实验十二 质粒DNA的小量制备电泳检测及细菌转化.docx
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实验十二质粒DNA的小量制备电泳检测及细菌转化
实验十二质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化
Ⅰ.质粒DNA的小量制备
一实验目的
学习并掌握质粒的小量制备技术。
二实验材料和用具
菌种：
E.coliDH5a/pUC19
培养基：
LB：
Tryptone1%，YeastExtract0.5%，NaCl1%，pH7.2
（Agar2%）；120℃灭菌20min。
D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品）
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、EP管（Eppendorf管，1.5ml微量离心管）、加样器、吸头等。
三原理
实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。
它是一种新型的离子交换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。
而且在提取过程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。
四实验内容
1.细菌培养及菌体的收获。
2.用试剂盒进行小量质粒制备。
五实验步骤
1.将E.coli菌株接种到液体LB培养基中，加入氨苄青霉素至100mg/ml，150rpm振荡16h；
2.吸取1.5ml培养菌液与1.5ml离心管中，13000rpm室温下离心2min。
倒掉上清，然后倒置于吸水纸上，使液体流尽；
3.加入150ml溶液Ⅰ，vortex或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。
4.加入200ml溶液Ⅱ，颠倒离心管6~8次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡；
5.加入500ml溶液Ⅲ，颠倒6~8次，可见白色絮状物产生；
6.13000rpm离心10min。
离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管；
7.直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000rpm离心1min，使质粒结合于纯化柱上；
8.倒弃收集管内的液体，在质粒纯化柱内加入750ml溶液Ⅳ，13000rpm离心1min，洗去杂质；
9.倒弃收集管内液体，13000rpm离心1min，除去残留液体；
10.将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加50ul溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min；
11.13000rpm离心1min，所得液体就是质粒。
质粒于-20℃冰箱保藏备用。
六注意事项
1.在使用前，在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇，然后在瓶盖上作好记号。
2.溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再使用。
溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。
七思考题
1.加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？
附录一：
pUC19图谱
Ⅱ.质粒DNA的电泳检测
一实验目的
学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。
二实验材料
琼脂糖，TAE缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭（EB），标准分子量Marker
电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等
三实验原理
琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的有效方法。
琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。
用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA.。
琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。
四实验内容
对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测。
五实验步骤
1.制胶（见图3）
（1）胶模两端用胶带封严，架好梳子备用；
（2）称取0.2g的琼脂糖于100ml烧杯中，加入20mlTAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却到60℃左右加入EB（终浓度0.5mg/ml），摇匀，即倒入胶模中凝固30min以上；
（3）临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液TAE（淹过胶面），拔取梳子备用。
2.样品准备
取已提取好的质粒DNA5ml于500ml指管中，加入1ml的加样缓冲液，混匀；
3.电泳
（1）将样品和5ml标准分子质量分别点样到梳孔中；
（2）恒压50v，电泳60分钟左右；
（3）电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。
图3灌制水平琼脂糖凝胶
六实验结果
将质粒DNA条带与DNAMWMarker进行比对，对质粒提取结果进行分析。
七注意事项
溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。
附录一
溴化乙锭稀溶液的处理
（适用于含有0.5mg/ml的溴化乙锭的电泳缓冲液）
方法一
1.每100ml溶液中加入2.9gAmberliteXAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm&Haas公司购置；
2.于室温放置12小时，不时摇动；
3.用Whatman1滤纸过滤溶液，丢弃滤液；
4.用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物予以丢弃。
方法二
1.每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；
2.于室温放置1小时，不时摇动；
3.用Whatman1号滤纸过滤溶液，丢弃滤液；
4.用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物予以丢弃。
附录二
1.电泳缓冲液
Tris-乙酸（TAE）：
0.04mol/LTris-乙酸，0.001mol/LEDTA。
浓储藏液液（50×TAE）：
每升含有242gTris碱，57.1ml冰乙酸，10ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）
2.0.5mol/LEDTA（pH8.0）
在80ml蒸馏水中加入18.61gEDTA-Na·2H2O，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1000ml，分装后灭菌备用。
Ⅲ大肠杆菌的转化实验
一实验目的
学习并掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及外源基因导入细胞的技术。
二实验材料和用具
菌种：
E.coliDH5a；
质粒：
pUC19；
培养基：
LB：
1.LB液体试管：
5ml/管；
2.LB液体三角瓶：
20ml/250ml三角瓶；
3.LB+Amp平板：
Ampicillin加量100mg/ml；
器材：
恒温培养箱、恒温摇床、离心机、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、涂布棒、EP管、
可调移液器、吸头等。
三实验原理
转化活性是检测质粒生物活性的重要指标。
用于转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，以防止对外源DNA的切割。
质粒能否进入受体细胞取决于该细胞是否处于容易吸收外源DNA的感受态。
细胞的感受态可以通过理化因素诱导产生。
大肠杆菌是常用的受体菌，其感受态一般是通过用CaCl2在0℃条件下处理细胞而形成。
细胞处于0℃的CaCl2低渗溶液中，会膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，转化混合物中的质粒DNA形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合粘附于细胞表面，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA复合物，在LB培养基上培养数小时后，球形细胞复原并增殖，在选择培养基上便可获得所需的转化子。
四实验内容
1.制备E.coliDH5a的感受态细胞；
2.进行质粒pUC19的转化
五操作步骤
1.菌种在LB液体培养基中活化，37℃，150rpm振荡培养过夜；
2.转接到新鲜LB液体培养基中，接种量5%；
3.37℃，150rpm培养至OD600=0.2~0.25；
4.将培养液放入冰浴冷却10min；
5.取1.5ml培养液于6500rpm离心5min，弃上清液；
6.加0.75ml冰冷CaCl2溶液（50mmol/LCaCl2，10mmol/LTris，pH8.0），用混匀器混匀或用手指弹离心管混匀；
7.将离心管置于冰浴45min；
8.6500rpm5min离心收集细胞；
9.将细胞小心悬浮于0.1ml冰冷CaCl2溶液中（用移液器小心混匀）；
10.加1μl质粒，小心混匀，置冰浴45min；
11.将离心管置于42℃恒温水浴热处理2min（准确！
）；
12.加1mlLB液体培养基后于37℃、150rpm振荡培养1h；
13.取0.1ml培养液涂布至LB+Amp平板上；
14.将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。
六实验结果
观察转化结果，并进行分析。
七思考题
1.本实验成功的关键是什么？
2.什么是感受态细胞，用什么方法获得感受态细胞？
3.本实验中转化的原理是什么？
pUC19质粒有何特点？
兰亭序
永和九年，岁在癸丑，暮春之初，会于会稽山阴之兰亭，修禊事也。
群贤毕至，少长咸集。
此地有崇山峻岭，茂林修竹；又有清流激湍，映带左右，引以为流觞曲水，列坐其次。
虽无丝竹管弦之盛，一觞一咏，亦足以畅叙幽情。
是日也，天朗气清，惠风和畅，仰观宇宙之大，俯察品类之盛，所以游目骋怀，足以极视听之娱，信可乐也。
夫人之相与，俯仰一世，或取诸怀抱，晤言一室之内；或因寄所托，放浪形骸之外。
虽取舍万殊，静躁不同，当其欣于所遇，暂得于己，快然自足，不知老之将至。
及其所之既倦，情随事迁，感慨系之矣。
向之所欣，俯仰之间，已为陈迹，犹不能不以之兴怀。
况修短随化，终期于尽。
古人云：
“死生亦大矣。
”岂不痛哉！
每览昔人兴感之由，若合一契，未尝不临文嗟悼，不能喻之于怀。
固知一死生为虚诞，齐彭殇为妄作。
后之视今，亦犹今之视昔。
悲夫！
故列叙时人，录其所述，虽世殊事异，所以兴怀，其致一也。
后之览者，亦将有感于斯文。
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