半夏蛋白及其基因研究进展.docx

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半夏蛋白及其基因研究进展

半夏蛋白及其基因研究进展

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　　5小结与展望

　　半夏蛋白作为半夏类药材中的主要药效成分，具有其特定的化学和生物学特性，可以应用到生物化学，细胞生物学，免疫学，医学，药学，基因工程和植物保护等多个方面。

目前，半夏蛋白的各种生物学特性、生理功能已基本明确，但仍有许多问题亟待解决。

加大对半夏蛋白在抗早孕、抗肿瘤、抗虫方面的药理作用机制的研究，以此期望能开发出新型的避孕、抗癌药物和植物源农药都具有非常重要的意义，这将为单味中药开发及新药开发提供了途径。

同时，很有必要对半夏蛋白基因工程方面进行深入研究，利用基因工程方法来获取半夏蛋白将是一种有效途径，可以快速的、大规模的生产半夏蛋白，这为半夏蛋白走向临床应用提供思路和技术。

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作者：

徐陶，杜娟，谢丽霞，李尚伟

【摘要】　　半夏蛋白是一种从半夏属块茎中分离纯化出的植物蛋白，它是能与甘露糖专一结合的植物凝集素。

半夏蛋白具凝血、抗生育、抗肿瘤、杀虫等多种生物学功能。

文章综述了半夏蛋白的分离提取、成分结构和性质及其基因工程方面的研究现状，并对半夏蛋白的利用现状和前景也做了简单的论述。

【关键词】半夏蛋白；凝集素；抗生育；抗肿瘤；抗虫；基因工程

　　半夏是我国重要的中药材，其入药首载于《神农本草经》，主要以块茎入药，具有抗早孕、抗肿瘤、镇咳、抗溃疡、抗心律失常、降血脂、镇静催眠、解毒抗炎等药理作用。

另外，在我国民间也有作为杀虫剂使用的记载。

半夏的化学成分有半夏蛋白、生物碱、半夏淀粉、甾醇类、氨基酸、挥发油、芳香族成分、有机酸类、黄酮类、鞣质以及多种微量元素等［1～3］，半夏蛋白是半夏的主要药效成分之一。

　　半夏蛋白（pinellin）是一种从半夏属块茎中分离纯化出来的植物蛋白，它是一种植物凝集素，能与甘露糖专一性结合，具有凝血、抗肿瘤、抗生育、杀虫等重要的药理作用，已成为近年来研究的热点。

　　1半夏蛋白的分离与纯化

　　最早研究半夏蛋白分离提取的是20世纪80年代陶宗晋等［4］，其所采用的硫酸铵盐析与温差结晶相结合的方法被认为是提取半夏蛋白的经典之作。

其操作步骤是榨取三叶半夏块茎鲜汁，冻融去除不溶物；加饱和的硫酸铵沉淀，在室温下盐析后过滤，再经透析处理，溶液置于10℃过夜，离心得到蛋白质溶液；然后在28～30℃下结晶，24h开始出现晶体，一星期便可完全结晶；将所得结晶蛋白用硫酸铵透析平衡去除去沉淀，再用磷酸缓冲液透析,在室温下半夏蛋白晶体便可沿透析袋壁析出。

　　首次从掌叶半夏中提取出半夏蛋白的是上海医科大学的孙光星等［5］，其方法与前不同的是利用了有机溶剂分离沉淀法。

首先将块茎洗净去皮用生理盐水匀浆，离心所得上清液冷却至4℃后，加入2倍体积4℃丙酮进行沉淀；所得粗蛋白溶解于0.9%NaCl溶液后，在4℃下对蒸馏水透析48h，离心除去沉淀得上清液；最后用冰冻真空干燥得到半夏蛋白。

　　王克夷等［6］在陶宗晋的方法基础上，用固定化猪甲状腺球蛋白柱亲和层析，从一次结晶的三叶半夏蛋中得到了纯化的半夏蛋白。

经分析表明此种蛋白与陶宗晋所得的半夏蛋白相似，具有很好的凝血活性，并称之为半夏凝集素（Pinelliaternatelectin,PTL）。

　　2半夏蛋白的一般性质

　　目前，主要采用凝胶渗透色谱分析、光谱测定、SDS-聚丙烯酰胺凝胶、圆二色性等技术对半夏蛋白的成分结构和性质进行了的研究。

研究表明半夏蛋白的分子量约为44kD，含有两个色氨酸，两个酪氨酸和一对二硫键；它可以解聚成四个亚基，各亚基之间以氢键彼此连接维持稳定的构象，其N-端存在着多个氨基酸残基，不含己糖。

从掌叶半夏中提取的半夏蛋白却含有18种氨基酸，其中天冬氨酸含量高，半胱氨酸含量较低，氨基末端为丙氨酸，其pI值在4.3至8.15之间，具有较强的热稳定性和抗酶解能力［3，4，7］。

　　半夏蛋白中α-螺旋含量较少，β-折叠和β-转角含量较多，一定浓度的SDS能使α-螺旋的含量急剧增加，认为是它们构成了半夏蛋白的主要骨架。

6mol/L盐酸胍可使半夏蛋白解聚，又可以用递减式分步透析法使变性解聚的半夏蛋白重天然化，且重天然化的半夏蛋白分子大小、亚基结构、肽键构型和生物活性也保持不变［7，8］。

　　半夏蛋白的紧密结构及晶体结构是由分子中的氢键、二硫键、范德华力等多种次级键共同维系的，故具有较强的热稳定性和抗酶解能力。

然而，半夏蛋白的真实空间构象与功能的关系，各亚基在聚集体中的空间排列以及亚基之间的接触位点和作用等诸多的问题还需更深入的研究。

　　3半夏蛋白的生物学功能

　　3.1半夏蛋白的凝集活性半夏蛋白具有凝血和凝集细胞的生物活性，且存在着种属专一性和细胞类别专一性。

半夏蛋白只能凝集羊、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等红细胞，对人、猪、猴、龟、蟾蜍、鳝的红细胞不具凝集作用，且对不同动物的凝集滴度存在着细小的差别。

半夏蛋白也能与许多细胞结合，但只对小鼠脾细胞、艾氏腹水癌和腹水型肝癌细胞有较强的凝集作用［9］。

　　3.2半夏蛋白的糖结合专一性半夏蛋白不能与半乳糖、藻岩糖、葡萄糖或它们的聚合糖结合，只与甘露糖及其聚合物具有专一结合。

半抗原抑制实验证实半夏蛋白只对甘露糖和含有寡聚甘露糖苷核心的甲状腺球蛋白有抑制作用。

半夏蛋白与甘露糖结合活性也不受常见的金属离子、EDTA的影响，但K＋可明显增加其活性；大多数单糖、二糖也不抑制其活性，但受一些疏水配基形成的糖苷抑制［6，10］。

　　因此，半夏蛋白可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基，也可以将其与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结合部位进行标记等等。

笔者认为半夏蛋白将会在细胞分化和成熟标记、细胞特殊类型的标记如肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标记、肿瘤恶化的标记和不同肿瘤的分化标记等研究中发挥巨大的作用。

　　3.3半夏蛋白的抗早孕活性早在16世纪末，我国明朝李时珍的《本草纲目》中就有”半夏，孕妇忌之”，有“堕胎”的记载。

早期的研究表明制半夏汤剂对大鼠妊娠和胚胎的毒性敏感时间为妊娠的早期和前中期，死胎的几率也显著增加。

半夏毒性在小鼠6～15d内对胚胎的致畸作用最为明显，指出高剂量的用药直接导致胚胎畸形，其主要原因可能是半夏毒性影响了胚胎细胞生长因子，胚胎抗氧化剂的表达以及发生癌变等［11］。

然而，先前的研究均是半夏入药，其药效成分的复杂性决定了半夏抗生育成分无法确定，给半夏抗生育机制的研究带来了相当大的困难。

　　直到20世纪80年代从三叶半夏鲜汁中分离出半夏蛋白，研究了其对小鼠流产作用，这是首次有关半夏蛋白抗生育的报道［4］。

用半夏蛋白对早期妊娠小鼠进行研究，发现给药24h后的鼠体血浆孕酮水平下降，子宫内膜变薄，大部分区域见不到蜕膜反应，胚胎停止发育并死亡［12］。

辣根过氧化物酶标记定位技术结果显示，小鼠子宫内膜和腺管上皮以及胚胎外胚盘锥体部分呈现明显的酶标显色颗粒，它们的产生能被未用酶标的半夏蛋白所抑制，认为这些部位很可能是半夏蛋白抗早孕的作用部位［13］。

若用低剂量半夏蛋白直接注入兔子宫，便可观察到明显的抗着床效应，认为抗着床作用可能是半夏蛋白结合了母体或子体细胞膜上的某些糖结构，改变了细胞膜的生物学行为而导致不着床效应［14］。

　　综上所述，半夏蛋白就是半夏中抗早孕的主要活性成分，其作用部位认为是子宫内膜、腺管上皮细胞和胚胎外胚盘锥体部位。

其抗早孕作用机理可能是半夏蛋白与细胞膜上特定的糖受体结合，改变细胞膜甚至细胞的生物学活性，最终引起内源性孕酮表达水平下降而造成早孕小鼠流产。

因此将半夏蛋白开发成为避孕药物应用到临床中是可行的，但其可行性还有待探讨。

　　3.4半夏蛋白的抗肿瘤作用在中医临床中，有很多关于半夏抗肿瘤的报道。

最早的是上海医科大学妇产科医院，他们利用掌叶半夏鲜汁涂抹患处治疗宫颈癌收到良好的效果，后来改变剂型制出宫颈栓剂，在临床试用中证实掌叶半夏有抗宫颈癌的良好疗效。

半夏的乙醇提取液也具有抗癌作用，能抑制人结肠癌细胞（HT-29）、直肠癌细胞（HRT-18）和肝癌细胞（HepG2）生长；延长腹水模型小鼠的生存时间，并能抑制荷瘤小鼠瘤体生长［15］。

　　近年来，大量的研究表明半夏蛋白是半夏抗肿瘤的主要成分，并成为半夏这味中药研究的热点。

半夏蛋白与甘露糖有很高的专一性结合，在对其细胞凝集作用研究中发现，半夏蛋白对艾氏腹水癌细胞和腹水型肝癌细胞（HepA）有凝集作用［9］。

而动物实验和对肿瘤细胞的病理切片观察发现，掌叶半夏总蛋白对小鼠S-180肉瘤有明显的抑制作用，提示抗瘤部分是新鲜掌叶半夏蛋白［5］。

其后的研究证实掌叶半夏总蛋白对卵巢癌具选择杀伤作用，在杀伤肿瘤细胞时对人脐血造血细胞没有抑制作用，认为其抑瘤作用并不是通过一般的细胞毒作用，而是另有途径［16］。

最新研究结果表明只有用30%硫酸铵沉淀的半夏蛋白对肝癌Bel-7402细胞生长才具有明显抑制作用，认为是半夏蛋白促进Bel-7402细胞的凋亡而达到抗肿瘤的目的［17］。

　　由此看来半夏蛋白具有抗肿瘤作用是无庸置疑的，其作用机制也有初步的探讨和研究。

首先发现半夏蛋白可在人工双分子层中形成了离子通道和能够易化小鼠运动神经末梢的乙酰胆碱量子释放。

随后用双室系统研究发现半夏蛋白通道为非电压依赖性的阳离子通道，且对二价阳离子的选择性略高于对一价阳离子，形成膜通道可以被甘露聚糖所拮抗。

因此，王克夷等［10］认为半夏蛋白抗肿瘤机制是由于分子内有一些疏水结合部位,它们不仅可以自身相互作用形成寡聚体,也可能整合到生物膜内使细胞穿孔，形成离子通道而改变细胞膜的行为致使细胞死亡。

此外，通过PI染色方法结合流式细胞术进行分析，发现半夏蛋白对肝癌Bel-7402细胞和HT-29细胞均有抑制作用，认为其机制是抑制肿瘤增殖和促进肿瘤细胞凋亡［18］。

孙册［9］认为半夏蛋白有促进防御细胞分裂，增强机体免疫力的作用，这也是对半夏蛋白抗肿瘤机制的重要补充。

　　目前，半夏蛋白抗肿瘤的机制主要认为有以下几个方面：

①半夏蛋白整合到生物膜内致使细胞膜穿孔，形成特定的离子通道，而且其离子的通透性具有选择性，由于细胞内外离子浓度改变而非电位逆位作用致使细胞破裂死亡。

②半夏蛋白通过激活特定的信号传导通路，诱导细胞程序性死亡，进而抑制肿瘤细胞增殖和促进癌细胞凋亡。

③增强淋巴细胞有丝分裂活性，增强机体免疫能力等等。

随着现代分子生物学，细胞生物学和免疫学技术的不断革新，对于半夏蛋白抗肿瘤机制的研究也将成为一个十分有趣的课题。

　　3.5半夏蛋白的杀虫功效在我国民间也有半夏和天南星科其他植物作为杀虫剂使用的记载。

首次将半夏蛋白用于杀虫的是20世纪90年代的黄大昉等［19］人，他们用半夏蛋白对蚜虫进行药效实验，发现其对棉蚜和桃蚜有较好的致死性和降低生殖、抑制发育进程的作用。

梁永恒等［20］发现半夏蛋白对褐飞虱有致死作用，且致死作用与浓度呈正相关，还发现半夏蛋白对一定浓度的病毒和侵染力也有显著的抑制效果。

目前，除报道了半夏和掌叶半夏在杀虫方面的研究外，还有发现了异叶天南星、一把伞天南星、朝鲜天南星、东北天南星和花南星等天南星科植物蛋白对刺吸式昆虫和软体害虫都有较好的致死作用。

　　4半夏蛋白的基因工程

　　半夏蛋白的基因工程研究起步较晚，但也取得了较大的成就。

复旦大学首次报道三叶半夏凝集素基因，并得到了它编码的氨基酸序列［21］。

LinJuan等［22,23］先后报道了半夏蛋白和掌叶半夏蛋白基因的原核表达，成功得到了含有包涵体的半夏蛋白，通过纯化得到的蛋白与天然半夏蛋白一样具有与甘露糖专一结合，凝血等活性。

将半夏蛋白基因导入烟草中，得到了成功表达，重组的烟草叶片对同翅目类害虫如蚜虫有明显抗性［24］。

将三叶半夏蛋白基因转入水稻中也获得成功，转半夏蛋白基因水稻纯系对褐飞虱的存活率和发育进度均有明显的抑制作用［25］。

最近，外源半夏蛋白基因也成功整合到转基因菘蓝的基因组中，RT-PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA，表明利用农杆菌介导的半夏蛋白基因转化技术可以培育更多的抗虫植物新品系［26］。

半夏蛋白基因作为新型的靶标基因在转基因植物上取得成功，人们可以培育更多的抗虫新品系，将极大地丰富植物保护领域的研究。