植物生理学实验教案山西大同大学.docx

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植物生理学实验教案山西大同大学

山西大同大学

生命科学学院教案

课程名称：

植物生理学实验

教材名称：

《植物生理学实验指导》

授课对象：

生物科学专业本科生

授课学期：

2012～2013学年第二学期

讲课学时：

36学时

授课教师：

李侠

技术职务：

讲师

工作单位：

山西大同大学生命科学学院

编写时间：

2012年

审阅意见：

实验一、植物细胞的质壁分离及死活鉴定（3课时，选做）

【原理】

中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围pH6.4～8.0之间（由红变黄）。

在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应，因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，细胞液不能维持在液泡内，因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象，相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

成长的植物细胞是一个渗透系统，活细胞的细胞质及其表层（质膜和液泡膜）有分别透性，细胞内部含有一个中央液泡，构成液泡的细胞液具有一定的溶质势。

当细胞与外界高渗溶液（即低水势溶液）接触时，细胞内的水分外渗，原生质体随着液泡一起收缩而发生质壁分离，其后，当与清水或低渗溶液（即水势较高的溶液）接触，或当外面的溶质进入细胞时，具有液泡的原生质体重新吸水而发生质壁分离复原。

植物细胞常因原生质和细胞壁结合的紧密程度或原生质的粘性大小而表现不同的质壁分离形式。

质壁分离主要有两种形式：

凸形和凹形，有时把严重的凹形质壁分离叫做痉挛形质壁分离。

质壁分离最初由凹形开始，以后或保持这一形式，或逐渐转为凸形。

保持凹形质壁分离的时间长短与原生质的粘性关系很大，凡是原生质粘性大的，能维持较长时间的凹形，甚至成为痉挛形，而原生质粘性很低的，则较快地转为凸形质壁分离。

本实验将观察由于Ca2+、K+对原生质粘性的不同影响而发生不同形式的质壁分离现象。

经Ca2+处理后，发生凹形质壁分离，经K+处理后则发生凸形质壁分离。

当用硝酸钾的高渗溶液进行长时间质壁分离时，由于细胞质强烈膨胀、变厚，似帽状包围在收缩的液泡两端，因此称为帽状质壁分离。

此时能清楚地区别无色透明的原生质和染成红色的液泡。

受到严重伤害或被杀死的植物细胞，由于原生质体失去了分别透性，因而不能发生质壁分离。

【材料、试剂与仪器】

实验材料：

洋葱鳞茎（或紫鸭跖草叶片）。

试剂：

1．0.03％中性红溶液。

2．lmol/L硝酸钾溶液。

3．lmol/L氯化钙溶液。

仪器设备：

显微镜，载玻片，盖玻片，单面刀片，尖头镊子，小培养皿。

【方法与步骤】

1．选取洋葱鳞茎（或紫鸭跖草叶片）若干块，用刀片在洋葱鳞片内侧或外侧纵横划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将表皮小块轻轻撕下，立即投入中性红溶液中染色（注意应将表皮内侧向下）5～10min后，转移到自来水中浸泡10～15min，放在载玻片上，盖好盖玻片，在显微镜下观察，将发现液泡被染成樱桃红色，细胞核和原生质不染色。

2、从盖玻片的一边滴1滴1mol/L硝酸钾溶液而在对边用滤纸吸水，重复两次，将硝酸钾溶液引入盖玻片下使之与材料接触并立即镜检，可看到细胞内发生凸形质壁分离。

3、观察到质壁分离后，于盖玻片一边小心加清水1滴，于对边用滤纸缓缓吸去硝酸钾溶液（速度不可过快），重复两次，使质壁分离剂（即高渗的硝酸钾溶液）基本上被吸去。

镜检，可看到质壁分离停止进行，相反，带有液泡的原生质体开始重新吸水膨大，最后又充满整个细胞腔，这就是质壁分离复原现象。

质壁分离复原缓缓进行时，细胞仍会正常存活；如进行很快，则原生质体会发生机械破坏而死亡。

4、另取一个制片镜检，从盖玻片的一边滴1滴1mol/L氯化钙溶液而在对边用滤纸吸水，重复两次，将氯化钙溶液引入盖玻片下使之与材料接触并立即镜检，可看到细胞内很快发生凹形质壁分离。

5、从观察到的凹形、凸形、帽状等不同形式的质壁分离中选择典型的细胞各绘一图，并解释观察结果。

实验二、植物细胞渗透势的测定（3课时）

【原理】　　

将植物组织置于对其无毒害的一系列不同浓度的溶液里处理一定时间，然后镜检发生质壁分离的细胞数，通常视野中有50％的细胞发生质壁分离时定为初始质壁分离，细胞初始质壁分离时压力势为零，因而可把引起细胞初始质壁分离的外界溶液称之为等渗溶液，其溶液具有的渗透势即为细胞的渗透势。

由于很难正好找到引起50％细胞发生质壁分离的浓度。

因此通常用插值法求得等渗溶液浓度，代入公式即可计算渗透势。

【器材与试剂】　　　

器材：

显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，刀片，培养皿（或具塞试管），记号笔，滴管。

试剂：

蔗糖。

【方法与步骤】

1、配制0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mol蔗糖/L水的质量摩尔浓度，贮6个试剂瓶中，必要时配制溶液浓度的相差可≤0.05mol蔗糖/L水。

　　2、取6套干净清洁的小培养皿，用记号笔编号，将配制好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。

　　3、将带有色素的植物组织或叶片（可选用有色素的洋葱鳞片的外表皮，紫鸭跖草，蚕豆，小麦，玉米等叶的表皮）撕取表皮迅速分别投入各种浓度的蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，浸泡20-40分钟。

　　4、到时后，取出表皮，放在载玻片上，滴一滴相同浓度的蔗糖，盖上盖玻片，在显微镜下观察质壁分离的细胞数和细胞总数，直接或间接（插值法）地找出引起50％细胞发生质壁分离的外界溶液浓度，即为细胞渗透浓度值。

　　插值法求细胞渗透浓度的公式为：

　　式中Og为细胞的渗透浓度，mg1为引起p1质壁分离的浓度m2为引起P2质壁分离的浓度，P1为由m1溶液引起质壁分离百分数，p2为由m2溶液引起质壁分离的百分数。

　　求得Og按下式计算渗透势

　　ψπ=-iRTOg

　　ψπ为细胞渗透势（bar）；R为气体常数（0.083barL/mol·K）；T为绝对温度（273+t℃）；i等渗系数，蔗糖为1。

实验三、叶绿体色素的提取与分离（3课时，选做）

一、叶绿体色素的提取

【原理】　　

叶绿体中含有叶绿素（叶绿素a与b）和类胡萝卜素（胡萝卜素和叶黄素），这两类色素均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水的混合液提取。

叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。

【器材与试剂】

器材：

扭力天平、量筒、烧杯、具塞试管、研钵、离心机、漏斗、滤纸等。

试剂：

酒精、丙酮、碳酸钙。

【方法与步骤】

1.用于理化性质鉴定和色层分离的叶绿体色素提取：

（1）取新鲜植物叶片，如菠菜叶，先在105℃下杀死，再在80℃下烘干（一次烘干量不能太多），研成粉末，置干燥器中备用，也可用鲜叶直接提取。

（2）称取叶粉2g放入小烧杯中，加入95％酒精20-30毫升，进行浸提。

浸提过程中需用玻棒经常搅动，如气温过低亦可适当加热，待酒精呈深绿色时，将溶液过滤到另一烧杯或三角瓶中置暗中备用。

如用鲜叶，可将剪碎的鲜叶10g，放入研钵中，加少许碳酸钙（中和细胞中的酸，防止镁从叶绿素分子中移出）与20ml丙酮研磨，匀浆过滤，再用10-20ml丙酮反复洗涤研钵与残渣中的色素，滤液即为色素提取液，于暗中保存。

2.用于定量分析的叶绿体色素提取。

（1）叶片中叶绿体色素的提取：

0.5g鲜叶剪成碎条放入10ml或20ml的具塞试管中，加入10ml或20ml的丙酮:

酒精:

水=5:

5:

1的混合液，盖上塞子，放置于40℃温箱中浸提（3小时或更长时间），待叶条褪白后，便可用试管溶液进行定量测定。

（2）叶肉细胞或叶绿体悬浮液的叶绿体色素提取：

在离心管中放入0.1ml叶肉细胞或叶绿体悬浮液，加4.9ml80％丙酮，静止片刻后，用台式离心机3000转/分，离心2分钟，上清液可用于叶绿素含量测定。

二、叶绿体色素的分离

【原理】

当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相（流动相与固定相）间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。

对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。

下面介绍纸层析和硅胶薄板层析分离叶绿体色素的方法。

（一）纸层析法分离叶绿体色素

【器材与试剂】

方法一需要：

大试管、软木塞、大头针、回形针、滤纸、毛细管、电吹风、剪刀、四氯化碳、无水硫酸钠。

　　方法二需要：

培养皿一套（底和盖口径相同）、滤纸、剪刀、小烧杯（5ml）、汽油、苯。

【方法与步骤】

方法一：

将2×22cm的滤纸的一端剪去二侧，中间留一长约1.5cm、宽约0.5cm窄条，见图８-1。

用毛细管取叶绿体色素浓溶液点于窄条上端，用电吹风吹干，如一次点样量不足可反复在色点处点样数次，使色点上有较多的叶绿体色素。

在大试管中加入四氯化碳3-5ml及少许无水硫酸钠。

然后将滤纸条固定于软木塞上，插入试管内，使窄端浸入溶剂中，而色点略高于液面，滤纸条边缘不可碰到试管壁，软木塞盖紧，直立于阴暗处层析。

　　0.5-1小时后，观察色素带分布：

最上端橙黄色（胡萝卜素），其次黄色（叶黄素），再崐次蓝绿素（叶绿素a），最后是黄绿色（叶绿素b）。

　　方法二：

取一张色层分析滤纸，剪成直径稍比培养皿直径大一点的圆形（正方形也可），在滤纸的中心戳一小孔。

另取一长5cm、宽1.5cm的滤纸条，用滴管吸取叶绿体色素提取液滴在纸条一边，使色素扩展的宽度限制在0.5cm以内，电吹风吹干后，再重复数次，（也可把浓叶绿体色素溶液放在平底培养皿中，用滤纸一侧蘸叶绿体色素），然后将纸沿着长轴方向卷成纸捻，使浸过叶绿体色素溶液的一侧恰好在纸捻的一端。

　　将纸捻带有色素的一端插入图形滤纸的中心处的小孔中，使与滤纸刚刚平齐。

　　在培养皿内放一小烧杯（5ml），杯内加入适量汽油和1～2滴苯，把插有纸捻的滤纸平放在培养皿上，使纸捻的下端浸在汽油中，盖好培养皿（图８-2），此时汽油借毛细管引力顺捻扩散到圆形滤纸上，并把叶绿体色素沿着滤纸的四周推进，不久即可看到被分离的各种色素的同心环，待汽油将要达到培养皿边缘时，取出滤纸，用笔标出各色素位置与名称、叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色，叶黄素呈鲜黄色胡萝卜素为橙黄色。

　　图８-2分离叶绿体色素的纸层析装置

（二）硅胶薄板层析分离叶绿体色素

【器材与试剂】

器材：

FS玻璃板（5×20cm2）、烘箱、干燥器、层析缸、毛细管、电吹风、分光光度计、

　　解剖针、刀片、试管、试管架等。

试剂：

硅胶G、苯、冰醋酸。

【方法与步骤】

1.层析板制作。

将硅胶G与蒸馏水以1：

2比例混合，加几滴酒精搅匀后，均匀涂布在干净的玻璃板上，成一薄层，并平放在水平桌面上凉干，然后放在105-110℃烘箱中烘半小时，置干燥器中备用。

2.点样。

用毛细管或微量注射器吸取浓缩的叶绿体色素点样于薄板上，并成一直线（离一端1.5-2cm处），也可反复点样数次，以增加薄层对样品的载量，点样线不可太粗，应控制在2mm左右。

3.展层：

将点过样的薄板置于已预先用苯：

冰醋酸为9：

1的展层溶剂（也可用石油醚:

丙酮:

正丁醇=90:

10:

4.5的混合液）饱和的层析液中，点样线高于展层溶剂，采用上行垂直展层，待展层溶剂前沿走至离玻璃板另一端还有1-2cm时取出，可观察到色素已分离为若干条色带，加以记录和辨认。

4.计算分配系数（Rf）值：

原点到层析点中心的距离（r）/原点到溶剂前沿的距离

　　5.色素吸收光谱的测定：

（1）将薄层层析分离出的各色素用刀片或解剖针刮入具塞试管中。

（2）各加入5ml的丙酮，溶解后，倾出各管上清液备用。

　　（3）将各管上清液分别倒入比色杯，以丙酮为空白，在分光光度计上测定各种色素的吸收光谱（自400nm开始，直读到750nm为止，每隔10nm记录一次透光率），并在坐标纸上，以波长为横坐标，透光率为纵坐标，画出各色素的吸收光谱曲线。

　　也可同时测定一下未经层析分离的叶绿体色素的吸收光谱，并与各色素的吸收光谱比较。

实验四、植物生长指标测定方法（3学时）

一、形态指标测定

1、株高测定用卷尺测量从子叶节到生长点的长度。

2、茎粗测定用游标卡尺测量与子叶展开方向平行的子叶节（或子叶节下1㎝处）的茎粗度。

3、叶片数以完全展开叶及叶片长度超过3cm为标准计数。

4、最大叶长/叶宽用直尺测植株最大叶（上数第三或四片叶）的叶长和叶宽。

5、根系长度用直尺测量从根茎结合处到整株最长根根尖的长度。

生长指标相对生长速度计算公式：

（处理后3、6、9天的数值—处理前的数值）/处理前的数值

或者用下式：

相对生长速率（relativeelongationrate，RER）

RER=（L2-L1）/（t2-t1）L2、L1分别为t2和t1时器官长度，t2、t1为胁迫时间。

二、生物量测定

1、地上部/地下部鲜重和干重在植株根茎相连处剪断分为地上部和地下部，用百分之一电子天平测量鲜重；在烘箱中105℃下杀青10～15min后降温到75℃下烘干到恒重，而后用万分之一电子天平测量干重。

2、植株相对含水量测量植株地上部或全株鲜重（W1）和干重（W2）后，用下列公式计算植株地上部或全株相对含水量：

鲜重含水量=（W1—W2）/W1×100%

或者用下式：

干重相对含水量

干重相对含水量=（W1-W2）/W2×100%W1、W2分别为地上部或全株鲜重和干重。

参考文献：

张宪政．作物生理研究法农业出版社1993：

96

实验五、根系对离子选择性吸收（3课时）

【原理】

植物对组成同一盐类的阴离子和阳离子的吸收量不同时，就会改变溶液的ｐＨ值。

通过酸度计测定放根系前后盐溶液的ｐＨ值变化就能判别根系是否对离子吸收具有选择性。

【器材与试剂】

器材：

pH计（或精密pH试剂），量筒，广口瓶

　　试剂：

0.01mg/ml（NH4）2SO4，0.01mg/mlNaNO3，0.01mg/mlNH4NO3。

【方法与步骤】

1、材料准备：

预先在自来水中培养好具有相当大根系的洋葱鳞茎，或其他植物的根系。

　　2、测定实验开始时溶液的原初pH值：

取四个200ml广口瓶，分别放上蒸馏水、0.01mg/ml（NH4）2SO4，0.01mg/mlNaNO3及0.01mg/mlNH4NO3。

取四株根系发育良好，大小相似的洋葱或其他植物材料的根系，分别放在四个广口瓶的溶液中，1～2分钟后，取出并分别测定瓶中pH值作为实验开始的原初pH值。

然后再把根系放回广口瓶中。

　　3、测定植株吸收离子的终态pH值：

在室温下放置3小时左右（放置时间视根的大小，吸收能力和溶液温度而定），取出植株，测定溶液的pH值，记录实验结果按下，并加以分析。

为了避免根系的分泌作用影响实验结果,故用蒸馏水作对照。

实验六、缺素、盐胁迫或遮光处理对植物生理的影响（18学时）

采用砂培法分别设置几个不同的处理，例如设置缺素处理（缺N、缺磷或缺钾等）、盐胁迫及遮光处理等，种植植物，生长约60天测定植株叶绿素含量、蛋白质含量、可溶性糖含量、过氧化氢酶活性和丙二醛含量；比较缺素、盐胁迫或遮光处理植株与正常植株生理指标的差异，并分析原因。

项目一、植物溶液培养或砂基培养

【原理】

只要满足植物正常生长发育的要求（光、温、水、气、必需元素），植物可以在水中或砂中生长。

把必需矿质元素配制成培养液培养植物称溶液培养，而把培养液加于洁净的石英砂中培养植物则称砂基培养。

由于培养液中元素的种类和数量可以人为控制，因此当要了解植物缺乏某种元素时，只要有意识地配制缺乏该种元素的培养液，根据植物在该培养液中所表现出来的症状，便可了解该元素的作用以及对植物生长发育的必要性。

一、溶液培养

【器材与试剂】

　　器材:

　　培养罐（玻璃、瓷质、塑料的均可），通气设备（鱼泵或无油气泵），pH计（或精密试纸），黑纸，贮液瓶（试剂瓶或塑料桶），量筒，移液管，海棉或棉花等。

　　试剂:

　　1.大量元素贮备液:

　　①1mol/L硝酸钙;②1mol/L硝酸钾;③1mol/L硫酸镁;④1mol/L磷酸二氢钾;⑤1mol/L硝酸钠;⑥1mol/L氯化镁;⑦1mol/L硫酸钠;⑧1mol/L磷酸二氢钠;⑨1mol/L氯化钙;⑩1mol/L氯化钾。

　　2.Fe—EDTA溶液:

称5.57gFeSO4·7H2O溶于200ml蒸馏水中，然后把7.45gNa2EDTA溶于水中，加热Na2EDTA溶液，并与FeSO4溶液混合，不断搅拌，冷后定容至1000ml。

　　3.微量元素液:

1000ml水中含有2.86gH3BO3，1.81gMnCl2·4H2O，0.11g

ZnCl2，0.05gCaCl2·2H2O和0.025gNa2MoO4·2H2O。

　　4.供调pH用的溶液:

①1NHCl;②1NNaOH。

　　5.漂白粉溶液:

100ml水中放10片漂白精片。

【方法与步骤】

　　1.准备工作

（1）幼苗准备:

蕃茄，小麦种子用漂白粉溶液灭菌半小时，用灭菌水洗几次，然后放在干净的湿石英砂中发芽，加以蒸馏水培养长至一定高度（5cm左右）。

选择生长势相同的植株进行实验。

（2）培养液准备:

按表1-4分别配制不同的培养液。

表1Hoagland’s（霍格兰氏）完全营养液

大量元素

配方

母液（×100）配制

工作液配制

mol/L

g/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

Ca（NO3）2·4H20

0.004

0.945

500

47.25

1

10

KNO3

0.005

0.607

500

30.35

1

10

MgSO4·7H20

0.002

0.493

500

24.65

1

10

NH4H2PO4

0.001

0.115

500

5.75

1

10

微量元素

配方

母液（×1000）配制

工作液配制

mol/L

mg/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

NaFe-EDTA

30

100

3

1

1

H3BO3

2.86

100

0.286

1

1

MnSO4•4H2O

2.13

100

0.213

1

1

ZnSO4•7H2O

0.22

100

0.022

1

1

CuSO4•5H2O

0.08

100

0.008

1

1

（NH4）6Mo7O24•4H2O

0.02

100

0.002

1

1

表2缺N营养液（N浓度为完全营养液的十分之一）

大量元素

配方

母液（×100）配制

工作液配制

mol/L

g/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

MgSO4·7H20

0.002

0.493

500

24.65

1

10

NH4H2PO4

0.001

0.115

500

5.75

1

10

Ca（NO3）2·4H20

0.0002

0.945

500

47.25

1

0.5

CaCl2

0.0038

0.4218

200

8.436

1

10

K2SO4

0.0025

0.4355

200

8.71

1

10

微量元素

配方

母液（×1000）配制

工作液配制

mol/L

mg/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

NaFe-EDTA

30

100

3

1

1

H3BO3

2.86

0.286

1

1

MnSO4•4H2O

2.13

0.213

1

1

ZnSO4•7H2O

0.22

0.022

1

1

CuSO4•5H2O

0.08

0.008

1

1

（NH4）6Mo7O24•4H2O

0.02

0.002

1

1

表3缺P营养液（P浓度为完全营养液的十分之一）

大量元素

配方

母液（×100）配制

工作液配制

mol/L

g/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

Ca（NO3）2·4H20

0.004

0.945

500

47.25

1

10

KNO3

0.005

0.607

500

30.35

1

10

MgSO4·7H20

0.002

0.493

500

24.65

1

10

NH4H2PO4

0.0001

0.0115

500

5.75

1

1

（NH4）2SO4

0.00045

0.0594

200

1.188

1

10

微量元素

配方

母液（×1000）配制

工作液配制

mol/L

mg/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

NaFe-EDTA

30

100

3

1

1

H3BO3

2.86

100

0.286

1

1

MnSO4•4H2O

2.13

100

0.213

1

1

ZnSO4•7H2O

0.22

100

0.022

1

1

CuSO4•5H2O

0.08

100

0.008

1

1

（NH4）6Mo7O24•4H2O

0.02

100

0.002

1

1

表4缺K营养液（K浓度为完全营养液的十分之一）

大量元素

配方

母液（×100）配制

工作液配制

mol/L

g/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

MgSO4·7H20

0.002

0.493

500

24.65

1

10

NH4H2PO4

0.001

0.115

500

5.75

1

10

Ca（NO3）2·4H20

0.00625

500

47.25

1

15.625

KNO3

0.0005

500

30.35

1

1

微量元素

配方

母液（×1000）配制

工作液配制

mol/L

mg/L

体积（mL）

药品（g）

体积（L）

母液体积（mL）

NaFe-EDTA

30

100

3

1

1

H3BO3

2.86

100

0.286

1

1

MnSO4•4H2O

2.13

100

0.213

1

1

ZnSO4•7H2O

0.22

100

0.022

1

1

CuSO4•5H2O

0.08

100

0.008

1

1

（NH4）6Mo7O24•4H2O

0.02

100

0.002

1

1

配制时先在容器中放蒸馏水或无离子水800ml左右，然后按表上次序加入各种贮备液。

每种贮备液均应缓慢加入，充分搅匀，然后再加下一种贮备液，待全部加好后再用pH计或pH试纸检查，并用1NHCl或1NNaOH将培养液调至适宜植物生长的pH值（如蕃茄pH5.5-6.0，小麦6.0-7.0），然后加水至1升。

（3）容器准备:

选择9个相同的培养罐，如系玻璃或透光塑料的应用黑纸包裹。

如系瓷质罐为避免缸内释放微量元素的干扰，可用塑料袋装培养液放在罐内，培养罐的罐盖上要有孔，二个大孔1个小孔，大孔供插放植株，小孔供安放通气管，通气管头上装一大孔针头，通气管要一一连接在连通气泵的气管上。

开启