枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究.docx
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枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究
枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究
毕业设计（论文）
课题名称枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究
2014年5月15日
3.1枯草芽孢杆菌的标准曲9
枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究
摘要
本文通过单因素实验和正交试验研究枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的发酵条件（PH、温度、时间、接种量）对枯草芽孢杆菌生长量的影响。
本实验的枯草芽孢杆菌在BPG液体培养基上培养，通过单因实验及正交试验得到最佳的发酵培养条件为：
初始pH7.0；温度35℃；时间20h；接种量为5%。
在此培养条件下的活菌液量为3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的活菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右。
关键字：
枯草芽孢杆菌；正交试验；生长量
Optimizationstudyofbacillussubtiliscultureconditions
Abstract
Inthispaper,westudyBacillussubtilis（Bacillussubtilis）fermentationconditions（PH,temperature,time,quantityof）theimpactonthegrowthofBacillussubtilis.Theexperimentofbacillussubtilisincombinedcultivatedinliquidmedium,isobtainedbysingleforexperimentandtheorthogonalexperimentthebestfermentationcultureconditionsasfollows:
theinitialPH7.0.Temperature35℃;Time20h;Inoculationquantitywas5%.Undertheconditionofthecultivationofthebestamountofbacteriumfluidis3.785x107cfu/ml,comparedtowhenculturedinLBmediumunderthemicrobialquantity:
3.231x107cfu/mlbyabout10times.
Keywords:
Bacillussubtilis;Cultureconditions;increment
1前言
枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种好氧性产芽孢杆状细菌（G+）[1]，其基本特征：
杆菌：
一般0.7-0.8×2.0-3.0µm，电子显微镜测量为0.5-0.6×1.1-3.5µm，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
由于枯草芽孢杆菌是需氧菌在水质净化[2]、工业发酵中发挥着重要的作用，人们开始致力于研究枯草芽孢杆菌应用于这些方面的研究。
关于枯草芽孢杆菌的研究与应用已有100多年的历史，早期大部分工作集中在形态观察、分类鉴定、生理机制、功能发掘及防治等方面。
近年来，对枯草芽孢杆菌的研究渐进到遗传学与分子生物学领域，研究内容体现在特定功能基因的寻找并克隆到需要的物种中或者通过诱变、基因工程等手段对枯草芽孢杆菌生产菌进行遗传改造等。
但目前对该菌种的研究仍然处于实验室的初始阶段的水平。
但是枯草研报杆菌有一系列的优良性状吸引这一些的科学家的目光，他们相信随着经济的发展，枯草芽抱杆菌资源对在工、农、医等方面有重大应用价值，开发利用更具有重要意义。
枯草芽孢杆菌是一类广泛分布于各种不同生活环境中的革兰氏阳性杆状好养型细菌，可以产生内生芽孢，耐热抗逆性强[3]，在土壤和植物的表面普遍存在，同时还是植物体内常见的一种内生菌，对人畜无毒无害，不污染环境。
由于枯草芽孢杆菌生长速度快，营养需求简单，易于存活，定殖与繁殖，无致病性，并可以分泌多种酶和抗生素[4,5]，而且还具有良好的发酵基础，用途十分广泛，国内外有众多研究单位和学者对此菌进行了大量研究，也积累了丰富的研究资料。
通过对枯草芽孢杆菌系列的研究，一方积累枯草芽孢杆菌规律信息为以后开发提供依据；另一方面也可了解芽孢杆菌与生态环境间的相互关系，为芽孢杆菌资源的利用奠定基础[6]。
现在对于枯草芽孢杆菌的主要运用方面：
（1）在水产养殖中的应用
随着水产养殖业的迅猛发展和集约化经营程度的不断提高，养殖水体污染日趋严重，许多养殖池中有害藻类及病菌大量繁殖，水质条件不断恶化，其后果影响到了水产品安全和产业的可持续发展[7]。
利用常规药物防治方法，不但易加重水质恶化程度，成本也较高，而利用微生物制剂改善养殖水体环境受到人们越来越多的关注。
枯草芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性菌，在自然界广泛存在，生命力极强，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力[8]。
枯草芽孢杆菌能有效的降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物，达到净化水质的目的。
因此，枯草芽孢杆菌在养殖水体的生物修复方面得到了广泛的应用[9,10]。
在水体或饲料中添加枯草芽孢杆菌制剂，可以有效抑制或杀灭水体中或养殖生物体内的某些有害致病菌，并且能增强有益菌的群落，而达到防治水产疾病的目的；芽孢杆菌可以降低水体中硝酸盐、亚硝酸盐的含量，从而起到改善水质的作用[11]；芽孢杆菌还可以通过消灭病原体或减少病原体的影响来改善水质；枯草芽孢杆菌对水产中的弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害微生物有很强的抑制作用，有效预防水产动物肠炎，烂鳃等疾病。
同时枯草芽孢杆菌也可以分泌大量几丁质酶的功能。
几丁质酶可分解病原真菌的细胞壁而抑制真菌病害，分解养殖池中的有毒有害物质，净化水质[12-14]；也可以分解池中残饵、粪便、有机物等，具有很强的清理水中垃圾小颗粒的作用。
枯草芽孢杆菌还可以改善有害蓝藻泛溢造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能。
其在水中大量繁殖时分泌的胞外酶可分解、吸收水及底泥中的蛋白质、淀粉、脂肪等有机物，有降低水体富营养化和清除底泥的作用。
在作用过程中，能够促进饲料中营养素降解，有机营养一部分转化为细胞物质，大部分转化为细菌活动的能量。
在其转化过程中，氨气、氮气就从水中逸散到大气用这种方法，水中氨氮和硝基氮可除去。
另一部分有机营养转化为优势的有益菌体，此法广泛应用于河蟹、育苗、虾、甲鱼养殖[15]。
（2）在食品工业上的应用
血栓性疾病严重威胁着人类的生命与健康，其发病率和死亡率居各种疾病之首。
大量的研究表明，饮食习惯与动脉硬化和血栓等疾病有密切的关系，纳豆是日本的传统食品，已经有2000多年的历史。
纳豆是由纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌发酵大豆而成。
日本学者发现在枯草杆菌发现的传统纳豆（Natto）食品中含有一种具有溶解血栓功能的纳豆激酶（Nattokinase）是一种枯草杆菌蛋白激酶[16]，可简称为枯激酶（Bacillokinase）。
该酶在体内除可溶解血栓外，明显地缩短优球蛋白的溶解时间（ELT），以及激活体内的血管内皮细胞产生t-PA，由此可见，可探索开发一种新的溶栓药品。
纳豆是日本的传统食品，已经有2000多年的历史。
由于纳豆中含有能溶解血栓的纳豆激酶[17]，因此很适合作为一种保健食品每天食用。
研究表明，每天食用150g新鲜纳豆可起到预防血栓类疾病的作用。
另外，常吃纳豆对癌症、糖尿病、高血压、动脉硬化、肥胖病等均可起到预防和缓解及治疗作用.
纳豆枯草芽孢杆菌能在肠道内生长，分泌各种酶和维生素，促进小肠黏膜细胞的增殖[18-19]，促进胃肠道各种消化酶活性，并具有抑制肠道内有害菌的作用，能够将人类及其他动物难以消化吸收的大豆蛋白发酵形成大豆多肽和小分子物质的混合物；同时此菌在不利环境中形成芽胞，能耐高温高压，经受饲料加工工艺要求，易贮存。
目前很多研究均显示，枯草芽胞杆菌可以产生多种抗菌物质[20]抑制病原菌的繁殖并且对生物体本身无害，可提高养殖动物的产品质量，是一种应用非常广泛的益生菌。
因此，近年来枯草芽胞杆菌在饲料开发和生物防治等领域的应用成为研究热点。
（3）在医药方面的应用
枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。
科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽腐肉和碎屑。
枯草芽孢杆菌能够分泌多种酶，其中能够应用到医药领域的酶主要有丝氨酸纤溶性蛋白酶（纳豆激酶）和脂肪酶两种[21]。
日本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，纳豆中含有的纳豆激酶对心血管疾病有很好的预防和治疗作用。
近年来，我国也掀起对纳豆激酶的研究和开发热潮，纳豆激酶的药用价值日益突出，在我国传统大豆发酵食品豆豉中发现了类似纳豆激酶的高活力的纤溶酶，将其产生菌株鉴定为枯草芽孢杆菌，并将豆豉纤溶酶基因克隆到了毕赤酵母中。
同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸也可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。
随着人们对枯草芽孢杆菌性质的深入，发现芽孢杆菌具有稳定性好、抗性强、耐高温、耐酸碱[1]、抑制病原菌繁殖、产生多种酶类、提高动物消化酶活性、分解有机污染物、净化水质等优点，而被广泛应用于水产动物养殖中；于此同时枯草芽孢杆菌又可以产生微生物源性抗菌蛋白[2]；从而国内外研究者掀起对拮抗菌株的筛选、鉴定以及其抗菌物质理化特点等方面进行了大量研究工作的热潮，虽然在实际的应用中，大多停留在实验室等机构试验阶段，但它所展现的应用前景却十分广阔。
枯草芽孢杆菌在培养过程中，由于培养条件掌握不好，常出现活菌数量低、芽孢形成率低等问题，所以本课题尝试通过改变BPG培养基的培养条件来提高枯草芽孢杆菌的产量，期望解决在现阶段的工业化生产中存在着的菌数量低、成本高的问题。
本课题是针对菌株适宜培养基的发酵条件进行研究。
针对发酵液培养基中不同温度、pH、菌种接种量、时间分别进行单因素水平的试验，确定三个较好的水平，在进行四因素三水平正交试验以确定枯草芽孢杆菌的最佳条件。
对此我们对发酵培养基进行优化试验，以提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本。
研究的目的是通过优化发酵培养基的培养条件，提高芽孢杆菌菌株发酵液的含菌量，为大规模工业化生产奠定基础，有助于降低生产成本。
2材料与方法
2.1实验试剂与材料
2.2.1材料
枯草芽孢杆菌（湖南师范大学微生物实验室提供）
2.2.2实验试剂
牛肉膏；蛋白胨；葡萄糖；可溶性淀粉；氯化钠；磷酸氢二钾；硫酸锰；琼脂；去离子水
2.2主要仪器与设备
超净工作台；灭菌锅；培养皿若干；电子天平；250ml锥形瓶若干；玻璃棒；酒精灯；试管；移液管；移液枪；分光光度计
2.3试验方法
2.3实验过程
曲线制备→单因素测定→正交试验
2.3.1培养基及基础条件确定
培养基BPG培养基[22]：
牛肉膏3.3ｇ、蛋白胨3.3ｇ、葡萄糖3.3ｇ、淀粉3.3ｇ、Nacl3.3ｇ、KH2PO43.3ｇ、MnSO4·7H2O0.2ｇ，加纯化水定容至1000ml，调PH值为7.0初始培养条件：
接种量：
5-10%；pH：
7.0-7.2；温度：
30℃-35℃；时间：
16-20h。
2.3.2比浊法测定细菌浓度
比浊法原理是在一定范围内，菌悬液中细胞的浓度与混浊度成正比，即与光密成正比，菌越多，光密度越大。
因此用分光光度计在一定波长（420nm）下，测定菌悬液的以光密度（即OD值）表示菌量。
枯草芽孢杆菌标准生长曲线的确定在BPG液体培养基上接种枯草芽孢杆菌原菌液，按优化条件培养，并每隔3h取样测定OD值和平板菌落计菌数。
3结果与分析
3.1枯草芽孢杆菌的标准生长曲线
在确定的培养基的基础上，每隔3小时取样测定OD值，并且通过平板菌落计菌数如下表一。
时间（h）
0
3
6
9
12
15
18
21
24
OD
0.008
0.034
0.085
0.112
0.153
0.211
0.278
0.246
0.245
活菌数（×107CFU/ml）
0.10
0.50
1.30
1.80
2.60
3.10
3.60
3.30
3.10
OD值与活菌数的关系如下图1。
从图1可以看出OD值与活菌数呈现的关系，得到的关系式Y=1.3×108X+1.6×106R2=0.9706。
在OD值在小于0.278时OD值和活菌数呈现线性的关系。
3.2单因素试验结果
杆菌外_________________________________________________________________________________________________________________________在确定BPG液体培养基的基本组成成分（0.34g牛肉膏、0.34g蛋白胨、0.34g葡萄糖、0.33g磷酸二氢钾、0.33g氯化钠、0.33g淀粉、0.02g硫酸锰、pH7.0、100ml水）的前提下，通过四个单因素实验确定葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸二氢钾的最适含量。
实验结果如下。
3.2.1温度对枯草芽孢杆菌生长量的影响
本实验选取25、30、35、40、45℃5个温度为培养温度的变化来研究温度对枯草芽孢杆菌的生长量的影响。
培养基的接种量为5%、初始pH7.0，培养18h，的其他因素的变量不变的条件下，测定OD420值，根据最大生长量，选出最适温度。
实验结果如表二及图2。
表二不同温度对枯草芽孢杆菌的OD420值影响
温度
OD420值
25℃
30℃
35℃
40℃
45℃
A1
0.201
0.240
0.270
0.219
0.199
A2
0.203
0.241
0.271
0.221
0.199
A3
0.205
0.242
0.272
0.223
0.199
平均值
0.203
0.241
0.271
0.221
0.199
图2温度对枯草芽孢杆菌生长量的影响
图2显示，当温度的变化分别为25℃、30℃、35℃、40℃以及45℃时，到的活菌数（×107CFU/ml）分别为2.799、3.293、3.683、3.033以及2.747。
所以有图2分析可知，起初随着温度的升高，活菌数目会增加，当温度为35℃时，枯草芽孢杆菌的数量达到最多；随后继续升高温度，反而枯草芽孢杆菌的数量呈现下降趋势。
由于温度对微生物生长的影响是影响在生物体内所进行的许多生化反应，达到影响微生物的生长。
在一定温度范围内，生化反应速率随温度上升而加快；超过一定限度，则细胞功能下降以至死亡。
故此温度的选择为35℃适宜。
3.2.2pH值对枯草芽孢杆菌生长量的影响
本实验选取5.0、6.0、7.0、8.0、9.05个PH为培养时PH的变化来研究PH对枯草芽孢杆菌的生长量的影响。
培养基的接种量为5%、初始温度35℃，培养18h，的其他因素的变量不变的条件下，测定OD420值，根据最大生长量，选出最适PH。
实验结果见表三及图3。
表三不同pH对枯草芽孢杆菌的OD420值影响
pH值
OD420值
5.0
6.0
7.0
8.0
9.0
A1
0.179
0.213
0.255
0.201
0.178
A2
0.178
0.213
0.256
0.202
0.176
A3
0.177
0.213
0.257
0.200
0.177
平均值
0.178
0.213
0.256
0.201
0.177
图3PH对枯草芽孢杆菌生长量的影响
从图3显示，当PH变化分别为5、6、7、8以及9时，得到的活菌数为：
（×107CFU/ml）分别为2.474、2.929、3.488、2.773以及2.461。
所以从图3直观分析可知：
开始随着PH的增加，活菌数量呈现增加，当PH为7.0时枯草芽孢杆菌的数量达到最多；随后继续PH增加，反而枯草芽孢杆菌的数量呈现下降趋势。
由于不同微生物对pH条件的要求各不相同它们只能在一定的pH范围内生长，对pH条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力。
本实验的枯草芽孢杆菌在PH6到PH8之间的生长时的活菌数相对变化差距不大，从而可知在中性环境下相对适合枯草芽孢杆菌的生长；在PH<5和PH>9下的活菌数相比较少，可知在过酸和过碱的环境相对不适应枯草芽孢杆菌的生长，故此最适PH为7.0。
3.2.3接种量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
本实验选取1%、3%、5%、7%、9%5个接种量为培养时接种量的变化来研究接种量对枯草芽孢杆菌的生长量的影响。
培养基的初始PH为7.0、初始温度35℃，培养18h，的其他因素的变量不变的条件下，测定OD420值，根据最大生长量，选出最适PH。
实验结果如表四及图4。
表四不同接种量对枯草芽孢杆菌的OD420值影响
接种量
OD420值
1%
3%
5%
7%
9%
A1
0.144
0.177
0.234
0.210
0.188
A2
0.145
0.178
0.234
0.212
0.189
A3
0.146
0.179
0.234
0.211
0.190
平均值
0.145
0.178
0.234
0.211
0.189
图4接种量对枯草芽孢杆菌生长量的影响
从图4显示，当接种量变化分别为1%、3%、5%、7%以及9%时，得到的活菌数为（×107CFU/ml）：
2.045、2.474、3.202、2.903以及2.617。
所以从图4直观分析可知：
接种量从1%到5%之间增加接种量，活菌数随着接种量的增加而增多，当接种量5%活菌数达到最多；大于5%时随着接种量的增加反而活菌数减少，反到不利于培养枯草芽孢杆菌。
故选择最佳的接种量为5%。
3.2.4时间对枯草芽孢杆菌生长量的影响
本实验选取14h、16h、18h、20h、22h5个时间为培养时时间的变化来研究时间对枯草芽孢杆菌的生长量的影响。
培养基的初始PH为7.0、初始温度35℃，接种量为5%，的其他因素的变量不变的条件下，测定OD420值，根据最大生长量，选出最适PH。
实验结果如表五及图5。
表五不同培养时间对枯草芽孢杆菌的OD420值影响
时间
OD420值
14h
16h
18h
20h
22h
A1
0.161
0.220
0.276
0.275
0.245
A2
0.161
0.221
0.277
0.275
0.246
A3
0.161
0.222
0.278
0.275
0.247
平均值
0.161
0.221
0.277
0.275
0.246
图5时间对枯草芽孢杆菌生长量的影响
图5显示，当时间的变化分别为14h、16h、18h、20h以及22h时，到的活菌数（×107CFU/ml）分别为2.253、3.033、3.761、3.735以及3.258。
所以有图5分析可知，起初随着时间的推移，活菌数目会增加，当时间为18h时，枯草芽孢杆菌的数量达到最多；随后继续增加培养时间，反而枯草芽孢杆菌的数量呈现下降趋势。
由于时间主要影响枯草芽孢杆菌的生长周期，培养的时间过长反而使得其处于衰退期不利于枯草芽孢杆菌的生长，影响它的数量。
故时间的选择为18h适宜。
3.3正交试验结果分析
参照单因素实验结果，确定了BPG培养基（牛肉膏3.3ｇ、蛋白胨3.3ｇ、葡萄糖3.3ｇ、淀粉3.3ｇ、Nacl3.3ｇ、KH2PO43.3ｇ、MnSO4·7H2O0.2ｇ、水1000ml）以影响枯草芽孢杆菌的生长条件PH、温度、时间、接种量为四个影响因素，取各自的三个不同水平进行正交试验，因素水平表见表
表3.3正交试验设计直观分析表
序列号
因素
活菌数（×107CFU/ml）
A
温度
B
pH
C
接种量浓度
D
时间（h）
1
1（30℃）
1（6）
1（3%）
1（16）
2.643
2
1
2（7）
2（5%）
2（18）
3.566
3
1
3（8）
3（7%）
3（20）
2.266
4
2（35℃）
1
2
3
3.163
5
2
2
3
1
2.916
6
2
3
1
2
2.591
7
3（40℃）
1
3
2
2.162
8
3
2
1
3
3.162
9
3
3
2
1
2.747
K1
8.475
7.968
8.396
8.306
K2
8.670
9.644
9.476
8.319
K3
8.071
7.604
7.344
8.591
R
0.199
0.680
0.711
0.095
最优组合A2B2C2D3
由表数据可知，因素主次关系为C（接种量浓度）>B（PH）>A（温度）>D（时间）。
通过实验结果的直观分析，2号组合A1B2C2D2的菌体含量最高；但是经过计算分析的最优水平为A2B2C2D3。
所以为了确定最优水平组合，分别按照这两个水平组合的培养基配方，配制BPG液体培养基下培养，测定其OD420值，根据生长量，确定最优水平。
实验结果如表六。
表六
组合
活菌数（×107CFU/ml）
直观最优组合A1B2C2D2
分析的最优组合A2B2C2D3
A1
3.560
3.768
A2
3.562
3.766
A3
3.561
3.777
平均值
3.561
3.777
从表六看出直观的最优组合A1B2C2D2与分析得到最优组合A2B2C2D3比较，在直观的最优组合A1B2C2D2下活菌数量为3.561×107CFU/ml，但是分析得到最优组合A2B2C2D3下得到的活菌数量为3.777×107CFU/ml。
再由表3.3分析可知，因素主次关系为C（接种量浓度）>B（PH）>A（温度）>D（时间），所以分析的得到的最优组合A2B2C2D3较好。
即在温度为35℃，接种量为5%，PH为7.0培养时间为20h。
在这条件下培养的枯草芽孢杆菌数量最多。
4结论和讨论
本文针对的是枯草芽孢杆菌培养条件的优化研究，在培养基BPG的基础上优化培养条件（PH，时间，温度，接种量浓度）四个因素，再进行L9（34）正交试验确定枯草芽孢杆菌的最佳培养条件。
最终确定在保证其他因素不变的情况下枯草孢杆菌在BPG培养基在接种量为5%，PH为7.0，温度为35摄氏度，时间为20h的时候适合枯草芽孢杆菌的生长，在此培养条件下得到的活菌液量为3.785×107CFU/ml，相比在LB培养基下培养时的菌液量3.2×106CFU/ml提高了10倍左右，进一步提高的枯草芽孢杆菌的产
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