梭菌属Clostridium的检验.docx

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梭菌属Clostridium的检验

梭菌属Clostridium的检验

•该属细菌多数严格厌氧，革兰氏染色阳性，形成芽孢，芽孢直径往往比菌体粗，使菌体膨胀成梭状，但并非梭菌属的细菌均为梭状，如破伤风梭菌，芽孢位于菌体顶端，菌体呈鼓槌状。

•该属细菌能产生多种外毒素和侵袭性酶，致病性强，包括产气荚膜梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌、肉毒梭菌和破伤风梭菌等。

一、产气荚膜梭菌（Cl.Perfringens）

Ø旧名魏氏梭菌，在自然界分布很广。

Ø一定条件下，可引起多种严重疾患，局部组织出现坏死、水肿、产气。

Ø是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一，可引起典型的食物中毒暴发。

由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。

1、形态及染色特征

革兰氏阳性粗大梭菌，3-4×1-1.5µm。

单独或成双排列，有时成短链。

芽胞卵圆形，宽度不比菌体大，位于中央或末端。

培养时芽胞少见，须在无糖培养基中才能生成芽胞。

在脓汁、坏死组织或感染动物脏器涂片可见明显荚膜，无鞭毛，不能运动。

2、培养特性

Ø本菌虽属厌氧性细菌,但对厌氧程度的要求并不太严。

厌氧程度不如破伤风梭菌要求高。

Ø在普通培养基上能生长,若加葡萄糖、血液,则生长更好。

生长适宜温度为37~47℃,多认为43~47℃为最宜本菌生长温度。

繁殖速度极快,在适宜条件下增代时间仅8min,可利用高温快速培养法对本菌进行选择分离,如在45℃下,每培养3~4h传种1次,即可较易获得纯培养。

2、培养特性

（1）血液琼脂平板:

菌落较大、灰白色、不透明，边缘呈锯齿状，多数菌株有双层溶血环，内环是θ毒素的作用，而外环不完全溶血是a毒素所致。

（2）疱肉培养基:

肉渣不被消化，有时呈肉红色。

（3）牛乳培养基:

分解乳糖产酸，使酪蛋白凝固，同时生成大量气体，将凝固的酪蛋白冲成海棉状碎块。

管内气体常将覆盖在液体上的凡士林层向上推挤，这种现象称为“暴烈发酵”，是本菌的特点之一，主要鉴别的指标。

在乳糖、牛奶、卵黄琼脂平板上培养的菌落周围出现乳光浑浊带。

⏹血平板上，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血，外环不完全溶血。

3、生化特性

Ø能分解多种糖类，发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，产酸产气。

Ø分解水杨苷不稳定，不发酵甘露糖;

Ø能液化明胶，还原硝酸盐，产生硫化氢；

Ø不产生吲哚，不能消化已凝固的蛋白质和血清。

Ø产生卵磷脂酶（磷酸酶C）分解卵磷脂为磷酰胆碱与非水溶性甘油二酸酯。

上述卵黄琼脂平板菌落周围出现的乳光浑浊带即属本反应。

Ø由于发酵乳糖菌落周围的培养基颜色发生变化（中性红指示剂呈粉红色）,不消化牛奶,不分解游离脂肪,菌落周围不出现透明环及虹彩层。

4、致病因子与致病性

Ø产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染性疾病。

Ø毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，有12种外毒素（αβγδεηθικλμν）和具有毒性作用的多种侵袭性酶（卵磷脂酶、纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶和DNA酶），构成强大的侵袭力。

Ø在各种毒素和酶中，以α毒素最为重要，α毒素是一种卵磷脂酶，能分解卵磷脂，损伤多种细胞的细胞膜，引起溶血、组织坏死，血管内皮细胞损伤，使血管通透性增高，造成水肿。

Øθ毒素有溶血和破坏白细胞的作用，胶原酶能分解肌肉和皮下的胶原组织，使组织崩解，透明质酸酶能分解细胞间质透明质酸，有利于病变扩散。

Ø本菌能由消化道或创伤侵入机体内，引起人类和动物的多种疾病，其中最重要的是气性坏疽。

Ø根据细菌产生外毒素的种类差别，可将产气荚膜梭菌分成A、B、C、D、E、F6个型：

⏹A型：

人气性坏疽和食物中毒；B型：

羔羊痢疾；

⏹C型：

绵羊猝死，人坏死性肠炎D型：

牛肠毒血症；

⏹E型：

犊牛、羔羊肠毒血症。

5、微生物学诊断

（1）直接涂片镜检：

G+大杆菌，并有荚膜;

（2）分离培养：

接种血平板，有双层溶血环;

（3）纯培养：

引起牛奶暴烈发酵;

（4）动物试验：

小鼠、家兔或鸽，出现“泡沫肝”;

（5）肠毒素检查：

取回肠内容物，加适量灭菌生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份不加热，一份加热，分别静脉注射家兔或小鼠。

如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。

二、肉毒梭菌（Cl.botulinum）

Ø肉毒梭菌是厌氧芽孢杆菌属成员,为严格厌氧菌,是一种腐物寄生菌。

Ø在自然界中分布广泛,遍布于土壤、江、河、湖、海、沉积物等中,水果、蔬菜、畜、禽、鱼制品中亦可发现,偶尔见于动物粪便中。

Ø一般认为土壤是肉毒梭菌的主要来源。

Ø污染食品主要存在于密闭比较好的包装食品中,在厌氧条件下,产生极其强烈的肉毒毒素。

Ø其毒性作用是目前已知化学毒物和生物毒素中的最为强烈的一种,比氰化钾的毒力还大10000倍。

1.形态及染色特征

•厌氧性的杆状菌,形成芽孢,芽孢比繁殖体宽,呈梭状,新鲜培养基的革兰氏染色为阳性,产生剧烈细菌外毒素,即肉毒毒素。

•肉毒梭菌为多形态细菌,约为4um×1um的大杆菌,两侧平行,两端钝圆,直杆状或稍弯曲。

•芽孢为卵圆形,位于次极端,或偶有位于中央,常见很多游离芽孢。

•菌落半透明,表面呈颗粒状,边缘不整齐,界线不明显,向外扩散,呈绒毛网状,常扩散成菌苔。

2.生长要求及培养特性

•发育最适温度为25~35℃、最适pH为6.0~8.2。

•在血平板上,出现与菌落几乎等大或者较大的β溶血环。

•在乳糖卵黄牛奶平板上,菌落下培养基为乳浊,菌落表面及周围形成彩虹薄层,不分解乳糖。

分解蛋白的菌株,菌落周围出现透明环。

3.生化特性

•本菌生化特性很不规律。

•一般能分解葡萄糖、麦芽糖、果糖,产酸,产气。

•对明胶、凝固蛋白均有分解作用,并引起液化。

•不形成靛基质,能产生硫化氢。

但因型、株不同而异。

•胆汁中不生长，不发酵葡萄糖，甘露醇，不分解胆汁七叶苷，吲哚和DNA酶试验阳性。

4.免疫学特性

•根据神经毒素的抗原性分为A-G七个型：

•C型包括C1和C2两个亚型。

引起人食物中毒的主要是A、B、E和F型,C2和D型主要对家禽致病,C1型主要引起水禽中毒。

•各型毒素基因序列有很高的同源性,且与破伤风毒素基因也有较高的同源性,但其同源程度有一定的差异。

各型之间抗原性不同,其毒性只能被相应的抗毒素所中和。

Ø按其生理特征还可以分为3个群:

•I群为蛋白质解性,能水解凝固蛋白质,其菌株培养最适温度为35℃,包括A、B和F型;

•Ⅱ群为非蛋白质解性,不能水解凝固蛋白质,其菌株培养最适温度为26℃,包括E、B和F型;

•Ⅲ群包括C和D型,也为非蛋白质解性。

5.抵抗力

•肉毒梭菌的抵抗力一般,所有菌株在45℃以上都受到抑制,加热80℃20min~30min或100℃10min可将其杀死。

•芽孢的抵抗力很强,可耐煮沸1~6h,于180℃干热5~15min,或121℃高压蒸汽10~20min,或100℃5h才能杀死芽孢,10%盐酸须经1h才能破坏,在酒精中能存活2个月。

以A、B型菌的芽孢抵抗力最强。

•肉毒毒素虽然是蛋白质,但抵抗力也很强,80℃30min或100℃10min才能完全将其破坏。

•正常胃液和消化酶于24h不能将其破坏,可被胃肠道吸收而中毒。

•蛋白分解性的肉毒梭菌芽孢比非蛋白分解性的肉毒梭菌芽孢对热具有更强的抵抗力,如A型菌芽孢加热100℃360min或120℃4min方可被灭活,而E型菌80℃20min才能被杀灭。

6.检验方法

肉毒梭菌的检验以检测肉毒毒素为重点,肉毒梭菌菌体的检查一般意义不大。

•检验方法：

前增菌、分离培养、毒素鉴定

•最终要根据产毒试验来鉴定细菌及其型别

•目前肉毒梭菌及肉毒素的检验多采用国标法（GB/T4789.12）。