肝糖原测定.docx

肝糖原测定.docx

《肝糖原测定.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肝糖原测定.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

肝糖原测定

南方医科大学

生物化学实验报告

姓名：

学号：

专业年级：

组别：

生物化学与分子生物学实验教学中心

实验名称

肝糖原的提取、鉴定与定量

实验日期

实验地点

合作者

指导老师

评分

教师签名

批改日期

一、实验目的

1.掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。

2.了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。

3.掌握吸量管和微量移液器的使用方法。

4.掌握各种溶液混匀及转移的方法。

5.正确掌握使用离心机和分光光度计的方法步骤。

二、实验原理

1.肝糖原的提取

糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分分离开来。

糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。

2.糖原的鉴定

糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。

这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。

糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的的存在。

CuSO4+2NaOH=Na2SO4+Cu（OH）2↓

2Cu（OH）2+C6H12O6=2CuOH+氧化型葡萄糖+H2O

2CuOH=Cu2O↓（红色）+H2O

Cu（OH）2⍙CuO↓（黑色）+H2O

3.肝糖原的定量

糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。

该物质在620nm处有最大吸收。

糖含量在10—100mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。

利用此反应与同样处理的已知葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。

糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保留肝糖原。

三、实验材料

1.样品

鸡肝

2.试剂

95%乙醇、0.31mol/L（5%）三氯醋酸溶液、0.15mol/LNaCl溶液、浓HCl、

12.5mol/L（50%）NaOH、碘试剂、班氏试剂、30%KOH溶液、标准葡萄糖液（50mg/L）

蒽酮显色剂

3.仪器和器材

1、普通离心机，室温至100℃恒温水浴箱，722型分光光度计，天平

2、剪刀、镊子、研钵

3、试管架，离心管，试管

4、刻度吸量管（2ml,5ml），1000μl微量可调取液器

5、100ml容量瓶

6、白瓷反应板

四、实验方法

（一）实验流程

1.肝糖原提取、鉴定实验流程：

鸡肝约1.50g，剪碎

＋5%CCl3COOH1ml

研磨至乳状

＋5%CCl3COOH3ml

研磨成肝匀浆

全部转入离心管中，离心3分钟（4000r/min）

沉淀（弃去）上清液（取2ml）

＋2ml95%乙醇，混匀，静置10分钟

离心5分钟（4000r/min）

上清（弃去）沉淀

＋蒸馏水1ml

沸水浴2分钟，溶解沉淀

白瓷板孔穴中糖原溶液1ml

＋浓HCl250μl

加碘试剂2滴加碘试剂2滴沸水浴15分钟，冷却

糖原溶液2滴＋50%NaOH250μl

呈色对比糖原水解液2滴糖原水解液

＋班氏试剂4滴

混匀

沸水浴2分钟，观察变化

2.肝糖原定量实验流程：

鸡肝0.15g

＋30%KOH1.5ml（用吸量管）

沸水浴15分钟

冷却，全部转入100ml容量瓶中

加水至标线，仔细混匀，此为糖原提取液

糖原的测定

（二）操作步骤

1.肝糖原提取、鉴定（见表1）

步骤

操作

（1）肝匀浆准备

称取肝组织约1g，放入盛有1ml5%三氯醋酸的研钵中，将肝组织磨至乳状后，再加入5%三氯醋酸3ml，在磨成肝匀浆，4000r/min离心3min，上清液倾入另一干净离心管中。

（2）提取糖原

向上清液中加入等量的95%乙醇，混匀，静置10min，离心5min（4000r/min）。

倾去上清液，白色沉淀为糖原。

加入蒸馏水1ml，并加热使沉淀溶解，溶液呈乳样光泽。

（3）糖原鉴定

1与碘反应：

取碘试剂2滴于白瓷板孔穴中，加糖原溶液1滴，观察其呈色。

另一孔穴只加碘试剂2滴，作呈色对比。

2糖原水解液汇总葡萄糖的鉴定：

取糖原溶液1ml于小试管汇总，加浓盐酸5滴，置沸水浴中水解15min，取出冷却。

用50%NaOH中和（约5滴）。

另取一小试管加班氏试剂4滴，加上述糖原水解液2滴混匀，在沸水浴中（或直接在酒精灯上）加热2min，观察并记录所见

表1肝糖原的提取与鉴定实验步骤

2.肝糖原定量测定（见表2）

步骤

操作

（1）糖原提取

在试管中加入30%KOH1.5ml，在称取0.15g肝组织放入试管中，置沸水浴中15min。

取出后冷却，将管内容物全部移入100ml容量瓶，定容，摇匀。

（2）糖原的测定

取3支试管，按下表操作：

试剂（ml）

空白管

标准管

样品管

蒸馏水

1.0

-

-

标准葡萄糖溶液

-

1.0

-

糖原提取液

-

-

1.0

0.2%蒽酮溶液

2.5

2.5

2.5

混匀，沸水浴10min，冷却。

洗净比色杯并用滤纸擦干，在3个比色皿中分别加入空白管溶液、标准管溶液、样品管溶液。

在分光光度计620nm波长处，先用空白管溶液调零，再依次测定标准管溶液与样品管溶液的分光度（A），测3次取平均值

表2肝糖原定量测定实验步骤

（三）注意事项

1.肝糖原提取、鉴定

（1）肝糖原提取一步，向上清液中加人等量的95％乙醇后，务必注意混匀。

由于最终混合液比较多，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。

（2）糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。

肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下，吸附碘后呈现红棕色。

（3）糖原水解液中葡萄糖的鉴定一步，加班氏试剂不能过量，否则反应液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。

（4）离心时，一定要注意对称，质量配平，若听到离心机声音过大，应立即停止离心。

（5）吸取1ml量溶液时使用可调微量移液器，吸取1ml以上量溶液时使用刻度吸量管。

2.肝糖原定量测定

（1）肝组织必须定量，精确，因为要涉及到后期的计算。

（2）肝组织必须在沸水浴中全部溶解，否则影响比色。

（3）注意定量转移，取量务必准确。

（4）蒽酮试剂必须2倍于被测液。

且蒽酮含有浓硫酸，转移需用刻度吸量管。

（5）若肝糖原含量小于1%，须改用间接测量法，即肝组织消化后，用95%乙醇沉淀糖原，用蒸馏水2ml溶解糖原，再用蒽酮试剂显色、比色。

五、实验现象与结果分析

（一）实验现象

1.肝糖原提取、鉴定

●鸡肝上清液经乙醇处理并混匀、静置后可看到明显白色沉淀物（表明上清液中肝糖原含量高）。

见下图：

图1鸡肝上清液经乙醇处理后混匀静置

●糖原溶液滴加碘液后，对比碘液和蒸馏水，有明显变化，有砖红色物质生成，说明有糖原生成。

见下图：

●

图2呈色对比

●糖原水解液加班氏试剂沸水浴后有棕红色沉淀析出。

见下图：

图3糖原水解液加班氏试剂沸水浴后

2.肝糖原定量测定

●肝组织和KOH溶液沸水浴后，溶液呈浅红色，无沉淀，证明肝组织全部溶解。

见下图：

图4鸡肝与KOH溶液沸水浴后

●将鸡肝溶解液全部移入容量瓶，加蒸馏水至刻度线混匀后，溶液呈浅米黄色。

●水浴后空白管（左）呈浅黄色，标准管（中）呈孔雀绿色，样品管（右）呈浅灰绿色（颜色介于空白管和标准管之间）。

见下图：

图5加蒽酮试剂水浴后颜色

●配置空白管、标准管、样品管时，溶液均有放热现象，表明蒽酮遇水、标准葡萄糖溶液和糖原提取液时均能产热。

（二）实验结果与分析

1.实验中所取肝组织为0.15g。

2.3支试管在620nm波长处的吸光度（取平均值）

测定次数

各管吸光值A620

空白管

标准管

样品管

1

0

0.594

0.363

2

0

0.594

0.362

3

0

0.594

0.363

各管平均值—A620

0

0.594

0.363

表3620nm波长吸光值记录表

3.结果分析：

按下式结算肝组织中的肝糖原的含量：

肝糖原（g/100g肝组织）=

×0.05×

×

×1.11≈2.261g

由公式计算得本组肝糖原含量为2.261g/100g肝组织。

结果：

该样品中肝糖原含量为每100g肝组织含肝糖原2.261g

讨论：

正常情况下，饱食鸡肝肝糖原含量为2-3g/100g肝组织，本组实验中肝糖原含量为2.261g/100g肝组织，所以实验所取鸡肝处于饱食状态，实验结果在正常范围内，证明实验成功。