生物物理实验25.docx

生物物理实验25.docx

《生物物理实验25.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物物理实验25.docx（14页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物物理实验25

实验二紫外-可见吸收光谱法定量分析色氨酸和酪氨酸

一、实验目的

1．了解紫外-可见分光光度计的结构、性能及使用方法

2．熟悉定性、定量测定的方法

二、实验原理

吸收光谱测量的是样品对电磁波（光）的吸收的大小。

当入射光与样品分子相互作用并产生对入射光的吸收时，测量到的透射光的强度与入射光强度之差即为样品对入射光的吸收。

紫外-可见吸收光谱（Ultravioletvisiblespectrophotometry）是利用物质在紫外、可见光区的分子吸收光谱，对物质进行定性分析、定量分析及结构分析的方法。

按所吸收光的波长区域不同，分为紫外分光光度法（190~400nm）和可见分光光度法（400~750），合称为紫外-可见分光光度法。

色氨酸（C11H12N2O2）是人体所需的一种重要的氨基酸，对预防糙皮病、抑郁症，改善睡眠和调节情绪，有着很重要的作用。

其分子结构式如下：

CH2CH（NH2）COOH

N

H

大部分氨基酸在230~310nm范围内没有吸收，只有芳香族氨基酸色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和含硫的氨基酸在此范围内有吸收。

紫外-可见吸收光谱可对测量物质进行定性和定量分析。

定性分析时，可在相同的条件下，对标准样品和未知样品进行波长扫描，通过比较未知样品和标准样品的光谱图对未知样进行鉴定。

在没有标准样品的情况下，可根据标准谱图或有关的电子光谱数据表进行比较。

定量分析是在测量物质最大吸收波长（λmax）处测定不同浓度标准样品的吸光值，并绘制标准曲线。

再在相同的条件下测定未知样品的吸光度值，根据标准曲线可得出未知样中待测样品的含量。

三、仪器与试剂

U-2800型紫外-可见分光光度计（日立）、电子天平、250ml和1000ml容量瓶、50ml比色管（或离心管）、1000μl移液枪、1000μl移液枪吸头、烧杯、1ml吸量管；色氨酸（AR）、酪氨酸（AR）和重蒸水。

四、实验方法

1.标准样品的配制

（1）准确称取色氨酸100mg于烧杯中，蒸馏水溶解后定量转移到1000ml的容量瓶中，作为储备液。

（2）用吸量管分别加入0.5ml、2ml、5ml、10ml、20ml的1mg/ml色氨酸标准溶液，用蒸馏水定容至100ml的容量瓶中，摇匀。

分别放入5支10ml的比色管中。

2、标准样品最大吸收波长测定

（1）打开U-2800紫外分光光度计预热30min。

（2）波长扫描

（a）确定波长扫描参数：

　　狭缝宽度0.5nm

　　光度测量形式吸光值

　　扫描范围200～500nm

　　扫描速度400nm/min

（b）做基线

将盛有蒸馏水参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，点击“Baseline”开始进行基线扫描

（c）波长扫描

将盛有样品和参比液的比色皿分别放入样品光路和参比光路，点击“Scan”开始扫描，得到色氨酸最大吸收波长（λmax）。

（d）定性分析

将试样的波长扫描图与已知样的在相同条件下的波长扫描图或已知的谱图相比较，对试样进行定性分析

3.浓度-吸光值标准曲线

将样品扫描波长设定为色氨酸最大吸收波长（λmax），分别对标准样品进行吸光度值测定，绘制浓度-吸光值标准曲线。

4.色氨酸、酪氨酸的定量测量

将样品扫描波长设定为色氨酸最大吸收波长（λmax），对其待测样品进行吸光度值测定，根据已绘制的浓度-吸光值标准曲线，求出待测样品的含量。

四、实验结果及分析

1、色氨酸、酪氨酸的最大吸收波长（λmax）；

2、绘制浓度-吸光值标准曲线；

3、待测物质浓度。

五、讨论

实验三溶剂效应对色氨酸、酪氨酸紫外吸收峰的影响

一、实验目的

了解溶剂极性效应对色氨酸、酪氨酸紫外吸收峰的影响。

二、实验原理

吸收光谱是样品的吸收度随入射光波长（一般用nm表示）变化的曲线，电子光谱有两个主要的参数，即吸收峰峰位（λmax）和吸收峰的强度。

影响紫外-可见吸收谱的因素包括：

溶剂、生色团之间的相互作用、激子分裂、增色效应和减色效应等。

溶液中处于每个电子能级的分子都处于溶剂的包围之中，溶剂会与生色团相互作用并改变其能级，其作用机制多种多样，如静电相互作用和形成氢键等。

这样，电子吸收光谱对溶剂的性质非常敏感。

如果一种溶剂与基态和激发态的相互作用与另一种溶剂有差别，则两种溶剂中样品分子激发态与基态能量的能量差将有区别。

如果一种溶剂中该能量差比原来的溶剂中的能量差大，则其吸收峰将发生蓝移，反之将产生红移。

由于溶剂分子都处于运动中，溶剂分子与生色团的相互作用随时间而变化，如果溶剂中有多种分子，则一定的生色团会受到不同分子的作用，能级差的变化也会随不同分子形成的不同微环境而有所变化。

溶剂分子运动的时间量级大约是10-11s，比电子跃迁发生的时间（10-15s）长得多。

溶剂分子运动的结果，是使吸收峰有一定的展宽。

三、仪器与试剂

U-2800型紫外-可见分光光度计（日立）、电子天平、250ml和1000ml容量瓶、50ml比色管（或离心管）、1000μl移液枪、1000μl移液枪吸头、烧杯、1ml吸量管；色氨酸（AR）、酪氨酸（AR）和重蒸水、二甲亚砜。

四、实验方法

1.标准样品的配制

（1）准确称取色氨酸100mg于烧杯中，分别利用蒸馏水、20%二甲亚砜溶解后定量转移到100ml的容量瓶中，作为储备液。

（2）用吸量管分别加入0.5ml、2ml、5ml、10ml、20ml的1mg/ml色氨酸标准溶液，用相应溶液定容至100ml的容量瓶中，摇匀。

分别放入5支10ml的比色管中。

2、吸收光谱测定

（1）打开U-2800紫外分光光度计预热30min。

（2）波长扫描

（a）确定波长扫描参数：

　　狭缝宽度0.5nm

　　光度测量形式吸光值

　　扫描范围200～500nm

　　扫描速度400nm/min

（b）做基线

将盛有蒸馏水（或二甲亚砜）参比液的比色皿分别放入参比光路和样品光路，点击“Baseline”开始进行基线扫描

（c）波长扫描

将盛有样品和参比液的比色皿分别放入样品光路和参比光路，点击“Scan”开始扫描，得到吸收光谱图。

四、实验结果及分析

1、水溶剂时色氨酸、酪氨酸的紫外吸收光谱；

2、二甲亚砜为溶剂时色氨酸、酪氨酸的紫外吸收光谱；

3、比较溶剂极性对色氨酸、酪氨酸的紫外吸收光谱的影响。

4、色氨酸、酪氨酸的定量测量

五、讨论

实验四红细胞溶血速率的测量

一、实验目的

通过红细胞溶血速率的测量，要求掌握生物学研究中微机实时测量技术。

二、实验原理

红细胞的许多性质，如变形性、免疫特性、离子运输以及药物作用机制等都与红细胞膜密切相关。

目前，亦已知道红细胞膜异常关联到不少疾病。

因此，对红细胞膜的研究还具有医学临床诊断的应用价值。

近年来，已用多种物理化学方法测量红细胞膜结构参数。

其中，用“渗透休克”方法追踪红细胞溶血的早期动力学过程，测量的早期溶血速率直接与膜结构的“破裂”关联。

在测量膜修饰剂作用后红细胞溶血速率及相应的膜流动性参数后，有人认为，溶血速率与膜流动性存在着一定的相关性。

其他实验还说明，除膜流动性外，还有其他结构因子参与红细胞溶血的动力学过程。

时间（s）

本实验中的红细胞溶血速率定义为，低渗液作用下红细胞早期溶血量的变化率。

由于红细胞悬液的浊度与红细胞溶血量有关，红细胞溶血的早期动力学过程可以用红细胞悬液的浊度变化来追踪。

我们在660nm处（此处血红蛋白本身吸收甚小）测量吸光度（光密度），跟踪早期红细胞溶血过程，将光密度值通过标准曲线转换为细胞浓度，从而计算溶血速率。

在低渗条件下，红细胞膜破裂的时间进程和膜流动性、粘弹力、膜-Hb相互作用等密切相关，通过测定低渗溶血速率及渗透脆性参数等给出红细胞在这方面的信息。

在低渗溶血研究中，采用反映溶血快速及慢速过程的两个参数K1和K2作为指标。

通常

。

log（OD/OD0）

图4.1红细胞溶血速率曲线

常用膜修饰剂为聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-10），戊二醛。

TritonX-100是一种非离子性表面活性剂，可用以抽提膜蛋白，并保持活性。

高浓度下引起红细胞溶血，低浓度下可影响膜流动性。

戊二醛是一种常用的固定剂，可促使膜蛋白间交联，对膜脂组分影响不大。

本实验采用微机对红细胞悬液“渗透休克”过程浊度经时变化作实时处理，显示并打印变化曲线及溶血速率数值，见图5.1。

三、实验器材

1．仪器

721分光光度计；离心机。

2.材料

（1）红细胞

少浆全血来自健康成人。

柠檬酸钠抗凝，购自上海中心血站。

（2）等渗液

155mmol/LNaCl，5mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4。

（3）低渗液

31mmol/LNaCl／5mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.4。

（4）膜修饰剂

①戊二醛，浓度0.03%（V／V%）。

②TritonX-100，浓度0.04%（V／V%）。

四、实验方法

1．红细胞样品处理及膜修饰剂作用

（1）取lmL左右少浆全血用等渗液洗涤3次（1，000r/min离心10min），最后用等渗液将红细胞悬液稀至3mL。

（2）1mL红细胞悬液中，分别加入lmL等渗液、TritonX-100（0.04%）和戊二醛（0.03%）。

室温下作用15min。

然后稀释红细胞悬液至一定浓度。

这时取50μL红细胞悬液加入2mL等渗液后，测量悬液吸光度（光密度）0.4左右。

2．溶血速率测量

（1）样品皿内加入2mL低渗液于样品室。

测量空白对照后，用移液枪快速注入50μL红细胞悬液。

记录时间及此时吸光度。

（2）对无膜修饰剂作用的红细胞悬液及用戊二醛、TritonX-100作用后的红细胞悬液进行测量。

分别重复4~5次。

（3）根据实验数据绘制溶血速率曲线。

实验五Scatchard图分析血红蛋白和红细胞膜相互作用

一、实验目的

1、用离心和比色法测定结合于膜上及游离的血红蛋白（Hb）量。

2、从Scatchard图分析法估算两组分结合位点的结合常数和位点数。

二、实验原理

在研究小分子-大分子、配体-受体相互作用和激素、药物的作用机制等方面，Scatchard图分析法是一种常用的方法。

对于仅有一种结合位点的相互作用，Scatchard图分析法很简单，图解能求出结合常数K及及位点数n。

若存在两种以上组分，图解就变得复杂了。

分子B（这里的Hb）和A（这里的细胞膜）的结合遵循质量作用定律时

（5.1）

结合的平衡常数K为

（5.2）

令结合位点被占据的比例为v

（5.3）

由式（7.2）、（7.3）得

（5.4）

或整理成

（5.5）

当A上存在n个结合位点，每一结合位点的结合常数相同，且彼此无相互作用时，式（7.5）变为

（5.6）

此时

（5.7）

“v/[B]~v”关系为一直线，斜率为K，截距为nK，此时Scatchard图。

若存在不同K值的多种结合位电，则

（5.8）

此时的图解分析复杂。

对于存在着两种类型K值的结合，可按图7.1方法解析。

令K1、n1为第一种结合位点的结合常数、位点数；K2、n2为第二种结合位点的结合常数、位点数，解析的最终结果是：

v/[B]

θ1

θ4

图5.1两种结合位点的Scatchard图分析法

图中θ1、θ2、θ3、θ4为外推值

（5.9）

（5.10）

（5.11）

（5.12）

式中

（5.13）

（5.14）

（5.15）

（5.16）

三、实验器材

低温高速离心机；721型分光光度计；少浆全血（人）；PBS；5mmol/LNaPO4，pH6。

四、实验方法

1．制备红细胞膜及血红蛋白（Hb），Hb浓度约1~2mmol/L。

（1）血红蛋白

5mL血液加2～3倍PBS悬浮，离心（1，500r／min，4℃，5min）后去除上清液及浮在血球层表面的富集白细胞、血小板的黄白色薄层，重复洗涤2次。

得到的红细胞压积加上l~1.5倍体积的重蒸水，搅拌数分钟后转移至离心管，18，000r／min，4℃离心30min。

仔细用滴管吸取上清液，此即Hb溶液。

在分光光度计上测定542nm波长处的光密度，根据摩尔消光系数ε542＝14.6（mmol/L）-1·cm-1。

（按每个血红素计）换算Hb溶液浓度，冰箱保存待用（2~3天内）。

（2）血影细胞膜

红细胞压积加二十倍5mmol/lNaPO4，pH7.4，4℃，30min，使溶血完全，然后18，000r／min，4℃离心30min。

去除血红蛋白上清液及离心管底部金黄色的斑点（富含蛋白酶），沉淀部分再作同样低渗离心洗涤，约3~5次，直至沉淀的血影膜呈乳白色，用Lowry法比色测定血影膜中蛋白质的浓度。

2．将红细胞膜浓度用5mmol/LNaPO4，pH6稀释至5×107个/mL，在各试管中加入不同量Hb，使Hb终浓度为0.015~1.0μmoI/L。

混合液在室温下平衡30min后，18，000r/min离心45min（室温）。

3．仔细地用滴管吸取各管中的上清液，在415nm波长处测定Hb浓度。

该波长处Hb摩尔消光系数高，ε415＝500（mmol/L）-1cm-1（Hb的四聚体）。

原加入的Hb量与上清液中游离Hb量之差，就是被红细脑膜结合了的Hb量，每个红细胞平均结合Hb的分子数（v）可由此获得。

4．测定0.015~0.1μmoI/LHb浓度时，为提高测量精度，采用3cm光程的比色皿。

5．以v为横轴，v/[B]为纵轴作Scatchard图。

6．根据式（7.9）~（7.l2）算出高亲和位点和低亲和位点的结合常数及位点数K1、n1、K2、n2。