干扰素γ对乳腺癌细胞Herneu表达及IHerceptin抑制肿瘤细胞增殖影响.docx

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干扰素γ对乳腺癌细胞Herneu表达及IHerceptin抑制肿瘤细胞增殖影响

干扰素-γ对乳腺癌细胞Her2／neu表达及^131I—Herceptin抑制肿瘤细胞增殖的影响

《癌症》ChineseJournalofCancer,2006,25（4）:

443—446443

干扰素一y对乳腺癌细胞Her2/neu表达及

1311.Herceptin抑制肿瘤细胞增殖的影响

?

基础研究?

范义湘,罗荣城,方永鑫,严晓,吕成伟

EffectsofInterferon—yonHer一2/neuExpressionandAntitumorActivity

Of'I—HerceptininBreastCancerCellLines

FANYi—Xiang,LUORong—Cheng,FANGYong—Xin,YANXiao,LUCheng—Wei

南方医科大学南方医院

肿瘤中心,

广东广州510515

DepartmentofOncology,

NanfangHospital,

SouthMedw~Universay,

Guangzhou,Guangdong,510515,

PR.China

通讯作者:

罗荣城

Correspondenceto:

LU0Rong-Cheng

Tel:

86-20—61641651

E—mail:

lrc@

收稿日期:

2005.07.05

修回日期:

2005-08—29

[ABSTRACT]BACKGROUND&OBJECTIVE:

Herceptinplaysanimportant

roleintreatingmetastaticbreastcancerbytargetingHer2/neu,therefore,

combiningHerceptinwithiodine一13113,I）mightenhanceitsantitumoractivity.

Thisstudywastoup—regulateHer2/neuexpressionbyinterferon—y（IFN—y）,

andexploreitseffectonbindingandantitumoractivityof'I-Herceptinin

breastcancercelllinesMCF-7,SKBR一3andBT一474.METHODS:

MCF-7.

SKBR一3andBT-474cellswereculturedwithorwithoutIFN—y（500U/mI）for

48h.Thepositiverateandmeanfluorescenceintensity（MFI）OfHer2/neuon

the3celllinesweretestedbyflowcytometry.HerceptinwasIabeledwith1311

byIodogenmethod,anditsradiochemicalpurity（RCP）wastestedbysize—

exclusionhigh—pressureliquidchromatography（HPLC）.Thebindingrateof

竹11_Herceptinoncellswasmeasuredbynon—competitivesaturationanalysis.

anditskillingeffectwasestimatedbycolony—formingassay.Thepositiverate

andMFIofHer2/neu,bindingrateof埘1.Herceptin,andcolony—formingrate

werecomparedbetweenIFN—y—inducedgroupandcontrolgroupbyftest.

RESUL-TS:

FOrMCF.7cells,thepositiverateandMFIofHer2/neuwere

significantlyhigherinIFN—y—inducedcellsthanincontrolcells[（15.2~4.7）%

vs.（8.5士1.9）%,t=3.515,P<0.05;121士17vs.38~7,t=7.823,P<0.002];

f0rSKBR一3andBT-474cells.noobviousdifferenceofHer2/neupositiverate

wasobse~edbetweenIFN—y—inducedcellsandcontroIcells『（99.7±0.9）%

vs.（98.9士1.1）%,P>0.05;（99.5士1.2）%vs.（98.1士0.9）%,P>0.05],butthe

MFIofHer2/neuwassignificantlyhigherinIFN—y—inducedcellsthanincontrol

cells（1608~201vs.952~125,t--4.802,P<0.01:

1968~192vs.1020~98.

t=7.614.P<0.002）.ThebindingratesofHer2/neuwereincreasedfrOm

（5.2士1.4）%to（12.3~3.4）%by2.4foIdsinMCF-7cells,from（35.8~4.5）%

to（48.9士7.1）%by1.4foldsinSKBR一3cells,andfrom（37.2~3.6）%to

（59.5~8-7）%by1.6foldsinBT-474cellsafterinducementwithIFN—Y.The

colony—formingratesweresignificantlylowerinIFN—y—inducedMCF一7,SKBR一

3andBT-474cellsthanincontroIcells[（30士4）%vs.（49士3）%,t=6.574,

P<0.05;（23~5）%vs.（37~6）%t=3.105,P<0.05;（19~6）%vs.（34~5）%.

f=3.323,P<0.05].CONCLUSION:

IFN—ycanup—regulateHer一2/neu

expressionandincreasethebindingof'I-Herceptin,hence,improvethe

inhibitoryeffectof'I-Herceptinonproliferationofbreastcancercells.

KE,nⅣORDS:

BreasttumorcellIine;Her2/neu;Interferon.y;Induced

expression;lodineisotopes;Radioimmunotherapy

【摘要】背景与目的:

利用Herceptin对Her2/neu的靶向特性.将放射性核素

"'I联结到Herceptin进行放免靶向治疗,是治疗转移性乳腺癌的方法之一.而肿瘤

摄取标记抗体的量与肿瘤细胞靶位分子的表达量密切相关.本研究应用IF/Y.上

444范义湘,等.干扰素一对乳腺癌细胞Her2/neu表达及I-Herceptin抑制肿瘤细胞堕墅堕

调乳腺癌细胞系Her2/neu的表达,以提高I-Herceptin在

乳腺癌细胞系的结合,及31I—Herceptin对乳腺癌细胞增殖的

抑制作用.方法:

取对数生长期乳腺癌细胞系MCF一7,SKBR一

3和BT一474.实验组以终浓度为500U/ml的IFN一诱导培

养48h.对照组加入不含IFN一的等量培养液.诱导前后采

用流式细胞仪（FACS）检测3种细胞Her2/neu的表达率及

平均荧光强度（MFI）.采用Iodogen法对Herceptin进行"I

标记.以高压液相层析法（HPLC）测定"I-Herceptin的放射

化学纯度（RCP）,以非竞争性饱和结合法测定3种细胞诱导

前后1311一Herceptin的结合率（B/T）.采用克隆形成实验评价

诱导后1311一Herceptin对3种细胞杀伤效应的变化.实验组与

对照组间Her2/neu表达率,MFI,B/T及克隆形成率的差异

采用t检验.结果:

MCF一7细胞Her2/neu基础表达率为

（8.5~1.9）%,诱导后升高至（15.2~2.7）%（￡:

3.515,P<0.05）,

MFI从38~7升高至121~17（t=7.823,P<0.01）;SKBR一3细胞

和BT一474细胞的基础表达率分别为（98.9~1.1）%和（98.1±

0.9）%,诱导后分别为（99.7~0.9）%和（99.5~1.2）%,无明显

改变（P>0.05）,但MF1分别从952±125,1020~98增高

至1608~201（￡=4I802,P<0.叭）和1968~192（t=7.614,P<

0.002）.nI—Herceptin在MCF一7,SKBR一3和BT一474的基础结

合率分别为（5.2~1I4）%,（35.8~4.5）%和（37.2~3.6）%,诱导

后分别升高为（12.3~3-4）%,（48.9~7.1）%和（59.5±8.7）%,

对1311一Herceptin的结合倍增比分别为2.4,1.4和1.6倍.实

验组3种细胞的克隆形成率分别为（30±4）%,（23~5）%及

（19~6%）,均显着低于对照组[分别为（49~3）%,（37±6）%,

（34~5）%]（￡=6.574,3.105,3.323,P<0.05）.结论:

IFN一可以

上调乳腺癌细胞系Her-2/neu的表达和肿瘤细胞对"'I—

Herceptin的结合量.因此也提高了"I-Herceptin对乳腺癌细

胞的增殖抑制作用.

关键词:

乳腺肿瘤细胞系;Her2/neu;干扰素;表达诱导;

"I;放射免疫效应

中图分类号:

R737.9:

R817.4文献标识码:

A

文章编号:

1000—467X（2006）04—0443—04

约20%30%的晚期乳腺癌患者伴有Her.2的

过度表达,该类患者疾病发展快,预后差,对化疗及

三苯氧胺抗拒,缺乏有效治疗手段[.以Her.2为

靶点的分子靶向药物Herceptin,虽可通过多种途

径抑制Her.2过度表达的乳腺癌细胞生长f21.但已

有研究显示[,Herceptin单药治疗晚期乳腺癌,其

总有效率仅为12%一24%.因此,应用放射性核素标

记Herceptin,对肿瘤进行放射免疫治疗

（Radioimmunotherapy,RIT）,是解决上述问题的方法

之一.本研究应用干扰素~（interferon.^y,IFN一^y）诱

导乳腺癌细胞系Her2/neu的表达,以提高放免靶

向药物在肿瘤细胞的结合量及其杀伤效应,现将结

果报道如下.

1材料与方法

1.1试剂与仪器

RPMI.1640培养液购自美国Gibco公司,胎牛

血清（FCS）购自美国Hyclone公司,小牛血清购自

兰州民海生物公司,0.25%的胰蛋白酶和台盼蓝购

自上海化学试剂公司,Anti.Her2/neuAPC鼠抗人

单克隆抗体由BECTONDICKINSON公司购进,

IFN.^y由本院生物治疗中心提供,Herceptin由上海

罗氏公司购进.Na",I由中国核动力院第一研究所

购进.人乳腺癌细胞系MCF.7和SKBR.3由上海细

胞所购进.BT.474由北京协和医科大学基础医学

研究所细胞室购进.流式细胞仪（FACS）采用

BectonDickinsonFACSCalibur,^y计数器为上海核

福光电有限公司产的SN.682型.

1.2方法

1.2.1IFN.^y诱导实验MCF.7,SKBR.3细胞培养

于含10%dx牛血清的RPMI.1640液中.BT.474细

胞培养于含l0%FCS的RPMI.1640液中[.取对数

生长期细胞,用l2孔培养板培养,每孔细胞数量调

整为5×10s/ml,于37℃,5%C02培养箱中培养24h

后,镜下观察细胞呈贴壁生长.IFN.^y以RPMI.

1640液稀释.每种细胞设实验组和对照组,每组设

3个复孔.参照文献[5],在实验组细胞培养液中加

人IFN.^y并调整其终浓度为500U/ml,对照组加

人等量不含IFN.^y的RPMI.1640培养液,各组细胞

均培养48h[.实验组和对照组细胞达到预定培

养时间后,MCF.7,SKBR.3细胞以0.25%胰蛋白酶

液消化收集,BT.474细胞以0.125%胰蛋白酶+

0.02%EDTA消化.上述细胞以RPMI.1640培养液

调整为悬液留待实验.实验前作台盼蓝染色以观察

细胞活性.

1.2.2Her2表达的FCM测定将上述实验组及

对照组细胞移人Ependorf管,以0.0lmol/L,pH7.4

的PBS洗涤2次,调整细胞密度为每管300l（约

2xl05个细胞）,各管加入Anti.Her2/neuAPC5l,

吹打混匀,避光于室温反应30min后,1000xg离

心3min,弃上清.并以0.0lmol/L,pH7.4的PBS

洗涤2次以去除游离Anti.Her2/neuAPC.以FACS

检测各组细胞Her2/neu表达率及Her2/neu表达的

平均荧光强度meanfluorescenceintensitv.MFI）.

1.2.3Herceptin的"'I标记及质控采用Iodogen

标记法.Herceptin溶于生理盐水中.浓度22ms/

rIIl.取NaI111MBq（3mCi）加入Iodogen管.冰浴

范义湘,等.干扰素.对乳腺癌细胞Her2/neu表达及I-Herceptin抑制肿瘤细胞增殖的影响445

振摇反应2min后,加入Herceptin3.0mg,冰浴振

摇反应2min.SephadexG25凝胶柱分离,纯化,测

定比活度并以HPLC测定标记物的放射化学纯度

（RCP）.

1.2.41311.Herceptin细胞结合率测定采用非竞争

性饱和结合法.将上述收集的各组细胞密度调整为

每管2×105/100l,根据比活度及放射化学纯度各

管加入n-I—Herceptin25trl.取过量标记抗体（0.5

m1）加入上述各细胞悬液中,充分混匀,于37℃振

摇反应2h.反应终止,各组取20l做集落形成实

验.其余细胞1000xg离心3min,去上清液后洗

涤细胞2次,沉淀部分于^y计数器测放射性计数

（cpm）.特异结合管先加入过量非标记单抗

Herceptin于4℃反应2h.再加入I.Herceptin25

l于37℃反应2h.各管重复实验3次.-I—

Herceptin细胞结合率=『（反应管cpm一非特异管

cpm）/25l"I-Herceptin总cpm]x100%.摄取倍

增比=（实验管cpm一非特异管cpm）/（对照管cpm一

非特异管cpm）.

1.2.5克隆形成实验分别取上述各组预留的20

l细胞,根据细胞计数用含10%胎牛血清的

RPMI.1640培养基调整细胞浓度后接种至24孔板

中,每孔100个细胞（1m1）.于37℃,5%CO培养箱

中培养2周.于倒置显微镜计数.将含有15个细胞

以上的集落判定为一个克隆,各孔集落数除以接种

细胞数即为克隆形成率.每组设3个复孔.

1.3统计学处理

实验组与对照组之间3种细胞Her2/neu的表

达率,MFI,T/B以及克隆形成率采用s表示.

差别显着性采用SPSS10.0统计学软件进行t检

验.

2结果

2.1细胞及标记物鉴定

实验前各组细胞经台盼蓝染色表明.MCF一7,

SKBR一3及BT一474细胞的活性分别为94.0%,95.5%

和93.0%."I-Herceptin的放射化学纯度为95%.比

活度为31.45kBq/~g.25l"I—Herceptin总计数

为18502cpm.

2.2IFN?

y诱导对乳腺癌细胞系Her一2/neu表达

的影响

MCF一7,SKBR一3和BT一474经IFN一^y诱导前后

Her2/neu表达率及MFI升高.其中MCF.7细胞

Her2/neu表达率升高显着（t=3.515.P<O.05）.

SKBR一3和BT一474细胞Her2/neu表达率升高不明

显（尸>0.05）.3种细胞MFI均显着升高（表1）.

表1IFN.^r诱导对乳腺癌细胞系Her2/neu表达的影响

Table1Inducementeffectofinterferon-^r（IFN-^r）on

Her2/neuexpressiononbreastcancercells

Cellline

ControlcellsIFN—ly-inducedcells

Positiverate（%）MFIPositiverate（%）MFI

MFI:

meanfluorescenceintensity.Allvalues8iepresentedasmean4.

SDof3experiments.=3.515,P<0.05,bt=4.802,P<0.0l,=7.614,

P<0.002,VS.controlcells.

2.3IFN—y诱导对乳腺癌细胞系结合埘1.Herceptin

的影响

"I-Herceptin在MCF.7,SKBR一3及BT一474细

胞的非特异性结合率分别为（3.8±0.5）%,（4.2±

0.6）%和（5.2+1.2）%.诱导后对"I—Herceptin的结

合均增高（表2）.

表2IFN-^r诱导对乳腺癌细胞系结合mI-Herceptin的影响

Table2EffectofIFN-^ronbindingrateof"iI-Herceptin

inbreastcancerceIls

CelllineControlcells（%）IFN—ly—inducedcells（%）Multipleratio

2.4克隆形成实验

对照组MCF一7,SKBR一3及BT一474细胞的克隆

形成率分别为（49~3）%,（37±6）%及（34_+5）%,实

验组相应细胞的克隆形成率分别为（30±4）%,（23+

5）%及（19±6）%,均显着低于对照组（t=6.574,

3.105,3.323.P<0.05）.

3讨论

放射免疫治疗是借助单克隆抗体将放射性核

素特异性靶向到肿瘤表达抗原或受体部位.利用射

线对肿瘤的放射生物效应而达到治疗肿瘤的目的.

"I—Herceptin治疗晚期转移性乳腺癌.具有以下优

点:

①目前碘标记蛋白质技术成熟.Herceptin经"I

标记后,其免疫反应活性仍然很高.因此."-I—

Herceptin作为一种放射免疫靶向治疗药物.既可

保留Herceptin本身所固有的抗肿瘤活性.又可发

挥"I的内照射产生的放射生物学效应:

②已有研

446范义湘,等.干扰素一对乳腺癌细胞Her2/neu表达及I-Herceptin抑制肿瘤细胞增殖的影响

究表明[,Herceptin与乳腺癌细胞表面的Her一2受

体结合以后,通过下调Her一2受体水平,引起蛋白

激酶Akt及有丝分裂活化蛋白激酶MAPK磷酸化

作用降低,减少细胞受照射后修复水平的蛋白质合

成.从而提高肿瘤细胞的放射敏感性.即Herceptin

可提高I对肿瘤细胞的放射生物效应;③由于受

抗体渗透性的影响以及肿瘤异质性影响,同一瘤体

不同部位摄取抗体量不一样而产生"治疗逃逸"现

象.而"tI发射的B射线在组织内的有效射程最大

可达2.2mm.其有效射程可以覆盖因Herceptin结

合量不够而产生的盲区.肿瘤靶位抗原是分子靶

向药物结合定位的物质基础,它在肿瘤细胞上的密

度与肿瘤摄取靶向药物密切相关,其表达量越高,

肿瘤的摄取量越大[s-.

在本实验条件下,IFN一诱导3种乳腺癌细胞

Her2/neu的表达.在Her2/neu低表达的MCF一7细

胞,其表达率明显提高,而在Her2/neu高表达的细

胞系如SKBR一3,BT一474,表达率虽无明显增高,但

3种细胞的MFI均明显提高.说明肿瘤细胞表达

Her2/neu的量增加.由于Her2/neu在肿瘤细胞的

表达量增加.细胞对标记抗体的结合率均相应提

高.

实验证明[引.干扰素可使细胞内基因的转录活

性增强,mRNA水平提高,或者可进行翻译后调节,

以缩短蛋白质合成周期.从而诱导肿瘤相关抗原表

达,使肿瘤抗原数目增多,或更多肿瘤细胞表达肿

瘤抗原.在许多种细胞系和细胞类型中,包括单核

白细胞,巨噬细胞,小胶质细胞,成纤维细胞和上皮

细胞.IFN一主要激活MHC2TA基因的PIV启动

子,其诱导PIV的激活依赖于三个顺式序列.即一

个GAS元件,一个IRF结合位点和一个E盒.IFN一

与其受体相互作用,激活Jakl和Jak2激酶,引起

STAT1的磷酸化,形成二聚体并转位进细胞核内.

STAT1与上游刺激因子1（USF.1）协同作用结合到

MHC2TA基因PIV启动子的GAS/E盒上.STAT1

也能激活IRF一1的表达,STAT1和IRF一1这两个转

录因子都可以介导其它系统中IFN一诱导的基因

表达.IRF一1随即结合到PIV启动子的相应位点

上,被STAT1,USF一1和IRF一1激活的PIV启动子

导致CIITA的表达.进而激活MHCII类基因的表

达[10,11].

单细胞分离培养又称细胞克隆,适应性较大和

活力好的细胞能增殖形成细胞小群[].本研究通过

IFN一上调3种乳腺癌细胞Her2/neu的表达,由于

增加肿瘤细胞对I-Herceptin的结合,与对照组比

较细胞克隆形成能力存在显着差别,说明细胞结合

一,一I-Herceptin越多.更能有效抑制乳腺癌细胞的生

长.

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