肝糖原测定.docx
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肝糖原测定
南方医科大学
生物化学实验报告
姓名:
学号:
专业年级:
组别:
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称
肝糖原的提取、鉴定与定量
实验日期
实验地点
合作者
指导老师
评分
教师签名
批改日期
一、实验目的
1.掌握组织样品的制备方法,了解其注意事项。
2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项,掌握其操作方法。
3.掌握吸量管和微量移液器的使用方法。
4.掌握各种溶液混匀及转移的方法。
5.正确掌握使用离心机和分光光度计的方法步骤。
二、实验原理
1.肝糖原的提取
糖原储存于细胞内,采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎,低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性,破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质,而糖原仍稳定地保存于上清液中,从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。
糖原不溶于乙醇而溶于热水,故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀,再溶于热水中。
2.糖原的鉴定
糖原水溶液呈乳样光泽,遇碘呈红棕色。
这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中,依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。
糖原还可被酸水解为葡萄糖,利用呈色反应和葡萄糖的还原性,可判定肝组织中糖原的的存在。
CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu(OH)2↓
2Cu(OH)2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O
2CuOH=Cu2O↓(红色)+H2O
Cu(OH)2⍙CuO↓(黑色)+H2O
3.肝糖原的定量
糖原在浓酸中可水解为葡萄糖,浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛,此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。
该物质在620nm处有最大吸收。
糖含量在10—100mg范围内,溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色,通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。
糖原在浓碱溶液中非常稳定,故在显色之前,肝组织先置于浓碱中加热,以破坏其他成分,而保留肝糖原。
三、实验材料
1.样品
鸡肝
2.试剂
95%乙醇、0.31mol/L(5%)三氯醋酸溶液、0.15mol/LNaCl溶液、浓HCl、
12.5mol/L(50%)NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液(50mg/L)
蒽酮显色剂
3.仪器和器材
1、普通离心机,室温至100℃恒温水浴箱,722型分光光度计,天平
2、剪刀、镊子、研钵
3、试管架,离心管,试管
4、刻度吸量管(2ml,5ml),1000μl微量可调取液器
5、100ml容量瓶
6、白瓷反应板
四、实验方法
(一)实验流程
1.肝糖原提取、鉴定实验流程:
鸡肝约1.50g,剪碎
+5%CCl3COOH1ml
研磨至乳状
+5%CCl3COOH3ml
研磨成肝匀浆
全部转入离心管中,离心3分钟(4000r/min)
沉淀(弃去)上清液(取2ml)
+2ml95%乙醇,混匀,静置10分钟
离心5分钟(4000r/min)
上清(弃去)沉淀
+蒸馏水1ml
沸水浴2分钟,溶解沉淀
白瓷板孔穴中糖原溶液1ml
+浓HCl250μl
加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟,冷却
糖原溶液2滴+50%NaOH250μl
呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液
+班氏试剂4滴
混匀
沸水浴2分钟,观察变化
2.肝糖原定量实验流程:
鸡肝0.15g
+30%KOH1.5ml(用吸量管)
沸水浴15分钟
冷却,全部转入100ml容量瓶中
加水至标线,仔细混匀,此为糖原提取液
糖原的测定
(二)操作步骤
1.肝糖原提取、鉴定(见表1)
步骤
操作
(1)肝匀浆准备
称取肝组织约1g,放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中,将肝组织磨至乳状后,再加入5%三氯醋酸3ml,在磨成肝匀浆,4000r/min离心3min,上清液倾入另一干净离心管中。
(2)提取糖原
向上清液中加入等量的95%乙醇,混匀,静置10min,离心5min(4000r/min)。
倾去上清液,白色沉淀为糖原。
加入蒸馏水1ml,并加热使沉淀溶解,溶液呈乳样光泽。
(3)糖原鉴定
1与碘反应:
取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中,加糖原溶液1滴,观察其呈色。
另一孔穴只加碘试剂2滴,作呈色对比。
2糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定:
取糖原溶液1ml于小试管汇总,加浓盐酸5滴,置沸水浴中水解15min,取出冷却。
用50%NaOH中和(约5滴)。
另取一小试管加班氏试剂4滴,加上述糖原水解液2滴混匀,在沸水浴中(或直接在酒精灯上)加热2min,观察并记录所见
表1肝糖原的提取与鉴定实验步骤
2.肝糖原定量测定(见表2)
步骤
操作
(1)糖原提取
在试管中加入30%KOH1.5ml,在称取0.15g肝组织放入试管中,置沸水浴中15min。
取出后冷却,将管内容物全部移入100ml容量瓶,定容,摇匀。
(2)糖原的测定
取3支试管,按下表操作:
试剂(ml)
空白管
标准管
样品管
蒸馏水
1.0
-
-
标准葡萄糖溶液
-
1.0
-
糖原提取液
-
-
1.0
0.2%蒽酮溶液
2.5
2.5
2.5
混匀,沸水浴10min,冷却。
洗净比色杯并用滤纸擦干,在3个比色皿中分别加入空白管溶液、标准管溶液、样品管溶液。
在分光光度计620nm波长处,先用空白管溶液调零,再依次测定标准管溶液与样品管溶液的分光度(A),测3次取平均值
表2肝糖原定量测定实验步骤
(三)注意事项
1.肝糖原提取、鉴定
(1)肝糖原提取一步,向上清液中加人等量的95%乙醇后,务必注意混匀。
由于最终混合液比较多,混匀操作比较困难,最好用倾倒混匀,或用玻璃棒搅拌混匀。
(2)糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。
肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下,吸附碘后呈现红棕色。
(3)糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步,加班氏试剂不能过量,否则反应液呈黑色浑浊,观察不到应有的结果。
(4)离心时,一定要注意对称,质量配平,若听到离心机声音过大,应立即停止离心。
(5)吸取1ml量溶液时使用可调微量移液器,吸取1ml以上量溶液时使用刻度吸量管。
2.肝糖原定量测定
(1)肝组织必须定量,精确,因为要涉及到后期的计算。
(2)肝组织必须在沸水浴中全部溶解,否则影响比色。
(3)注意定量转移,取量务必准确。
(4)蒽酮试剂必须2倍于被测液。
且蒽酮含有浓硫酸,转移需用刻度吸量管。
(5)若肝糖原含量小于1%,须改用间接测量法,即肝组织消化后,用95%乙醇沉淀糖原,用蒸馏水2ml溶解糖原,再用蒽酮试剂显色、比色。
五、实验现象与结果分析
(一)实验现象
1.肝糖原提取、鉴定
●鸡肝上清液经乙醇处理并混匀、静置后可看到明显白色沉淀物(表明上清液中肝糖原含量高)。
见下图:
图1鸡肝上清液经乙醇处理后混匀静置
●糖原溶液滴加碘液后,对比碘液和蒸馏水,有明显变化,有砖红色物质生成,说明有糖原生成。
见下图:
●
图2呈色对比
●糖原水解液加班氏试剂沸水浴后有棕红色沉淀析出。
见下图:
图3糖原水解液加班氏试剂沸水浴后
2.肝糖原定量测定
●肝组织和KOH溶液沸水浴后,溶液呈浅红色,无沉淀,证明肝组织全部溶解。
见下图:
图4鸡肝与KOH溶液沸水浴后
●将鸡肝溶解液全部移入容量瓶,加蒸馏水至刻度线混匀后,溶液呈浅米黄色。
●水浴后空白管(左)呈浅黄色,标准管(中)呈孔雀绿色,样品管(右)呈浅灰绿色(颜色介于空白管和标准管之间)。
见下图:
图5加蒽酮试剂水浴后颜色
●配置空白管、标准管、样品管时,溶液均有放热现象,表明蒽酮遇水、标准葡萄糖溶液和糖原提取液时均能产热。
(二)实验结果与分析
1.实验中所取肝组织为0.15g。
2.3支试管在620nm波长处的吸光度(取平均值)
测定次数
各管吸光值A620
空白管
标准管
样品管
1
0
0.594
0.363
2
0
0.594
0.362
3
0
0.594
0.363
各管平均值—A620
0
0.594
0.363
表3620nm波长吸光值记录表
3.结果分析:
按下式结算肝组织中的肝糖原的含量:
肝糖原(g/100g肝组织)=
×0.05×
×
×1.11≈2.261g
由公式计算得本组肝糖原含量为2.261g/100g肝组织。
结果:
该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原2.261g
讨论:
正常情况下,饱食鸡肝肝糖原含量为2-3g/100g肝组织,本组实验中肝糖原含量为2.261g/100g肝组织,所以实验所取鸡肝处于饱食状态,实验结果在正常范围内,证明实验成功。