不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究.docx

不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究.docx

《不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究.docx（28页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究

目录

1引言………………………………………………………………………………………4

1.1螺旋藻藻胆蛋白的概述…………………………………………………………………4

1.1.1藻胆蛋白的组成和结构………………………………………………………………4

1.1.2藻胆蛋白的理化特性…………………………………………………………………4

荧光性………………………………………………………………………………………4

光谱特性……………………………………………………………………………………5

1.1.3藻胆蛋白功效…………………………………………………………………………5

天然色素……………………………………………………………………………………5

功能食品……………………………………………………………………………………5

肿瘤等疾病治疗……………………………………………………………………………6

1.1.4藻胆蛋白的提取………………………………………………………………………6

1.1.5培养条件对螺旋藻藻胆蛋白的影响………………………………………………7

1.1.6藻胆蛋白的开发应用…………………………………………………………………8

1.1.7藻胆蛋白的研究展望…………………………………………………………………9

1.2本课题的研究意义………………………………………………………………………9

2实验部分………………………………………………………………………………10

2.1实验材料、药品、仪器…………………………………………………………………10

2.1.1实验材料……………………………………………………………………………10

2.1.2实验药品……………………………………………………………………………10

2.1.3实验仪器……………………………………………………………………………10

2.2实验内容………………………………………………………………………………10

2.2.1藻胆蛋白的提纯……………………………………………………………………10

2.2.2藻胆蛋白的鉴定……………………………………………………………………11

2.2.3藻胆蛋白的含量测定………………………………………………………………11

凯氏定氮测定总蛋白含量…………………………………………………………………11

蛋白质标准曲线的绘制……………………………………………………………………14

藻胆蛋白含量的测定………………………………………………………………………15

2.3数据处理与分析………………………………………………………………………15

3结果与讨论……………………………………………………………………………15

3.1藻胆蛋白的鉴定………………………………………………………………………15

3.2藻胆蛋白的纯度测定…………………………………………………………………17

3.3藻胆蛋白的含量测定…………………………………………………………………18

3.3.1总蛋白含量测定……………………………………………………………………18

3.3.2蛋白质标准曲线的绘制……………………………………………………………18

3.3.3藻胆蛋白的含量测定………………………………………………………………19

3.4藻胆蛋白的比较………………………………………………………………………19

3.4.1总蛋白质含量的比较………………………………………………………………19

3.4.2藻胆蛋白含量的比较………………………………………………………………20

3.4.3藻胆蛋白占总蛋白的质量分数比较………………………………………………21

4结论………………………………………………………………………………………22

5结语………………………………………………………………………………………22参考文献…………………………………………………………………………………23

致谢………………………………………………………………………………………24

不同产地螺旋藻藻胆蛋白的比较研究

摘要：

藻胆蛋白是螺旋藻的主要光合作用蛋白,在螺旋藻中含量很高,因其突出的营养和药用价值而获得了广泛研究与应用。

本实验目的是比较出一种藻胆蛋白含量高的螺旋藻，通过对不同产地螺旋藻藻胆蛋白提取纯化来进行各产地螺旋藻藻胆蛋白的含量的比较分析，这对螺旋藻的开发应用具有一定的市场指导意义。

方法：

本实验以北京、天津、广州螺旋藻为原料，采用超声波细胞破碎法和反复冻融法两种方法进行螺旋藻藻胆蛋白的初提取，然后用硫酸铵盐析沉淀，透析除盐，DEAE纤维素柱层析过柱得到高度纯化的藻胆蛋白，用紫外可见分光光度计测定吸光度，根据标准曲线，计算出各地螺旋藻藻胆蛋白的含量。

结果：

三种产地螺旋藻的藻胆蛋白含量由高至低依次是：

北京>天津>广州，三种产地的藻胆蛋白质量分数分别为北京2.59%，天津2.34%，广州2.21%。

本研究结果为螺旋藻的进一步开发应用和更好的为人类所利用提供了有用的数据。

关键词：

螺旋藻藻胆蛋白提取开发应用

Abstract:

Phycobiliprotein is amajorphotosynthesisofSpirulinaproteincontentinspirulinaandit’scontentishigh,becauseofitsoutstandingnutritionalandmedicinalvalue,itaccesstotheextensiveresearchandapplication.PurposeofthisstudyistocompareaphycobiliproteincontentofSpirulina,phycobiliproteinsfromdifferentre-gionSpirulinatobecomparativean-alysisbythecontentofSpirulinaphycobiliprotein,itcanbeamarketguideofthedevelopme-ntandapplicationofSpirulina.Method:

Inthisstudy,ultrasoniccelldisruptionmethodandfr-eezingandthawingmethodareusedtophycobiliproteinearlySpirulinaextract,andthenam-moniumsulfateprecipitation,dialyzed,DEAEcellulosecolumnchoromatography,togethighlypurifiedphycobiliprotein,determinedabsorbancebyUVspectrophotometer,accordingtothestandardcurve,calculatedthephycobiliproteincontentofSpirulina.Results:

Phycobiliproteincontentofthreedifferentoriginspirulinasisdescending:

Guangzhou>Beijing>Tianjin,Threeoriginphycobiliproteincontentswere2.59%inBeijing,2.34%inTianjin,2.21%inBeijing.TheresultsprovideusefuldataforthefurtherdevelopmentandapplicationofSpirulinaandbetterforhumanuse.

Keywords:

Spirulina phycobiliproteinextractiondevelopmentandapplication

1引言

1.1螺旋藻藻胆蛋白的概述

螺旋藻是一种低等原核藻类,通常为多细胞构成的丝状体、圆柱状,呈疏松或紧密而有规则的螺旋状弯曲,因而得名。

螺旋藻性喜高温（25-26℃）,高碱（pH值9-11）,营光合自养,进行断裂生殖。

自1974年螺旋藻实现工厂化生产以来,得到了广泛研究与应用[1]。

螺旋藻以其全面均衡的营养和极高的防病保健价值受到全世界众多科学家和国际组织的关注和高度评价。

营养学家和医药学家称它是“地球上的营养冠军”、“药源新星”；世界卫生组织认定螺旋藻为“人类21世纪最佳保健品”和“未来超级营养食品”；联合国教科文组织推荐螺旋藻为“明天最理想、最完美的食品”；联合国粮农组织也郑重地向全世界推荐“螺旋藻是人类未来最优良的食物资源和未来食粮”[2]。

螺旋藻蛋白质含量高达50%-70%[3],是一种极好的蛋白源,而其中又以藻胆蛋白（Phycobiliproteins,PBP）的含量为最高,可达细胞干重的25%-28%[4,5],较一般的蓝藻为高。

藻胆蛋白是存在于某些藻类（主要是红藻、蓝藻）的藻胆体中的一类捕光色素复合蛋白。

近年来,随着螺旋藻培养技术的不断完善和螺旋藻产品的不断开发,人们对螺旋藻藻胆蛋白的研究也在深入展开。

1.1.1藻胆蛋白的组成和结构

一般认为螺旋藻藻胆体内只含有两种藻胆蛋白:

藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白[6]。

藻胆蛋白由载体蛋白和发色团——开链线性延展的四吡咯化合物组成,载体蛋白和发色团通过硫醚键连接,迄今已发现有六种连接方式,氨基酸序列分析表明,每个发色团均连接在载体蛋白的半胱氨酸残基上[7]。

每分子藻胆蛋白含二条多肽链α和β,其分子量大约为17-18kD,每条多肽链含一个或多个共价连接的发色团。

藻胆蛋白通常以（αβ）3三聚体或（αβ）6六聚体状态存在[8]。

利用传统分离纯化方法常常会导致（αβ）3三聚体或（αβ）6六聚体的离析。

某些分离得到的藻胆蛋白还含有（αβ）6γ,其中γ亚基分子量为30000[9]。

藻胆蛋白三聚体成圆盘状,厚度为30Å,直径为120Å。

藻胆蛋白的颜色并不单是由发色团决定的,例如藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白均带有藻蓝素基团,但藻蓝蛋白在620nm处有最大吸收值而别藻蓝蛋白在650nm处有最大吸收值[10]。

在藻胆蛋白中,每个发色团的光谱学特性受构象和环境影响很大。

此外,αβ单体之间的相互作用也很重要。

例如,单聚体αβ别藻蓝蛋白在615nm处有最大吸收值,而三聚体（αβ）3别藻蓝蛋白在650nm处有最大吸收值。

1.1.2藻胆蛋白的理化特性

荧光性

藻胆蛋白均是水溶性的,在完整的细胞中,它们是大分子结构的一部分,一旦细胞被破坏,这些大分子即解体,所以需要在分离过程中采取十分温和的手段以保证藻胆蛋白的稳定性。

藻胆蛋白能发射强烈的荧光,其荧光强度比常用的荧光素强30倍,而且具有下列优点:

（1）在较宽光谱范围内有较高吸收系数;

（2）在较宽的pH范围内有较高的荧光产率;（3）它们的荧光不因其它生物分子的存在而消失;（4）有较好的水溶性;（5）液体或固体状态存在时都极为稳定,且能保存较长时间[15]。

因此,近年来藻胆蛋白荧光探针的开发尤为引人注目。

藻胆蛋白在中性介质中光谱学特性稳定,在酸性或碱性介质中,其吸收光谱明显改变,原有的荧光性质也消失。

藻胆蛋白热变性温度在40~45℃左右,因此分离纯化应在40℃以下进行[16]。

光谱特性

光谱特性是藻胆蛋白的主要特性,光谱法是藻胆蛋白定量以及进一步研究其结构与功能的重要方法。

已有资料表明[1,4,17~20],藻蓝蛋白的吸收峰在618~625nm,最大荧光发射峰在645~652nm,别藻蓝蛋白的吸收峰在650nm,最大荧光发射在657~680nm。

值得注意的是,不同资料报道的峰值略有不同,一方面是蛋白质的纯度、溶液pH值不同都会影响其光谱特性;另一方面,当蛋白发生变性时,其光谱特性会发生较大的变化[18]。

变性的藻胆蛋白的可见吸收峰值显著降低,荧光变弱甚至完全消失。

因此,一切导致藻胆蛋白变性的因素（如离子强度、pH、光照、温度等）都能影响其光谱特性。

在活体状态下,多聚体的解离、连接多肽的解离、“棒”与“核”的解离等,也都会使藻胆体、藻胆蛋白的光谱特性发生改变。

而光谱特性的改变也反映了它们结构上的变化。

1.1.3藻胆蛋白功效

天然色素

藻胆蛋白是天然色素蛋白，具强烈荧光性，在红藻和蓝藻中呈现出红色（PE）、紫罗兰色（APC）和蓝色（PC），例如紫球藻中含有丰富的B-PE，已成为具有较高商业价值的天然色素蛋白，它有很好的着色能力且无毒，在食品软饮料和化妆品中广泛应用；大日本油墨公司DaillipponInk＆CbemicalsCoLtd从螺旋藻（Spirutina）中提取藻蓝蛋白，商品为“LinablueA”，用作食物色素，也用于化妆品生产，产品不仅在日本市场广泛销售，美国的保健品部门已把它列为安全性产品。

功能食品

从天然藻类中提取的藻胆蛋白是一种重要的生理活性物质，不仅对人体无害，其独特丰富的营养成分还能发挥特殊功效。

日本学者将从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白，饲喂已经接种肝癌的实验组小鼠，淋巴细胞活性显著增高，提高了机体免疫力，认为其具抗氧化生物活性；赵以军等（1998年）认为藻胆蛋白的藻胆素暗光下能清除体内自由基，延缓人体衰老，降低各种疾病的发生率；日本Tohason，Shubet和Takemoto的实验，还证实了藻蓝蛋白可促进动物对铁的吸收；王广策等认为藻胆蛋白在细胞内可作为蛋白贮存库，杨方美等认为其具有高等动物所必需的氨基酸且含量较高，藻胆蛋白可用作食品优质蛋白添加剂，强化食品中的蛋白质，在功能食品和保健食品中有广泛的应用前景。

肿瘤等疾病治疗

一系列实验证明：

藻胆蛋白具有光敏性，且无毒无副作用，是理想的光敏剂，藻胆蛋白作为一种非常重要的光动力药物的原料，其光敏反应对肿瘤细胞有相当大的杀伤和造血细胞诱导作用。

Iijima等实验证明：

藻蓝蛋白注射肝癌的小白鼠，成活率明显高于对照组，且淋巴细胞活性也显著增高；哈佛医学院的Schwartz和Shklar（1986）也研究发现螺旋藻藻蓝蛋白对一些癌细胞有抑制作用，Morcos（l988）等用含0.25毫克/毫升的藻蓝蛋白处理培养小鼠骨髓瘤细胞，再经514纳米激光辐照300焦/厘米2，发现瘤细胞存活率仅l5%，而单纯采用激光辐照或藻蓝蛋白处理的细胞存活率为69%和7l%；蔡心涵等（1995）用藻蓝蛋白处理2种癌细胞，作体内外激光治癌试验，人大肠癌细胞株HR8348培养后，分别用l00微克、50微克和25微克的藻蓝蛋白处理，经光波为630纳米的铜激光辅照l2焦/厘米2，用MTT法检测培养癌细胞存活率分别为22.2%、37.6%和89.7%，显示良好的剂量效应，用S180移植瘤小鼠，分别给予藻蓝蛋白注射2毫克或口服20毫克后，经铜激光辐照瘤体15天后，有效率分别为50%和53%，而对照组肿瘤不断长大，这些证明藻胆蛋白对癌激光疗法具有增敏作用。

汤国枝等（1994）的离体试验表明，螺旋藻藻胆蛋白能明显刺激红系细胞集落在软琼脂上的生成；张成五等研究发现采用造血祖细胞体外培养技术，藻蓝蛋白能促进Co-R射线照射效果，对正常小白鼠的粒单系祖细胞（CFU-GM）、红系祖细胞（CFU-E、BFU-E）的增殖有明显刺激作用等，认为藻蓝蛋白对骨髓造血具有刺激作用，可用于临床辅助治疗各种血液疾病。

1.1.4藻胆蛋白的提取

螺旋藻藻胆蛋白是水溶性蛋白,提取比较方便。

一般先采用反复冻融或超声波处理的方法破碎细胞（也有人加入溶菌酶处理）。

根据以往的经验,用反复冻融法破碎细胞效果更理想,操作也简便。

然后对细胞破碎液进行离心或过滤,即可获得藻胆蛋白的粗提液。

粗提液再经硫酸铵盐析,所得沉淀溶于低浓度磷酸盐缓冲液（0.001~0.2mol/L,pH6.8~7.0）中,并经透析、离心等得到上清液后,进行柱层析,即可获得藻胆蛋白的纯化液。

通常采用的层析法是羟基磷灰石（HA）柱层析,所用的洗脱液为梯度浓度的磷酸盐缓冲液。

在较低浓度下,藻蓝蛋白（Phycocyanins,PC）先被洗脱下来,随着洗脱液浓度的增加,别藻蓝蛋白（Allophycocyanins,APC）也被洗脱下来。

要想获得高纯度的藻胆蛋白液,往往需要经过多次柱层析,并且常需多种不同类型的层析方法结合使用。

除了羟基磷灰石柱层析外,常用的还有葡聚糖分子排阻层析（SephedexG-100或200）及DEAE-纤维素柱层析。

在提纯过程中,还可视具体情况加入活性碳吸附去杂、超滤浓集、等电点沉淀等措施。

一般采用最大理论可见吸收峰波长处的吸光值与280nm处的吸光值之比（Aλmax/A280）来表示其纯度的高低。

螺旋藻藻胆蛋白的试剂级纯度（reagentgradestandand）一般要求Aλmax/A280>4。

通常还结合电泳和光谱分析等方法来进行纯度检测。

整个提取过程宜在低温和弱光下进行[4,5,6,11~14,16]。

有研究表明，从处理时间上看,以超声波法需要的时间最短；从提取的藻胆蛋白含量上看,以反复冻融法提取时含量最高；从蛋白质纯度上看,无论是藻蓝蛋白还是别藻蓝蛋白,都是以反复冻融法提取时纯度最高。

反复冻融法的最大缺点是需要时间较长,而且需要冷冻设备,比较适合于在实验室进行小规模实验,但在生产上应用成本较高；超声波法虽然有处理时间短、藻胆蛋白提取量大等优点,但由于叶绿素等色素被大量提取出来,造成藻胆蛋白纯度低,给后续的纯化过程带来困难,在生产上用于破碎细胞,而不用于进一步纯化藻胆蛋白时较为适合；相对于其他2种方法,溶胀法不需要特殊的设备,提取藻胆蛋白的纯度和处理时间也界于上述2种方法之间,虽然提取的藻胆蛋白含量略低,但可通过扩大纯化规模进行弥补,因此是一种具有广阔应用前景的藻胆蛋白提取方法。

在实际应用上常常是冻融法和超声波法、溶胀法和冻融法等多种方法结合使用,这样的提取效果会更好。

1.1.5培养条件对螺旋藻藻胆蛋白的影响

藻胆蛋白是蓝藻（Cyanophyta）、红藻（Rhodophyta）和隐藻（Cryptophyta）等藻类特有的捕光色素蛋白，主要包括藻红蛋白（phycoerythrin,PE）、藻蓝蛋白（phycocyanin,PC）和别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）3种。

藻胆蛋白在不同藻类中种类、数量不同，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白在所有蓝藻和红藻中都存在，藻红蛋白只出现于红藻和部分蓝藻中。

在某些缺乏PE而有异形胞的蓝藻中还存在充当PE“天线”功能的藻红蓝蛋白（PEC）（路荣昭等1989）。

隐藻中只有PE和PC2类，但隐藻中很少同时并存PE和PC。

甲藻藻胆蛋白的报道较少，仅在蓝藻甲藻Gymnodiniumcyanium中有两种PC的存在（胡鸿钧等1980；张宪孔等1982）。

藻种的不同所含藻胆蛋白的种类和含量也不同。

藻胆蛋白的基因克隆及其监测研究比较透彻,但是藻胆蛋白的表达与产地、季节等外界因素的关系还未见报道。

不同的环境条件，例如氧气量，光照强度，光照时间，有机物质含量的不同都有可能会造成螺旋藻的生长状况不同，螺旋藻的藻胆蛋白的含量和其生物活性也可能会受到外界培养环境的影响。

研究表明氮源的种类不同和浓度不同对螺旋藻的生长和藻胆蛋白的含量有一定的影响。

一般认为螺旋藻是纯粹的光合自养生物,但它在需氧（黑暗条件）下也能利用有机碳源和氮源进行异养生长;在有光照的条件下,则可进行混合营养生长。

添加不同种类和浓度的有机底物对螺旋藻的混合营养生长过程具有不同的影响。

氮源主要用于构成螺旋藻体细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物,常用氮源有无机氮源和有机氮源两类。

有研究表明，氮源的种类和浓度都会影响螺旋藻的生长和藻胆蛋白的含量，例如用适宜质量浓度尿素（0.1g·L-1）代替硝酸钠作氮源培养可加快螺旋藻的生长,增加藻胆蛋白的含量。

但是,当尿素质量浓度超过0.2g·L-1时螺旋藻的生长受到明显抑制,生长缓慢,藻丝形态发生变异,颜色变黄,色素系统和机体细胞正常组成均遭受到不同程度的破坏;质量浓度过高（≥0.4g·L-1）时螺旋藻藻丝断裂直至死亡。

1.1.6藻胆蛋白的开发应用

藻胆蛋白是红藻和蓝藻特有的光合色素,在螺旋藻中,其含量可达干重的18%[3]。

国外研究表明,藻胆蛋白是一种很好的纯天然色素,大日本油墨公司从螺旋藻中提取藻蓝蛋白以“Lina-blue-A”为商品名,用作食物色素,也用于化妆品[15]。

藻胆蛋白的应用研究主要集中以下几个方面：

（1）取代人工合成的染料,用作食品和化妆品的添加剂,以避免人工合成物对人体的伤害。

（2）可以作为药物。

最近的一些研究表明,藻胆蛋白可以剌激人B-淋巴细胞的增殖反应,提高机体的免疫力。

另外还发现R-藻红蛋白可以和胰岛素抗体产生特异的免疫反应,这表明R-藻红蛋白的构象或结构的某些部位与胰岛素有一定程度的相似,因而它也许对糖尿病有一定的疗效。

而且藻胆蛋白对多种肿瘤细胞也具有抑制效果。

张成武等[21]报道,藻蓝蛋白浓度为80mg/L时对人血癌细胞株HL-60、K-562和U-937的生长均有显著抑制作用（抑制率在30%~50%左右）；王勇等[22]报道同样浓度的藻蓝蛋白对HeLa细胞的抑制率为31%。

（3）作为荧光探针。

藻胆蛋白在与其他蛋白如抗体等共价交联后荧光量子产额和发射光谱未发生变化,于是Glaz-er和Stryer认为藻胆蛋白可以作为荧光探针（Phycofluorprobes）。

藻胆蛋白荧光探针的出现为荧光检测技术注入了新的活力,它克服了人工合成荧光素价格高、合成中产生有毒物质以及长期保存后同蛋白质结合能力减弱甚至消失等缺点。

将藻胆蛋白作为标记物,与生物素、亲和素、DNA分子和各种单克隆抗体结合制成荧光探针,可以用于荧光显微检测、荧光免疫检测、双色或多色荧光分析[23],在临床诊断和生物工程研究中有广泛用途。

以往常用的放射性同位素标记法因半衰期短、需防护、废物处理困难等缺点正在被荧光标记法所取代。

美国的Sigma公司、MolecularProbe公司和德国的Boehringer公司都推出了有关产品。

从螺旋藻制备荧光标记用的试剂级藻蓝蛋白每毫克价值一百多美元,是一种具有高经济效益的高新技术产品。

在基因工程研究方面,Rossi等（1985）[24]用pMMB34（一种粘粒载体）建立了钝顶螺旋藻的DNA文库（包括PC的大小亚基基因）,以用于其DNA物理图谱的建立。

秦松等（1995）[25]完成了钝顶螺旋藻APC基因的全序列测定,且使其α、β亚基在E.coli中得到表达,并构建了与细菌活性蛋白融合的重组蛋白,获得了高效表达菌株。

经动物试验表明：

其抑瘤和促进免疫功能活性较天然PC显著。

他们从螺旋藻中首次分离到了质粒,并试图构建出穿梭质粒载体,用于有关的基因工程研究中。

另外,他们还试图利用CaMV35和SV40启动子,以氯霉素作选择压力,将螺旋藻APC基因转入海带中。

1.1.7藻胆蛋白的研究展望

藻胆蛋白是一种新型活性物质,但是繁杂的分离纯化工艺使它的应用受到了限制。

我国拥有丰富的海藻资源,这为藻胆蛋白的应用提供了条件,但是我国对藻胆蛋白分离纯化技术的研究起步较晚,且多数研究还处于实验室阶段,要实现藻胆蛋白相关产品的开发与推广还有赖于藻胆蛋白规模化纯化技术的进一步成熟与应用。

如何开发出低成本,高效益的提取