Western Blot实战指南从电泳到定量.docx

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WesternBlot实战指南从电泳到定量

【转】WesternBlot实战指南：

从电泳到定量-1

样品制备：

变性条件——SDSLB直接裂解：

用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加到细胞或者组织上并煮样。

通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。

通常条件下，SDSLB都是过量的（因此不一定要严格参考SDSLB稀释比）；如果SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。

这时候常规做法有两种，1.再煮5min。

常规煮样时间3-5min，样品过浓时就煮10min；2.如果10min煮样后，仍然吸不起来，才适当增加SDSLB，继续煮；也可以对样品进行超声。

煮样时间若过长，蛋白会凝固，此时以失去继续WB的意义，请丢弃（判断标准：

出现明显的蛋白沉淀和水分层）

此方法的缺点，SDSLB煮过的样品如果用来做IP，需要特殊方法，因此，这种制备方法制备的样品有使用局限。

非变性裂解法（不讨论诸如核抽提、亚细胞器分离等等了，其实类似）

裂解细胞请尽量冰上操作，减缓酶解作用。

俺前bossnature文章上的裂解液配方是：

20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors（20μg/mlleupeptin,10μg/mlpepstatinAand10μg/mlaprotinin）（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制剂很复杂也很贵，其实用0.5mMPMSF替代这三种就好了；如果还要做磷酸化蛋白，加1mMNa3VO4（现加现用），10mMNaF,1mMNa3VO4,50mMbeta-GP。

此方法的优点：

NaCl浓度略低于生理状态，保证裂解细胞的方式较为温和，便于随后的IP等试验。

其他Na盐浓度的细胞裂解液也很常见，诸如0.15M（生理盐浓度）、0.3M、0.6M（高盐系列，裂解细胞时染色体会析出，细胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下适合IP试验，0.6M及以上适合纯化蛋白，尤其相互作用较强的复合体，要得到纯化的一些复合体的组成蛋白一般采用极端的高盐裂解细胞。

用于核蛋白的裂解的原因是0.5%NP-40，用于破坏核膜结构；可用到1%，但此时染色体会析出，沉淀粘稠。

组织块裂解：

组织块较大用匀浆的方法最合适，现在有不少转头很小的匀浆器。

当组织超微量的时候，比如50mg新鲜癌组织，我采用的方法是

1.低温（剪）搅碎，成肉糜状。

2.锡箔纸包裹好，放入少量液氮，快速敲击（控制力量，尽量避免弄破锡箔纸），进一步破碎；反复多次。

3.用上述细胞裂解液回收。

分泌型蛋白富集：

用无血清培养基培养细胞，收集上清液用于WB检测；如果含量过低，需要用TCA沉淀富集。

理论上，从普通培养基中收集分泌蛋白，此时对细胞生长条件的影响最小，是最佳的实验条件；但是这存在隐忧。

因为含血清的培养基中含有非常丰富的BSA（牛血清白蛋白）之类的蛋白质，除非你进一步分离纯化，否则直接用这种样品去WB会有非常大的麻烦，尤其当你的蛋白在60-46kDa之间的时候；用“任何”抗体去检测这一区间的蛋白，会有一片非常强的信号。

因为此区间蛋白（主要是BSA）浓度过于富集，会非特异性粘附“任意”抗体，从而最终被识别。

同理，采用SDSLB裂解细胞制备样品前，通常要用PBS洗涤，其目的之一是去除培养基中的BSA。

采用无血清培养基收集细胞上清除了改变细胞的生理状态外（可能激活未知信号途径，诸如AKT等），还会出现的问题是：

1.即使采用了无血清收集上清，仍然有大量杂蛋白，但相对好很多。

2.选用了上清，由于蛋白浓度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。

a.TCA沉淀对半定量操作要求非常高，因为很容易沉淀不充分或者离心操作丢失，尤其在离心过程，离心管的摆放非常讲究，要180度翻转离心两次。

b。

重新溶解时，由于蛋白需要在一定的盐离子条件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的条件，相对麻烦。

实际上，如果你不是非常强调蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建议检测上清，尤其半定量的WB实验检测不同样品间的差异。

这里面有实验操作细节的麻烦——经验之谈，我曾经参与的cancercell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的数据是celllysis；偶尔用到上清，也只是作为富集纯化该蛋白的原料，为进一步分析做准备。

样品制备完，应立即低温保存（-20度短期（几天）；-80度长期；例外，IP用样品应直接进行IP，避免冻融破坏蛋白质间弱的相互作用）。

SDSLB煮沸过的样品冻融会存在另一个问题，SDS沉淀；SDS4度就会沉淀，何况-80度。

上样前应加热充分溶解，否则从加样口向下拖带（SDSLB不够，样品未充分溶解也会出现类似拖尾；上样过大也会）。

在样品制备过程中，另一个需要注意的问题是，从样品制备的起始阶段就要注意定量问题；WB本身系统误差有20%，太细微的差别经常忽略不计。

细胞样品可以先计数再接种，短时间内即使细胞生长有差异也不会对WB结果影响太多。

组织样品，从肿瘤组织的大小（称重）开始，裂解液的体积都是精确定量的，操作过程也尽量避免蛋白损失。

有人会说可以电泳前蛋白定量，我将下一节讨论蛋白定量的不科学性，以及裂解液成分对定量的干扰。

蛋白电泳：

电泳胶的制备、配方、缓冲液配方，请参考分子克隆。

经验之谈，8%胶最底边约36KDa，10%最底边约25KDa，12%最底部约12KDa。

8%胶可以跑300KDa-36KDa之间的任意蛋白，转膜效率对WB结果的的影响都问题不大。

12%，180KDa左右，转膜效率对WB结果的影响都问题不大（300KDa蛋白如何，没有尝试过）。

电泳一般采用恒流，45mA-55mA（应根据电泳仪器适当调整，要注意仪器最高限压；此条件适合gibcomodelV16型，胶宽20cm）。

采用恒流的优点，保证最快速度完成电泳（电压会逐渐增大），省时且减少扩散；但是由于电泳速度过快时会发热而溶胶，所以你必须想办法散热。

散热不好，条带出现波浪状。

注意事项：

1．聚丙烯酰胺的30%母液会降解，要4度避光保存。

2．APS会失效，10%APS一般保质期才一个月左右。

-20度分装长期保存。

3．注意Trisbuff的PH值，以及平时所用的水的PH值。

PH值改变会使带型非常怪异，所有蛋白和溴酚蓝压成一条细线（即便在分离胶中），如果溴酚蓝前有红色染料，那么此染料彗星式拖尾从溴酚蓝一直延伸到胶底部（溴酚蓝此时涌动极缓慢，位于胶中上部）

4．上下层式电泳装置若漏液，哪边漏液，电泳条带往哪边倾斜。

内外式电泳装置漏液，则装置处于短路状态，液体会过热。

SDS-PAGE胶可能局部自溶，条带扭曲、变形。

5．配胶用玻璃板和边条应及时洗净。

玻板未洗净的坏处很多。

尽管玻璃看似平滑，但是一些细微的凹陷处会凝结肉眼无法分辨的胶颗粒（摸上去疙疙瘩瘩），其坏处是，在该部位极易导致不均匀的胶块，样品经过该处或电泳散热不好，条带变形。

如果是RNA的超薄胶，胶板的颗粒会导致局部巨大气泡，非常难于清除；蛋白胶也会导致一些小气泡的产生。

玻板没洗净的另一个坏处是，由中学物理知识可知，玻璃表面越光滑粘附越牢，未洗净的玻板会削弱和胶体间的粘附力，拔梳子或边条时会产生微小的错动，胶体下部出现大量气泡（夹在玻板和胶之间，这个关系不大）；严重的错动会使上样时，样品从胶和玻璃之间的间隙漏光，或者甚至胶和玻板分开。

为避免拔梳子时的错动，可在电泳缓冲液中拔梳子（比水更好，有SDS润滑）。

判断玻板是否洗干净，用手摸一下有没有疙疙瘩瘩的；最好用洗洁精之类，洗衣粉、肥皂都不好用。

6．上样时，不要把tip深入胶孔过深（或者采用细的尖端拉长的专用上样枪头），可能会错开胶和玻板，样品会泄露。

7．未加样的孔应添加高浓度SDSLB平衡，否则最外侧条带会拉宽变形。

通常20ul样品（含5ul4*SDSLB），可用8-8.5ul4*SDSLB平衡。

同理，点marker的lane也要加入同样体积的LB。

LB若在室温放置太久和新鲜的在比重上会有差异，在新旧LB靠近的地方，条带会拉宽或挤压变形。

因此，同一块胶上，煮样及填空白所用LB应一致。

LB应-20度保存。

8．增加上样量不一定会提高荧光信号强度。

增加上样量的后果通常只能是让你的内参粘连，所有的蛋白条带都扭曲变形。

因为增加上样量最多只能提高几倍，而WB灵敏度是以10的几次幂量级的，所有目的蛋白信号的唯一方案就是IP富集（可特异提高目的蛋白浓度数百数千倍，并去除其它杂蛋白干扰）。

增加上样量的另一个坏处是，本来高表达的蛋白，诸如内参，在同样WB条件下，可能出现荧光灼烧式粹灭（一晃而灭）或者条带中空。

仍以6孔板80%以上汇合度为例，细胞裂解液和SDSLB通常都是投入200ul（最少80ul，这样面积的培养板如果裂解液投入太少，回收时的损失就太大，上样就很难做到一致），而这种浓度条件下制备的样品，电泳时上样量要控制在5-6ul，最少2.5ul，最多10ul，10ul时内参基本已经开始粘连成一条线，带型出现波浪纹；当然并非不可以多上样，再多对WB结果影响不大（没有的仍然没有），且条带都很丑。

9.不同样品上样时，可考虑将样品体积调成一致或类似。

如果一组IP样品和一组细胞裂解液样品，前者通常洗脱体积为15ul，刚好+5ul4*SDSLB达到常规20ul上样体积；后者第8点提到只上5ul，同样+5ulSDSLB（比重同，不会互相挤压），最好补加10ulDDW使总体积一致。

通常这样不同条件获得的样品，中间最好用“空白”泳道隔开（空白仅指无蛋白，仍应加入8-8.5ul4*SDSLB），这样才能确保每条带都很美观。

10.SDSPAGE胶配好暂时不用时，需用电泳缓冲液灌满空间（拔去梳子和底边边条后的间隙），用保鲜膜包裹防止液体蒸发，短期室温或稍长期4度保存。

个人习惯为，灌好分离胶用饱和的正丁醇灌满上层，保鲜膜包裹，次日再灌堆积胶。

两种方案都可以。

所以如果预计次日工作量较大，可以提前灌好SDSPAGE。

样品是否一定需要定量再上样？

——不是的，这是浪费时间的一个操作。

我们首先来讨论一下蛋白定量的科学性。

蛋白定量首先需要一个参照系（标准蛋白），参照蛋白通常选择BSA，也就是说你所谓的定量是对应于BSA的浓度的一个参照值。

这里面存在一个问题，即忽略了蛋白折叠和空间构象对光吸收、折射的影响；不同的蛋白折叠和构象还会影响颜料分子的嵌入。

因此你其实默认将所有的蛋白等同于BSA在溶液中的折叠状态、光吸收情况下，然后做出的一个相对判断，这就存在一个“系统误差”——还不算上测量误差等等，就已经很不准确了。

其次，裂解组织或细胞的时候，那些裂解液中，某些溶剂本身会使CoomassieG250或者Bradford法（实际也是Coomassie染色）显色，尤其是去污剂之类；例如NP40，就会使Coomassie显蓝色，可以完全覆盖掉蛋白与Coomassie作用产生的蓝色。

因此，如果你的裂解液里面含有这类物质，所谓的蛋白定量实际是NP40颜色和蛋白染色的叠加，根本不会符合标准蛋白曲线的线性规律，自然定不准。

【需要说明：

我目前只知道NP40会这样，因为我们从来不去定量，没有做过更深入的研究。

】

实际上保证你的内参一致，是从样品制备开始的，上节末尾有提到，不赘述。

如果你从制备样品时就注意过定量问题，实际上通常内参差别不会太大。

如果真的有差别，通常我们会先跑少量的样品，目的是让Actin或tubulin更清晰、不会粘连、不会过曝光。

从而在第二轮跑正式结果前，根据第一轮