL350制备成电转感受态，并将纯化的loxP-NEO/Kan-loxP片段转入其中（100～200ng/50ul感受态菌）。

电转后用Amp+Kan+的LB板筛选。

为了得到插入loxP-NEO/Kan-loxP片段的纯的质粒MLCK-PL2531stLoxp,我们还需将上面筛选得到的质粒重新转入EL350中，并用Amp+Kan+筛选。

质粒MLCK-PL2531stLoxp的酶切图谱如图4B所示。

Cre介导的loxP位点间NEO片段的去除

1.将含有loxP-NEO/Kan-loxP质粒的EL350克隆接种到3mlLB培养基（Amp+Kan+）中,32℃240rpm培养12～16小时；

2.第二天，将1ml过夜菌液转入10mlLB，32℃培养2～3小时至OD600＝0.5;

3.加入100ul10%L（+）-阿拉伯糖，继续培养1小时；

4.将菌液稀释后分别涂在氨苄青霉素和卡那霉素LB琼脂板上，32℃培养过夜

5.氨苄青霉素板上的克隆应远远多于卡那霉素板。

在前者上挑取几个克隆培养并用PCR，酶切或测序方法进行验证。

其中NEO去除后的质粒MLCK-PL2531stLoxPpopout的酶切图谱如图4C所示。

插入FRT－NEO/Kan－FRT片段

将质粒MLCK-PL2531stLoxppopout转入EL250，并制备成电转感受态，同时将纯化的片段FRT－NEO/Kan－FRT转入其中（100～200ng/50ul感受态菌）。

电转后的菌用Amp+Kan+进行筛选。

得到的质粒再转入EL250，通过Amp+Kan+筛选得到纯的目的载体。

插入该片段的质粒MLCK-PL2531stLoxP2ndLoxP的酶切图谱如图4D所示。

目的载体经过测序，确认正确后就可用于ES细胞的电转。

图4

（A）MLCK-PL253酶切图谱（lane1,HindIII;lane2,EcoRI）.（B）MLCK-PL2531stLoxP酶切图谱（lane2,HindIII;lane3,EcoRI）.（C）MLCK-PL2531stLoxPpotout酶切图谱（lane2,HindIII;lane3,EcoRI）.（D）MLCK-PL2531stLoxP2ndLoxP

酶切图谱（lane2,HindIII;lane3,EcoRI）.（E）MLCK打靶载体构建过程.

M代表MarkerEcoR14digest.

实验试剂及耗材

参考文献

1.Lee,E.C.etal.AhighlyefficientEscherichiacoli-basedchromosomeengineeringsystemadaptedforrecombinogenictargetingandsubcloningofBACDNA.Genomics73,56-65.（2001）.

2.Ellis,H.M.,Yu,D.,DiTizio,T.&Court,D.L.Highefficiencymutagenesis,repair,andengineeringofchromosomalDNAusingsingle-strandedoligonucleotides.ProcNatlAcadSciUSA98,6742-6.（2001）.

3.Muyrers,J.P.,Zhang,Y.,Testa,G.&Stewart,A.F.RapidmodificationofbacterialartificialchromosomesbyET-recombination.NucleicAcidsRes27,1555-7.（1999）.

4.Muyrers,J.P.,Zhang,Y.&Stewart,A.F.ET-cloning:

thinkrecombinationfirst.GenetEng22,77-98（2000）.

5.Muyrers,J.P.etal.PointmutationofbacterialartificialchromosomesbyETrecombination.EMBORep1,239-43.（2000）.

6.Muyrers,J.P.,Zhang,Y.&Stewart,A.F.Techniques:

Recombinogenicengineering--newoptionsforcloningandmanipulatingDNA.TrendsBiochemSci26,325-31.（2001）.

7.Narayanan,K.,Williamson,R.,Zhang,Y.,Stewart,A.F.&Ioannou,P.A.Efficientandpreciseengineeringofa200kbbeta-globinhuman/bacterialartificialhromosomeinE.coliDH10Businganinduciblehomologousrecombinationsystem.GeneTher6,442-7.（1999）.

8.Swaminathan,S.etal.Rapidengineeringofbacterialartificialchromosomesusingoligonucleotides.Genesis29,14-21.（2001）.

9.Yu,D.etal.AnefficientrecombinationsystemforchromosomeengineeringinEscherichiacoli.ProcNatlAcadSciUSA97,5978-83.（2000）.

10.Zhang,Y.,Buchholz,F.,Muyrers,J.P.&Stewart,A.F.AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli.NatGenet20,123-8.（1998）.

11.Zhang,Y.,Muyrers,J.P.,Testa,G.&Stewart,A.F.DNAcloningbyhomologousrecombinationinEscherichiacoli.NatBiotechnol18,1314-7.（2000）.

12.Muyrers,J.P.,Zhang,Y.,Buchholz,F.&Stewart,A.F.RecE/RecTandRedalpha/Redbetainitiatedouble-strandedbreakrepairbyspecificallyinteractingwiththeirrespectivepartners.GenesDev14,1971-82.（2000）.

13.王军平,张友明.Red/ET重组及其在生物医学中的应用。

生物工程学报21,502-506.（2005）.

附录

质粒图谱

pBACe3.6

pL253

pL451

pL452