生物产甲烷的生化代谢途径现状及问题.docx

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生物产甲烷的生化代谢途径现状及问题

产甲烷生化代谢途径研究进展

方晓瑜1,2,3李家宝1,4,5芮俊鹏1,4,5李香真1,4,5**

1中国科学院环境与应用微生物重点实验室,成都生物所,成都610041

2中国科学院成都生物研究所环境微生物四川省重点实验室,成都610041

3中国科学院大学,北京100049

4中国科学院山地生态恢复与生物资源利用重点实验室,成都生物所,成都610041

5生态系统恢复与生物多样性保育四川省重点实验室,成都生物所,成都610041

摘要微生物产甲烷过程产生的甲烷约占全球甲烷产量的74%。

产甲烷过程对生物燃气生产和全球气候变暖等都有重要的意义。

本文综述了产甲烷菌的具体生化代谢途径，其本质是产甲烷菌利用细胞内一系列特殊的酶和辅酶将CO2或甲基化合物中的甲基通过一系列的生物化学反应还原成甲烷。

在这一过程中，产甲烷菌细胞能够形成钠离子或质子跨膜梯度，驱动细胞膜上的ATP合成酶将ADP转化成ATP以获得能量。

根据底物类型的不同，可以将该过程分为三类：

还原CO2途径、乙酸途径和甲基营养途径。

还原CO2途径是以H2或甲酸作为主要的电子供体还原CO2产生甲烷，其中涉及到一个最新的发现—电子歧化途径；乙酸途径是乙酸被裂解产生甲基基团和羧基基团，随后，羧基基团被氧化产生电子供体H2用于还原甲基基团；甲基营养途径是以简单甲基化合物作为底物，以外界提供的H2或氧化甲基化合物自身产生的还原当量作为电子供体还原甲基化合物中的甲基基团。

通过这三种途径产甲烷的过程中，每消耗1mol底物所产生ATP的顺序为还原CO2途径>甲基营养途径>乙酸途径。

由于产甲烷菌自身难以分离培养，未来将主要通过现代的生物技术和计算机技术，包括基因工程和代谢模型构建等最新技术来研究产甲烷菌的生化代谢过程以及其与其他菌群之间的相互作用机制，以便将其应用于生产实践。

关键词：

产甲烷菌；生化代谢；还原CO2途径；乙酸途径；甲基营养途径

CLCQ939.99

Biochemicalpathwaysofmethanogenesis*

FANGXiaoyu1,2,3,LIJiabao1,4,5RUIJunpeng1,4,5&LIXiangzhen1,4,5**,

1KeyLaboratoryofEnvironmentalandAppliedMicrobiology,ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu,610041,PRChina

2EnvironmentalMicrobiologyKeyLaboratoryofSichuanProvince,ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu,610041,PRChina

3UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,PRChina

4KeyLaboratoryofMountainEcologicalRestorationandBioresourceUtilization,ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,PRChina

5EcologicalRestorationBiodiversityConservationKeyLaboratoryofSichuanProvince,ChengduInstituteofBiology,ChineseAcademyofSciences,Chengdu610041,PRChina

Abstract

Microbialmethanogenesisaccountsforapproximately74%ofnaturalmethaneemission.Theprocessesplaymajorrolesinglobalwarmingandareimportantforbioenergyproduction.Thispaperreviewsthebiochemicalpathwaysofmethanogenesis.Itiscurrentlyacceptedthatmethanogenesisproceedsviathreebiochemicalpathwaysdependingonthecarbonsources,includinghydrogenotrophic,aceticlastic,andmethylotrophicmethanogenesis.Multipleenzymesandcoenzymesareinvolvedintheprocesses,duringwhichNa+orprotongradientiscreatedacrossthecellmembrane,contributingtolimitedATPsynthesis.Inthehydrogenotrophicpathway,CO2isreducedtomethanewithH2orformateasanelectrondonor.Intheaceticlasticpathway,acetateissplitintomethylandcarboxylgroup,thenthecarboxylgroupisoxidizedtoproduceH2whichisusedastheelectrondonortoreducemethylgroup.Inthemethylotrophicpathway,methylgroupisreducedwithexternalH2orreducingequivalentfromtheoxidationofitsownmethylgroup.TheATPgainspermolesubstratefordifferentpathwaysareasfollows:

hydrogenotrophic>methylotrophic>aceticlasticpathway.Duetotheunculturabilityofmostarchaealmethanogens,newtechnologies,suchasbioinformatics,geneengineeringandmodelling,couldbeappliedtoinvestigatethebiochemicalpathwaysofmethanogenesis,andtherelationshipbetweenmethanogensandothermicrobialcommunities.

Keywordsmethanogen;methanogenesis;biochemicalpathways;CO2-reducing;methylotrophic;aceticlasticmethanogenesis

CLCQ939.99

产甲烷菌在地球碳循环中扮演着重要角色，是有机物厌氧降解的末端功能类群，能够将有机碳转化为

甲烷。

它们广泛分布于地球的无氧环境中，从土壤到湖泊沉积物，从陆地到海洋，从零下的低温环境到100℃以上的高温环境，都有产甲烷菌的存在。

进化研究表明产甲烷菌是地球上最为古老的菌群，目前有两个不同的假说均认为产甲烷菌是真核生物的祖先[1,2]。

相比于细菌和真核生物，它以甲烷作为其厌氧呼吸终产物，具有独特的生化代谢特性。

另一方面，甲烷作为一种清洁能源，正越来越受到关注[3]。

同时，甲烷的高红外吸收以及对臭氧层的影响使之成为第二大温室效应气体，其产生的温室效应是CO2的20-30倍[4,5]。

目前全球的甲烷排放量约为5×109-6×109kg/年[6]，其中大约74%的甲烷排放来自生物产甲烷[7]，大气中的甲烷含量正以每年2%的速度递增[8]。

因此研究产甲烷菌的生化代谢途径不仅能够增加我们对古菌特殊代谢途径的了解，而且能够为解决全球能源紧缺以及气候变暖等问题提供理论依据。

产甲烷菌能够利用的底物非常有限，仅能够利用CO2、乙酸和简单甲基化合物这三类物质作为碳源产甲烷。

本文综述了产甲烷菌利用这三类底物产甲烷的具体代谢过程，对其中涉及到的能量转化过程、电子传递途径以及参与的关键酶和辅酶进行了详细阐述，介绍了最新发现的电子歧化途径，即包含FDA蛋白的复合体介导电子在脱氢酶和氧化还原酶之间转移，从而完成能量储存的过程；同时还总结了目前通过一些新技术和新方法对产甲烷菌生化代谢过程研究的进展情况。

1产甲烷菌的特点

产甲烷菌是严格厌氧的原核生物，是已知的唯一一种能够代谢产甲烷的生物。

系统发育学上属于古菌域，广古门菌门（Euryarchaeota）[9]。

已知的产甲烷菌分为7个目：

甲烷杆菌目（Methanobacteriales），甲烷球菌目（Methanococcales），甲烷微菌目（Methanomicrobiales），甲烷八叠球菌目（Methanosarcinales），甲烷火球菌目（Methanopyrales）,Methanocellales和Methanoplasmatales（图1）。

前五个目中已经分离到很多纯菌种，研究较多[8]。

Sakai等[10]于2008年从稻田里分离得到了一种仅利用H2或甲酸还原CO2生长产甲烷的菌株，提出了Methanocellales目；Paul等[11]于2012年在白蚁肠道中分离得到的一种与热原体目类似的菌，它仅能够利用甲醇作为底物生长产甲烷，他们提出了Methanoplasmatales目。

产甲烷菌分布广泛，主要存在于厌氧生态系统中，如

（1）湖泊、沼泽湿地、水稻田、污泥等；

（2）生物体内，如反刍动物的瘤胃和人类、昆虫等的肠道内；（3）土壤中的厌氧团粒，如森林中的土壤团粒；（4）人工生物降解设施，如沼气池和生物反应器；（5）一些极端环境，如热泉、含硫热液口、水底的热流等[8,13,14]。

尽管产甲烷菌在自然界中分布广泛，但其不能利用复杂的有机物作为能量来源，仅能够利用几种简单化合物作为产甲烷的底物，这些物质主要是CO2、乙酸和简单甲基化合物。

根据其利用的底物可以将产甲烷菌分为三类：

（1）还原CO2型，主要利用H2、甲酸作为电子供体还原CO2产甲烷，例如Methanobrevibacter[15]；

（2）甲基营养型，通过H2还原甲基化合物中的甲基产甲烷或通过甲基化合物自身的歧化作用产甲烷，例如Methanococcus[16]；（3）乙酸型，通过裂解乙酸，将乙酸的羧基氧化为CO2，甲基还原为甲烷，例如Methanosaeta[17,18]。

Methanococcales、Methanobacteriales、Methanomicrobiales和Methanopyrales目中几乎所有的甲烷菌都利用H2和CO2途径产甲烷，其中很多种也利用甲酸。

Methanosarcinales由甲基营养型甲烷菌构成，利用含甲基的化合物如乙醇、甲胺等，其中Methanosarcina和Methanosaeta属能够利用乙酸，有些种还可以同时利用H2/CO2，是代谢多样性最高的甲烷菌群。

多数甲烷菌是中温菌，但也有些嗜热菌和耐低温菌。

图1根据已经进行了全基因组测序的产甲烷菌的16SrRNA基因序列构建的系统进化树。

粗竖线后面代表产甲烷菌所对应的产甲烷菌目。

数据来源于Silva（http:

//www.arb-silva.de/）[12]。

Fig.1Phylogenetictreebasedon16SrRNAgenesequencesofselectedmethanogenswhosegenomesaresequenced.Wordsbehindthickverticallinesrepresenttheorderofmethanogens.DataarefromSilva（http:

//www.arb-silva.de/）.

MethanoculleusmarisnigriJR1

MethanomicrobiummobileBP

MethanocorpusculumlabreanumZ

MethanoregulaformicicaSMSP

Methanolineatarda

MethanosphaerulapalustrisE1−9c

MethanocellaarvoryzaeMRE50

MethanocellapaludicolaSANAE

MethanosarcinaacetivoransC2A

Methanosarcinabarkeristr.Fusaro

MethanohalobiumevestigatumZ−7303

MethanococcoidesburtoniiDSM6242

MethanomethylovoranshollandicaDSM15978

Methanolobuspsychrophilus

MethanosalsumzhilinaeDSM4017

Methanosaetaconcilii

Methermicoccusshengliensis

Methanococcusmaripaludis

MethanothermococcusokinawensisIH1

MethanotorrisformicicusMc−S−70

MethanocaldococcusjannaschiiDSM2661

MethanobrevibacterruminantiumM1

MethanosphaerastadtmanaeDSM3091

Methanobacteriumsp.SWAN−1

Methanothermobactermarburgensis

2产甲烷菌的生化代谢途径

甲烷菌的产甲烷过程包括一系列步骤，有众多酶参与（图2），最终将CO2或C1化合物中的甲基还原成CH4。

0.10

2.1关键酶

2.1.1辅酶

生物产甲烷过程需要多种酶和辅酶共同参与。

这些辅酶根据其功能的不同可以分为两类，一类是C1的携带者，主要包括甲烷呋喃（MF）、四氢甲烷蝶呤（H4MPT）、四氢八叠甲烷蝶呤（H4SPT）、辅酶M（HS-CoM）。

另一类是电子载体，主要包括铁氧化还原蛋白（Fd）、辅酶B（HS-CoB）、辅酶F430、细胞色素、FAD、甲烷吩嗪（MP）、辅酶F420[18-20]。

下面就生物产甲烷过程中的几种特殊辅酶进行简单介绍。

MF包含一个呋喃环和一个氨基基团，其中氨基碳用于结合CO2；H4MPT和H4SPT类似，均为四氢叶酸的衍生物，用于甲酰、甲叉和甲基水平上C1的转移，其转移方式与四氢叶酸类似[21]。

HS-CoM是辅酶中分子量最小的一种，化学名称为2-巯基乙磺酸（HS-CH2CH2SO3-）[22]，在甲基转移酶的作用下巯基上的氢原子被甲基基团取代，是甲烷形成过程中的末端甲基载体。

HS-CoB的化学名称为磷酸-7-巯基庚基苏氨酸（7-mercaptoheptanoylthreoninephosphate），它包含一个巯基和磷酸基团，其中巯基为其活性部位。

辅酶F430是一种位于细胞膜上的含镍的类卟吩（porphinoid）化合物，其中Ni为其活性中心，它具有三个价态（+1、+2和+3），通过这三个价态的相互转变实现电子的转移[23]。

MP是一种仅存在于甲烷八叠球菌目中的一种辅酶，其功能与其它细菌呼吸链中的醌类相似[20,23]。

辅酶F420是一种去氮黄素衍生物，其在波长为420nm的紫外光下发出蓝绿色荧光，可以利用这一特点初步鉴定是否存在产甲烷菌细胞[24,25]。

辅酶F420的电势较低，既可作为氢化酶、甲酸脱氢酶和一氧化碳脱氢酶的电子受体，又可作为NADP+还原酶的电子供体[26]。

图2产甲烷的生化代谢途径[27]。

图中反应（12）和（13）是所有生物产甲烷过程必需的生化代谢过程；反应

（1）至（5）是氢型甲烷菌CO2还原途径产甲烷过程所特有的；反应（6）为甲基营养途径所特有的；反应（7）至反应（11）是乙酸途径所特有的生化过程。

Fd：

铁氧化还原蛋白；MF：

甲烷呋喃；H4MPT：

四氢甲烷蝶呤；H4SPT：

四氢八叠蝶呤；F420：

辅酶F420氧化态；F420H2：

辅酶F420还原态；HS-CoM：

辅酶M；HS-CoA：

辅酶A；HS-CoB：

辅酶B；CoM-S-S-CoB：

异质二硫化物。

Fig.2Biochemicalpathwaysofmethanogenesis.Reaction（12）and（13）areessentialforallthemethanogens;reaction

（1）to（5）existsinCO2-reducingpathwayofhydrogenotrophicmethanogen;reaction（6）existsinmethylotrophicpathway;reaction（7）to（11）existsinaceticlasticpathway.Fd:

ferredoxin;MF:

methanofuran;H4MPT:

tetrahydromethanopterin;H4SPT:

tetrahydrosarcinapterin;F420:

oxidizedformcoenzymeF420;F420H2:

reducedformcoenzymeF420;HS-CoM:

coenzymeM;HS-CoA:

coenzymeA;HS-CoB:

coenzymeB;CoM-S-S-CoB:

heterodisulfideofCoMandCoB.

2.1.2关键酶

图2中反应（12）和反应（13）是生物产甲烷过程中共有的步骤。

其中反应（12）是生物产甲烷过程的最后的一步，它是由含镍的甲基辅酶M还原酶（Mcr）催化，以HS-CoB为直接的电子供体还原CH3-S-CoM产生甲烷和CoB-S-S-CoM的过程。

甲基辅酶M还原酶是产甲烷菌所特有的一种酶（除甲烷营养型古菌外）[28]。

因此，编码Mcr其中的一个亚基基因（mcrA）可用于产甲烷菌的分类学研究[29-31]。

Mcr由α、β和γ三种不同的亚基组成一个（αβγ）2六聚体结构，同时，每分子Mcr中含有2分子位于酶的活性中心的含镍辅酶F430[32,33]。

目前通过对该酶的晶体结构分析推测该酶的催化过程分为3步，Ni（I）亲核攻击CH3-S-CoM形成中间产物HS-CoM和[F430]Ni（III）-CH3，随后，Ni（III）氧化HS-CoM形成硫自由基（thiylradical）·S-CoM和[F430]Ni（II）-CH3，最后，HS-CoB作为电子供体还原·S-CoM形成CoB-S-S-CoM并将多余的电子转移给Ni（II）产生Ni（I），H+裂解[F430]Ni（II）-CH3产生甲烷[18,34]。

Mcr具有两种系统发育不同的同工酶，分别为McrI和McrII。

Sabine等[35]通过对Methanobacteriumthermoautotrophicum的研究发现，该菌中同时具有两种Mcr，在H2浓度高时，该菌以McrII为主，而在氢浓度低时，主要以McrI为主起催化作用。

后期研究表明M.thermoautotrophicum中编码这两种同工酶的操纵子在该菌的生长初期主要编码合成McrII，而在该菌的生长后期则主要编码合成McrI，但对这个过程的具体机制目前还不清楚[36,37]。

反应（13）也是所有生物产甲烷所必需的。

其中CoB-S-S-CoM可以被视为产甲烷过程的末端电子受体，它被异质二硫化物还原酶（Hdr）还原，重新释放出HS-CoB和HS-CoM，其反应方程式为CoB-S-S-CoM+2e-+2H+→CoB-SH+CoM-SH[38]。

Hdr是一种与膜相结合的蛋白，目前发现有两种类型，一类是从Methanosarcinabarkeri中分离得到的HdrED，它由一个细胞色素，两个嵌膜的Hdr亚基组成[39]。

HdrED在还原CoB-S-S-CoM时以H2、F420H2或Fdred作为电子供体，通过细胞色素和甲烷吩嗪来传递电子，在这个过程中会消耗细胞质中的质子，产生跨膜质子梯度用于合成ATP。

这种酶对于利用乙酸的产甲烷菌是必须的。

另一类是从Methanothermobacterthermoautotrophicum和Methanothermobactermarburgensis中分离得到的HdrABC。

含有HdrABC的甲烷菌能够利用CO2+H2生长，不能合成细胞色素和甲烷吩嗪[40]。

Thauer等[19]利用模型推测，在这些没有细胞色素的产甲烷菌中存在由HdrABC中的黄素（flavin）介导的电子歧化（bifurcation）过程，认为HdrABC不直接参与能量的储存，而是与产甲烷过程的第一步中的铁氧化还原蛋白（ferredoxin）的还原过程相偶联，产生钠离子梯度，用于ATP的合成。

Buckel等[41]对这个过程进行了详细阐述，具体过程见图3。

Buan等[42]通过对5种Methanosarcinales进行测序发现，这些菌株的基因组中含有hdrED基因，也包含hdrACB基因，但是通过生化方法在Methanosarcinales中还未发现HdrABC。

他们推测要么HdrED或HdrABC对细胞的生长条件存在偏好性，要么HdrED或HdrABC具有特殊的生理功能。

2.2生化代谢过程

2.2.1还原CO2途径

还原CO2途径广泛存在于自然界中，除少数几种产甲烷菌没有还原CO2途径外，绝大多数产甲烷均可以利用该途径产甲烷[19]。

在还原CO2途径中，绝大部分产甲烷菌以H2作为电子供体，在氢酶作用下将电子传递给Fdox还原CO2，因此这些菌又被称作氢营养型产甲烷菌（hydrogenotrophicmethanogen）。

大多数产甲烷菌也能够利用甲酸作为电子供体还原CO2，它们通过依赖F420的甲酸脱氢酶和F420还原性氢酶将4分子甲酸转化为4CO2和4H2，再利用H2和CO2产甲烷[43]。

也有少数产甲烷菌利用CO作为电子供体，在这个过程中3CO先被氧化为3CO2产生电子，用于CO2还原产甲烷[44,45]。

下面就氢营养型产甲烷菌的生化过程做详细介绍。

图3Methanothermobactermarburgensis中MvhADG-HdrABC复合体的结构和功能示意图。

该复合体存在于大多数甲烷菌中（Methanomicrobiales中的一些种除外），可以进行黄素介导的电子歧化过程（flavin-basedelectronbifurcation,即包含FDA